猪脑心肌炎病毒P1和P12A3C基因重组腺病毒的构建及其在小鼠体内的免疫应答

为研制脑心肌炎病毒（EMCV）新型活载体疫苗，首先将病毒核衣壳前体多肽P1与P12A3C串联基因分别插入穿梭质粒pDC316中，构建得到了重组穿梭质粒pDC316一P1和pDC316-P12A3C。将其分别与辅助质粒pBHGloxAEl、3Cre共转染293细胞，成功包装出重组腺病毒Ad-P1和Ad-P12A3C。免疫过氧化物酶单层试验确证，重组腺病毒可表达目的蛋白。分1次和2次肌肉注射免疫小鼠，然后通过间接ELISA试验和中和试验评价其诱导的特异性体液免疫水平。结果，Ad-P1诱导的VPl特异总抗体IgG水平显著高于Ad-P12A3C，但不能检测到明显的中和抗体（〈1：8）；Ad-P12A3C能诱导产生良好的中和抗体（1：32～1：128），用1×10^8TCID50剂量EMCVBJC3株攻毒，Ad-P12A3C免疫组能获得100％的保护，而Ad-P1免疫组仅能获得部分保护。以上结果表明，Ad-P12A3C可作为良好的EMCV腺病毒活载体疫苗。

伪狂犬病毒Fa株gB、gC、gD基因的克隆与序列分析

对猪伪狂犬病病毒闽A株（Fa株）gB、gC、gD基因进行了克隆和序列测定，结果表明：gB、gC、gD基因序列全长分别为2745bp、1464bp、1215bp，编码914、487、404个氨基酸残基组成的多肽。序列分析结果显示：Fa株与其他毒株gB、gC、gD基因核苷酸序列的同源性为94.9％-99.9％，氨基酸序列的同源性为91.4％-99.9％。不同PRV毒株gB、gC、gD基因在核苷酸和氨基酸水平上高度保守。基于gB、gC、gD基因的进化树分析表明，中国分离毒株与韩国分离毒株可归为一个进化分支，而日本分离株与欧美分离株归为另一个分支。在前一个分支里，闽A株与鄂A株的亲缘关系特别近，3个基因的同源率均在99.5％以上。在gB蛋白氨基酸序列全长上中国分离株（Ea株、Fa株）比欧美分离株多了1个氨基酸，氨基酸残基的突变主要集中在第50-100氨基酸。在gC基因序列第186-211bp，Ea株、Fa株比欧美分离株多插入了21个碱基。在gD蛋白氨基酸序列全长上，Ea株、Fa株比其他分离株多了2-6个氨基酸。在gD基因序列第803-837bp，Fa株核苷酸AGGCCC串联重复最多，达到7个。

猪瘟病毒E0蛋白的原核表达及其间接ELISA方法的建立

表达猪瘟病毒保护性抗原E0蛋白用以建立猪瘟抗体诊断方法,在标记疫苗(Marker vaccine)的研制和应用上具有重要的血清学鉴别功能,对于监测猪瘟病毒的流行情况和疫苗免疫情况及制定免疫程序具有重要作用。将猪瘟兔化弱毒株(HCLV)E0 基因分别插入原核表达质粒pGEX4T, pET30, pMAL p2X 中,并分别以BL21 和BL21 codonplus(DE3) RP, BL21(DE3)和BL21 codonplus(DE3) RP,TB1 和BL21 codonplus(DE3) RP为表达菌株。通过摸索IPTG诱导浓度,诱导温度,菌体收获时间,确定E0 基因能在pGEX4T/ BL21 codonplus(DE3) RP和pMAL p2X/ BL21 codonplus(DE3) RP中获得高效表达,表达产量分别占菌体总蛋白的15%和30%,表达的重组蛋白主要为包涵体形式。分别采用B per试剂和超声波裂解配以曲通尿素对包涵体进行洗涤两种方法在pGEX表达系中取得了较好的效果。使用分步透析法对变性的包涵体进行复性,将复性蛋白过GST亲和层析柱得到纯化的GST E0融合蛋白。以GST E0融合蛋白为诊断抗原,通过摸索抗原包被浓度,抗体血清稀释倍数初步建立了用间接ELISA检测猪瘟血清E0抗体的方法,为进一步开发猪瘟抗体检测试剂盒奠定基础。

