AllType NGS11位点测序试剂在HLA-DPB1基因分型中的模棱两可结果分析

目的 统计分析AllType NGS 11位点测序试剂在Ion Torrent S5和Illumina Miseq 2种二代测序平台对HLA-DPB1基因进行分型检测时的模棱两可结果情况。方法 采用One Lambda公司AllType NGS 11位点测序试剂盒检测434个患者或供者标本的HLA-DPB1基因,其中在Ion Torrent S5测序平台上检测了336个标本,在Illumina Miseq测序平台上检测了98个标本;并同步对434份标本采用PCR-SSO流式磁珠法复核HLA-DPB1基因。对HLA-DPB1*13∶01∶01/107∶01模棱两可等位基因,采用Sanger测序法检测区分。使用TypeStream Visual专业软件指定NGS法的HLA-DPB1基因分型结果,直接计数法统计分析模棱两可组合比例。结果 NGS法以HLA-DPB1命名*后第3区域数字作为高分辨结果进行统计,434个标本中共有357个标本出现模棱两可结果,占82.3%(357/434);其中Ion Torrent S5测序平台336个标本有275个标本存在模棱两可结果,占81.8%(275/336),表现出45种类型;Illumina Miseq测序平台98个标本有82个标本存在模棱两可结果,占83.7%(82/98),表现出27种类型。所有标本HLA-DPB1基因经PCR-SSO法复核,未发现NGS法漏检HLA-DPB1等位基因情况。Sanger测序法检测区分41个标本,共43个HLA-DPB1*13∶01∶01/107∶01模棱两可的等位基因,发现HLA-DPB1*13∶01∶01等位基因为25个,占58.1%(25/43);HLA-DPB1*107∶01等位基因为18个,占41.9%(18/43)。结论 应用AllType NGS 11位点测序试剂仍有较高比例的HLA-DPB1基因模棱两可组合结果。利用Sanger测序法分析HLA-DPB1基因1号外显子可区分解决部分HLA-DPB1*13∶01∶01/107∶01模棱两可等位基因。

HLA-B和-DRB1、HLA-DQB1和-DPB1座位基因重组的分析

目的:探讨2个家系人类白细胞抗原(HLA)座位的重组情况。方法:采集家系成员的外周血,提取基因组DNA,采用聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针技术(PCR-SSO)和二代测序技术检测HLA-A、-B、-C、-DRB1、-DQB1和-DPB1座位,通过家系遗传分析确定个体HLA单体型。结果:家系1中单体型HLA-A*11:01~C*03:04~B*13:01~DRB1*12:02~DQB1*03:01~DPB1*05:01:01G与HLA-A*03:01~C*04:01~B*35:03~DRB1*12:01~DQB1*03:01~DPB1*04:01:01G在HLA-B和HLA-DRB1座位间进行了交换,形成HLA-A*11:01~C*03:04~B*13:01~DRB1*12:01~DQB1*03:01~DPB1*04:01:01G。家系2中单体型HLA-A*02:06~C*03:03~B*35:01~DRB1*08:02~DQB1*04:02~DPB1*13:01:01G与HLA-A*11:01~C*07:02~B*38:02~DRB1*15:02~DQB1*05:01~DPB1*05:01:01G在HLA-DQB1和HLA-DPB1座位间进行了交换,形成HLA-A*02:06~C*03:03~B*35:01~DRB1*08:02~DQB1*04:02~DPB1*05:01:01G。结论:2个中国汉族人群家系分别发生了HLA-B和-DRB1、HLA-DQB1和-DPB1座位间的基因重组。

HLA-A新等位基因HLA-A 110106的核苷酸序列分析

目的研究HLA新的等位基因HLA-A* 110106的分子机制。方法采用商用DNA试剂盒抽提样本基因组DNA,利用HLA-A组特异性引物PCR扩增先证者HLA-A基因的第2、3外显子,经酶法纯化扩增产物后,用第2、3外显子双向测序引物进行测序分析。结果先证者有2个HLA-A等位基因,其中1个为HLA-A*0203,另1个HLA-A等位基因经HLA b last验证为新的等位基因,新的等位基因序列已递交Genbank(EF092416)。与最接近的HLA-A*110101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第3外显子上有1个核苷酸不同,即第387位G→C,但未引起氨基酸的改变。结论该等位基因为新的HLA-A等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*110106。