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板，采用RT—PCR法分别扩增出GP2a／GP2b-3，GP3，GP4、GP5和M蛋白基因片段，双酶切后插入穿梭质粒pDC316。利用AdMax^TM法，将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞，得到重组腺病毒Ad—GP2a／GP2b-3、Ad—GP3、Ad—GP4、Ad—GP5和Ad-M。重组腺病毒滴度为10^7.7～10^9.0 TCID50·mL^-1，而以Ad—GP5滴度最低，仅为10^7.7 TCID50·mL^-1。PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性，确证重组病毒均能稳定携带目的基因。对目的基因转录的RT—PCR鉴定结果显示，重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA。表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得，为进一步研制PRRSV基因工程疫苗，解析主要囊膜蛋白功能奠定基础。

用重组腺病毒免疫方法制备伪狂犬病病毒gC蛋白单克隆抗体

将表达伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）gC基因的重组腺病毒经肌肉免疫BALB/c小鼠,测试了重组腺病毒免疫小鼠制备抗目的蛋白单克隆抗体的效果。ELISA分析表明,BALB/c小鼠接种重组腺病毒后能产生针对gC蛋白的特异性抗体。给BALB/c小鼠用大肠杆菌表达的gC融合蛋白MBP-gC-NC加强免疫后第3 d,取小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG4000作用下进行杂交融合,经筛选、克隆,获得了3株稳定分泌抗PRV gC蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1B4、1H4和2C8。单抗特性分析结果表明,1B4、2C8属IgG2a亚类,1H4属IgG1亚类;腹水抗体的ELISA效价为1∶2×10^5～1∶2×10^6;3株单抗都具有间接免疫荧光试验（IFA）和免疫印迹试验（Western-blotting）反应特性,能够特异地识别PRV gC蛋白。证实重组腺病毒免疫可用于制备目的蛋白单克隆抗体,为制备单抗提供了一种新的方法。

莎氏手术治疗先天性髋关节脱位41例报告

采用莎氏手术治疗先天性髋关节脱位41例,经随访,无1例发生再脱位及股骨头无菌性坏死,功能评定:优良率占82％。本文介绍了手术操作、注意事项、改进和生物力学原理。

构建表达猪瘟病毒E0基因的重组杆状病毒

为了得到可溶性重组猪瘟病毒E0蛋白并便于观察重组蛋白的表达情况，将增强型水母绿色荧光蛋白基因（EGFP）与E0基因相连插入昆虫杆状病毒转移载体中，与线性杆状病毒DNA共转染Sf9细胞后通过噬斑纯化得到纯的重组杆状病毒，将其感染Sf9细胞制备P1种子液，同时用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，剔除表达效果差的重组杆状病毒。再用P1种子液感染Sf9细胞制备高效价的P2种子液。通过病毒液的梯度稀释和噬斑测定，确定P2种子液的病毒滴度达1．14×10^7pfu／mL。将P2种子液以MOI5～10接种指数期SD细胞．3d后呈现出最强的荧光。重组杆状病毒在Sf9细胞中的初步成功表达为进一步制各重组E0糖蛋白．研究E0蛋白的结构与功能、免疫诊断新方法和猪瘟基因工程疫苗奠定基础。

医学专业学位研究生教育的思考

从世界研究生教育发展趋势和我国研究生教育发展的现实出发,专业学位研究生教育是今后一个时期国家大力扶持和积极引导的发展重点。相对于医学专业学位研究生而言,其培养教育的好坏,直接关系到我国未来临床医疗人才队伍素质和层次的高低,必须重视对医学专业学位研究生的临床技能、医德、临床思维、科研能力等方面的教育。

套筒灌浆搭接及对接接头高应力反复拉压试验

为比较套筒灌浆搭接及对接接头间力学性能差异,进行了41个搭接接头和20个对接接头的单拉及高应力反复拉压试验。结果表明:单拉及高应力反复拉压时,两种接头均能实现最大力下总伸长率大于6%、延性系数大于4,强度基本满足规范要求;高应力反复拉压后单拉时,两种接头承载力均有所提高,但接头初始刚度和延性下降;防偏转措施可减少搭接接头残余变形,但其约束刚度有限,搭接接头残余变形略大于对接接头,防偏转搭接接头及对接接头残余变形基本满足规范要求;高应力反复拉压后单拉时,搭接接头套筒中部截面在加载前期纵向受拉、环向受压,加载后期纵向受压、环向受拉,对接接头套筒加载过程中均为纵向受拉、环向受压;高应力反复拉压结束后单拉时,防偏转、不防偏转搭接接头套筒中部截面近钢筋侧最大纵向拉应变分别为对接接头的0.10~0.39倍、0.13~0.18倍,最大环向压应变分别为对接接头的0.09~0.49倍、0.02~0.32倍,搭接接头对套筒材性要求较低;钢筋直径相同时搭接接头材料成本较对接接头降低约35%。