HLA—B新等位基因B＊51：02：03的确认和分析

人类白细胞抗原系统（HLA）在造血干细胞和器官移植中具有重要意义，供受者HLA相合程度与移植后移植物抗宿主病（GVHD）的发生率以及移植物的存活率等密切相关，目前已有多个国家建立造血干细胞捐献者资料库，作为临床患者造血干细胞移植的供者来源。笔者近期在常规的造血干细胞捐献者标本分型中，

人类白细胞抗原HLA-A/C和HLA-B/DR座位基因重组家系分析

目的探讨2个家系人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)A/C和B/DR座位的重组情况。方法采集2个家系成员外周血标本,抽提DNA,对其HLA-A,-C,-B,-DRB1,-DQB1位点进行PCR-SSP基因分型和SBT分析,然后通过家系遗传分析确定HLA基因重组相关位点,检测短串联重复序列位点确定其家系成员亲权关系。结果家系1:父亲的1条HLA单体型A*24∶02-C*04∶01-B*15∶27-DRB1*04∶06-DQB1*03∶02保持连锁特性遗传给子女。而母亲的1条HLA单体型遗传给子女时,当母源单体型为A*11∶01-C*14∶02-B*51∶01-DRB1*04∶05-DQB1*04∶01,则遗传给女儿的单体型存在HLA-A和HLA-C座位重组;

MICB基因的克隆及其在原核系统中的表达

目的将中国汉族人群中不同分布频率的MICB基因克隆到原核表达系统,表达MICB蛋白并对蛋白进行鉴定和纯化,为体外建立MICB抗体检测方法和研究MICB等位基因功能奠定基础。方法收集外周血标本测序分析MICB基因2～4号外显子,获取不同分布频率的基因型,分别将分布频率】50%的MICB*005等位基因,分布频率为10%左右的MICB*00201、MICB*00401的等位基因,和分布频率【1%的MICB*018等位基因的外周血标本提取总RNA,经RT-PCR获取此4个等位基因的cDNA。扩增此4个MICBcDNA2～4号外显子,将目的片段连接至TOPO克隆载体,提取质粒测序分析,

PCR-SBT检测HLA-C座位1-7外显子序列鉴别HLA-C＊07：01：01G和C＊07：02：01G组等位基因

本研究旨在探讨区分人类白细胞抗原(HLA)-C*07:01:01G和HLA-C*07:02:01G组内等位基因,并分析其与HLA-B的连锁情况。通过收集HLA-C*07:01:01G组和HLA-C*07:02:01G组标本,采用聚合酶链反应测序分析方法(PCR-SBT)检测HLA-C座位第1-7外显子编码序列,并采用PCR-SBT方法对标本进行HLA-B基因分型。结果表明,13例HLA-C*07:01:01G组标本中,4例(30.8%)标本为HLA-C*07:01:01,9例(69.2%)标本为HLA-C*07:06;连锁分析显示,HLA-C*07:06与HLA-B*44:03高度连锁。102例HLA-C*07:02:01G组标本全部为HLA-C*07:02:01;连锁分析显示,HLA-C*07:02:01与HLA-B*51:01、B*46:01、B*39:01、B*40:01、B*38:02、B*15:02高度连锁。结论:HLA-C*07:01:01G组中发现存在HLA-C*07:01:01和HLA-C*07:06,而HLA-C*07:02:01G组中以HLA-C*07:02:01为主导。

人类白细胞抗原HLA-C＊04：01：01G组的区分鉴别

本研究旨在区分人类白细胞抗原(HLA)-C*04:01:01G组内等位基因,并分析其与HLA-A、-B的连锁情况。通过收集HLA-C*04:01:01G组标本,采用多聚酶链反应序列分型法(PCR-SBT)分析HLA-C座位第2-7外显子序列,采用PCR-SBT方法对HLA-A、-B、-DRB1和-DQB1基因进行分型。结果表明:在189例HLA-C*04:01:01G组标本中,178例(94.2%)为HLA-C*04:01,11例(5.8%)为C*04:82;共检出HLA-C*04:01:01和C*04:82相关单体型72条,频率大于0.0050的单体型为26条;连锁分析显示HLA-C*04:01:01与A*02:03,A*02:07,A*11:01,A*33:03,B*13:01,B*15:01,B*15:05,B*15:27,B*40:01,B*54:01关联,而HLA-C*04:82与B*40:01关联。结论:HLA-C*04:01:01G组中存在HLA-C*04:01:01和HLA-C*04:82,在常规分型指定中应加以鉴别。

首例HLA-B新等位基因HLA-B＊15：124的核苷酸序列分析

本研究探讨人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因HLA-B*15:124的核苷酸序列及其分子机制。采用商用试剂盒抽提标本基因组DNA,利用HLA-B组特异性引物PCR扩增先证者HLA-B基因的第2,3和4外显子,经酶法纯化扩增产物后进行第2,3和4外显子双向测序分析。结果表明:先证者标本组特异性引物扩增测序得到2个等位基因,其中1个等位基因为B*40:03,另1个为新发现的等位基因,与最接近的B*15:52等位基因序列相比,新的等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同,第499位A→T和第512位G→T,这导致氨基酸第143位Thr→Ser和第147位Trp→Leu。结论:新的等位基因在第3外显子上有2个核苷酸不同。该等位基因序列已递交GenBank(EF187276),并作为1个首次发现的HLA-B位点的等位基因,已经被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-B*15:124。

KIR2DL1基因多态性及其抗原表达关系的研究

目的本研究拟建立KIR2DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR2DL1基因分布和抗原表达情况。方法收集166份新鲜外周血标本,分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56,和KIR2DL1特异性的CD158a抗体流式检测KIR2DL1抗原表达情况。提取标本的基因组,利用PCR-SSP技术检测KIR2DL1基因的有无,对于KIR2DL1基因阳性标本设计3对引物扩增1～9号外显子,并进行全长测序分析。结果1)166份标本中,164份标本KIR2DL1阳性,其中62份标本KIR2DL1和KIR2DS1双阳性,仅2份标本KIR2DS1单阳性。

KIR3DL1基因多态性及抗原表达关系的研究

目的杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immuno-globulin-like receptors,KIR)可与靶细胞表面的HLA分子结合,调节NK细胞和T细胞的活性。本研究拟建立KIR3DL1基因分型和抗原分型技术,了解中国汉族人群KIR3DL1基因分布和抗原表达情况,为今后器官移植选择合适供者提供KIR相关的参考依据。方法收集新鲜外周血155份,采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,利用NK细胞特异性的CD56和KIR3DL1特异性的NKB1抗体流式检测KIR3DL1抗原表达情况。采用商品化试剂提取155份标本的基因组DNA,利用PCR-SSP方法检测KIR3DL1阳性标本,

儿科凝固酶阴性葡萄球菌体外耐药性和生物膜产物的监测与分析

目的通过了解儿科感染血浆凝固酶阴性葡萄球菌(coagulase negative staphylococci,CNS)体外药敏及生物膜产物等情况,为临床治疗CNS感染的合理应用抗菌药物提供依据。方法应用VITEK32全自动微生物分析仪和配套GPI、GPS卡对临床分离的142株CNS进行细菌鉴定、药敏试验。用刚果红平板法检测生物膜产物。结果142株CNS中,MRCNS有124株(87.32%),β-内酰胺酶阳性率为95.07%,生物膜产物阳性率为5.63%。MRCNS对阿莫西林/棒酸、氨苄西林/舒巴坦、青霉素G、头孢唑啉为高度耐药(】99%);红霉素耐药率为86.29%;对庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明、克林霉素和四环素的耐药率较低(47.58-30.56%);对莫西沙星、左旋氧氟沙星和利福平的耐药率极低(8.87-1.14%);未发现耐呋喃妥因、万古霉素和力奈唑烷菌株。MRCNS对阿莫西林/棒酸、氨苄西林/舒巴坦、青霉素G、头孢唑啉、庆大霉素和红霉素耐药率显著高于MSCNS(P【0.05)。结论儿科临床分离的CNS以MRCNS为主,而MRCNS往往呈多重耐药。CNS生物膜产物检出率很低,儿科临床CNS检测生物膜产物的意义不大。