猪瘟病毒E0基因在CHO细胞中的表达

将EGFPE0融合基因插入哺乳动物细胞表达载体pCI-dhfr中,构建重组质粒pCI-EGFPE0。将重组质粒转染CHO(dhfr-),在荧光显微镜下观察到少数细胞呈现绿色荧光,表明转染成功。通过MTX加压筛选后,在荧光显微镜下观察到多数细胞呈现强绿色荧光,表明重组融合蛋白EGFPE0在CHO细胞中得到大量表达。高效表达重组融合蛋白细胞克隆的获得为进一步大量制备可溶性的猪瘟病毒E0糖蛋白、制备其单抗筛选抗原表位及研究E0蛋白的生物学功能奠定基础。

小儿严重移位的肱骨外髁骨折治疗探讨

治疗55例小儿严重外髁骨折,其中38例平均得到3年的随访。认为,双克氏针固定具有对骨骺无损伤,消除骨折片旋转因素,固定确实,术后取钉方便等优点。根据术中残留2mm 以下移位对预后无影响的结果,提出2mm 以下移位可作保守治疗,并对肘内翻和骨折片缺血坏死成因作了探讨。

套筒灌浆搭接连接的开洞剪力墙抗震试验

剪力墙是高层建筑结构重要的抗侧力构件.为研究纵筋套筒灌浆搭接接头(简称APC接头)连接的全预制开洞墙可靠性,进行了1片现浇墙和2片竖向钢筋采用Ⅰ型、Ⅱ型APC接头连接的预制不等肢开洞墙拟静力试验,研究了试件的破坏形式、滞回性能、特征荷载、变形、钢筋和套筒应变及结合面抗剪性能等.结果表明:各试件的裂缝发展情况基本相同,墙肢和连梁发生弯剪破坏;现浇墙破坏起始于两墙肢根部,而预制墙套筒上方混凝土先被压碎,各试件墙肢外侧破坏情况较内侧严重;套筒顶部截面为破坏时薄弱面,套筒上方钢筋易压屈,构件设计时箍筋应加强;预制墙的开裂荷载、墙肢屈服荷载和刚度略高于现浇墙,峰值荷载和强度退化系数与现浇墙相当,预制墙延性略差;同一加载级下,各试件耗能能力相当;预制墙灌浆结合面表现出较好的抗剪性能,两种接头在预制墙中均能有效传递钢筋应力.采用APC接头连接的预制开洞剪力墙基本实现“等同现浇”.

后插入钢筋位置等对Ⅱ型APC接头拉伸性能影响

为探究后插入钢筋位置等对Ⅱ型套筒灌浆搭接接头(简称APC接头)受力性能的影响,对36个接头进行单向拉伸试验,分析试件破坏形式、极限承载力、延性与套筒应变等,并利用ABAQUS进行数值模拟。结果表明:防偏转措施有效提高试件的极限承载力和初始刚度;接头承载力和延性主要受3种因素影响,即钢筋间距、后插入钢筋偏心程度及是否紧贴套筒布置;后插入钢筋布置于套筒中部,钢筋间距大,套筒长边约束弱,接头承载力和延性降低;后插入钢筋偏心布置,易产生弯曲变形,接头承载力和延性降低;后插入钢筋紧贴套筒布置易产生灌浆缺陷,接头承载力和延性降低;两钢筋紧贴对称布置于长轴时,接头承载力和延性最大;极限荷载时,套筒短边侧纵向应变为拉应变,但存在受压趋势,套筒长边侧纵向应变为压应变;套筒长边侧环向应变绝对值基本大于短边侧,小于套筒屈服应变。模拟试件的破坏形态、极限承载力等与试验结果吻合较好,验证了模型的可靠性。钢筋位置不同时,极限荷载最小值约为最大值的80%。

鳗源嗜水气单胞菌β-溶血素基因的克隆及表达

应用PCR技术,从1株鳗源嗜水气单胞菌ML316中扩增得到β 溶血素基因AHL316HEM,将AHL316HEM克隆到pGEM TEasyVector,经分析验证后重组到pcDNA3.0中,构建了重组质粒PDLH。转化重组质粒PDLH的大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α能在血琼脂培养皿中形成明显的β 溶血斑,重组菌纯化的胞外产物溶血价为1.28×104HU·mg-1,同时重组菌的胞外产物能被原始菌株的高免血清特异性地识别。结果证实,克隆到鳗源嗜水气单胞菌β 溶血素基因,重组质粒PDLH能够表达具有天然生物学活性的β 溶血素,为构建嗜水气单胞菌核酸疫苗奠定了基础。

欧鳗嗜水气单胞菌的分离、鉴定和特性分析

20 0 0年夏季福建地区许多鳗场养殖的欧洲鳗暴发以脱粘、败血为主要症状的疫病 ,从不同来源的濒死鳗鱼体内分离到 4株细菌。细菌的形态学、生化分析和补充试验结果符合嗜水气单胞菌的各项指标 ,PCR检测 4株分离菌均扩增出特异性的气溶素基因 (aer A) 2 0 9bp片段及脂酶基因 (L ip) 76 0 bp片段 ,进一步证实这些分离菌为嗜水气单胞菌并存在毒力基因。人工造病实验结果表明 ,分离株 M0 0 0 812 0 5 1的菌体纯培养物和胞外产物对昆明小白鼠和欧洲鳗分别具有中等和高度的致病力 。

猪瘟病毒流行株与疫苗株E^(rns)基因的序列分析

采用RT-PCR技术扩增了HCV 10个野毒株、4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗株和1个标准SM株Erns基因的cDNA片段并对其进行了序列测定。应用DNAstar序列分析软件对所测的15个HCV毒株与国内外6个参考毒株Alfort、Ald、Brescia、Gpe、C、CW株的相应片段进行了同源性比较分析。15株HCV Erns基因长度均为696 bp,其核苷酸及氨基酸的同源性分别为83.0%~100.0%和87.9%~100.0%。系统发生分析可将这些毒株分为Ⅰ和Ⅱ两大基因群及4个亚群,Erns基因与E2、NS5B基因在系统发生分析中具有较高的一致性。国内4批不同厂家生产的兔化弱毒疫苗相对稳定,仅1~2个氨基酸残基具有差异。通过对10个流行株与SM株Erns基因的比较分析,发现我国HCV具有复杂性、多样性和相对的遗传稳定性;所测15株HCV Erns基因具有RNase活性的2个区域SLHGIWPG(或E)(28~36位)和EWNKHGWC(75~82位)十分保守,但疫苗毒SLHGIWPE基序中的E替换为G,而基序中位于30和79位的H(组氨酸)为RNase的催化活性关键氨基酸残基,高度保守,15个HCV Erns基因和6株参考株没有一株发生变异。本研究为开展Erns基因的生物学活性、结构与功能等方面的研究奠定了基础。

DC-CIK细胞联合全身静脉化疗治疗晚期结直肠癌伴弥漫性肝转移临床疗效分析

目的:探讨细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells,CIK)与同源树突状细胞(dendritic cells,DC)共培养后DC-CIK细胞联合全身静脉化疗对晚期结直肠癌伴弥漫性肝转移的临床疗效。方法:选取我科2008年1月至2010年12月的18例晚期结直肠癌伴弥漫性肝转移患者,分为FOLFOX组(F组)和DC+CIK+FOLFOX组(DCF组),每组9例,F组采用FOLFOX方案进行静脉化疗,而DCF组采用DC-CIK治疗方案联合FOLFOX方案进行治疗。结果:F组9例患者中完全缓解(complete remission,CR)0例,部分缓解(partial remission,PR)2例,总的客观缓解率(objective response rate,OR)为28.6%;DCF组中CR 2例,PR 5例,有效治疗率为87.5%,高于F组(P<0.05);2组临床受益率(clinical benefit rate,CBR)判定结果无明显差异。在免疫学指标检测中,DCF组治疗前后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值相比较显著提高,差异具有统计学意义(P<0.05),而F组无明显变化。消化道肿瘤标志物检测发现F组在治疗过程中变化不明显,治疗结束后明显升高,而DCF组治疗过程中缓慢下降,治疗结束呈稳定状态;2年生存率F组为0,而DCF组为33.3%,高于F组(P<0.05)。结论:DC-CIK细胞治疗方案联合FOLFOX方案进行治疗晚期结直肠癌伴弥漫性肝转移能够显著延长患者生存时间,值得临床推广和应用。

幽门成形在近端胃大部分切除术后的临床意义

目的探讨幽门成形在贲门胃底部占位性病变行近端胃大部分切除术后的临床效果。方法对2010~2013年重庆医科大学附属第二医院胃肠外科收治的贲门胃底病变患者100例进行前瞻性随机对照试验研究,按照排除标准排除6例,其余94例患者分组,对照组（B组）40例单纯行近端胃大部分切除,试验组（A组）54例患者附加幽门成形,两组均无失访病例。观察比较两组术后住院期间临床观察指标、远期并发症及术后3个月时复查胃镜提示幽门狭窄及反流性食管炎情况。结果两组患者住院期间胃瘫发生率差异无统计学意义（P〉0.05）,其余住院期间各观察指标及远期并发症发生率差异有统计学意义（P〈0.05）。结论近端胃大部分切除附加幽门成形可减少胃潴留及反流性食管炎的发生,减少住院时间,有利于患者术后恢复,适合临床推广应用。