新等位基因 HLA- DPB1*02:01:69的序列分析和确认

目的探讨1名受试者的HLA-DPB1新等位基因序列。方法选取来源于2022年5月入浙江省血液中心血小板配合性输注的献血者资料库的1名献血者的血液样本,应用Ion Torrent S5平台的二代测序(NGS)技术对该献血者标本进行HLA基因分型,并采用Illumina Miseq平台的NGS技术、Nanopore平台的三代测序(TGS)技术对标本HLA-DPB1位点进行分型验证。本研究通过浙江省血液中心医学伦理委员会的审查(伦理号:2021-001)。结果基于Ion Torrent S5的NGS分型结果,提示标本存在HLA-DPB1*02新等位基因,最接近的基因型为HLA-DPB1*02:new,17:01:01G,变异位于第3外显子。而基于Illumina Miseq的NGS分型结果,提示存在HLA-DPB1*17新等位基因,最接近的基因型为HLA-DPB1*02:01:02G,17:new。TGS技术的结果显示,标本存在一个HLA-DPB1*17:01:01:01等位基因,另一个为HLA-DPB1*02新等位基因。与HLA-DPB1*02:01:02:01相比,新等位基因在第3外显子c.369G>A变异,但不引起氨基酸改变。结论1个HLA-DPB1新等位基因通过NGS与TGS发现并验证,该新等位基因被HLA系统因子命名委员会命名为HLA-DPB1*02:01:69。

人类白细胞抗原HLA-A/C和HLA-B/DRB1座位基因重组分析

目的探讨2个汉族家系人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-A/C和B/DRB1座位的重组情况。方法采集2个家系成员外周血标本抽提基因组DNA,应用聚合酶链反应-序列特异寡核苷酸探针技术(PCR-SSO)和聚合酶链反应-测序分型方法(PCR-SBT)检测HLA-A,-C,-B,-DRB1,-DQB1座位,家系遗传分析确定个体HLA单体型,通过检测短串联重复序列位点确定家系成员亲权关系。结果家系1:HLA单体型重组发生在HLA-A/C座位间,家系调查显示为母源HLA单体型交换后遗传给子代;家系2:HLA单体型重组发生在HLA-B/DRB1座位间,家系调查显示为父源HLA单体型发生交换后遗传给子代。短串联重复序列结果证实2个家系成员内具有高度的亲权关系。结论发现HLA-A/C和HLA-B/DRB1座位重组家系各1例,为深入研究HLA重组机制提供了基础。

人类白细胞抗原A和C座位基因重组二个家系分析

目的探讨2个家系人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）座位的重组情况。方法采用聚合酶链反应一序列特异寡核苷酸探针技术检测2个家系成员HLA—A、-C、-B、-DRB1和-DQB1位点，应用测序分型方法进行HLA高分辨基因分型，然后通过家系遗传分析确定HLA基因重组相关位点，检测短串联重复序列位点确定其家系成员亲权关系。结果2个家系HLA单倍型的重组发生在HLA—A和C位点之间，家系调查显示1例为父源、1例为母源HLA单倍型发生了交换后遗传给子代，短串联重复序列结果证实2个家系成员内具有高度的亲权关系。结论发现了2个中国汉族人群HLA—A和C基因座位间的基因重组家系，为深入研究HLA的重组机制提供了基础。

HLA-A新等位基因HLA-A＊2468的核苷酸序列分析

人类白细胞抗原（HLA）系统是目前所知最为复杂的人类遗传多态性系统，其复合体定位于6号染色体的短臂上，包括多个基因座位，每一个座位上有多个等位基因，目前发现的HLA等位基因已超过2799个^[1]。随着HLA分型技术的不断发展以及HLA研究的深入，新的等位基因被陆续发现^[2]。

用等位基因组特异性引物扩增技术确认HLA-B新等位基因B＊15：129

目的对人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，H1，A）新等位基因HLAB＊15：129的第2～4外显子序列进行分析。方法采用商用抽提试剂盒抽提标本DNA，应用等位基因组特异性引物PCR方法扩增先证者标本HLAB基因第2～4外显子，PCR产物经酶切纯化后直接进行HLA-B基因第2～4外显子双向测序分析。结果先证者标本存在2个HLAB等位基因，1个等位基因为B＊07：02，另1个经Blast验证为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（EF473219），经世界卫生组织HI，A命名委员会正式命名为HLA—B＊15：129。HLAB＊15：129第2～4外显子序列与最接近的B＊15：01：01：01相比，第3外显子存在3个碱基的不同，即第362位G→A、363位G→T、369位C→T改变，导致第97位氨基酸Arg→Asn。结论发现1例新的HLA—B等位基因，被世界卫生组织HLA基因命名委员会正式命名为HLA—B＊15：129。

HLA-B新等位基因B＊9536和B＊4612的测序分析和确认

目的研究人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen，HLA）新等位基因HLA-B＊9536和B＊4612的分子机制。方法采用Invitrogen抽提试剂盒抽提标本DNA，利用单链特异性引物PCR方法扩增样本HL-B基因第2～4外显子，对PCR产物直接进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析。结果先证者标本存在2个HLA-B等位基因，经HLABlast验证均为新的等位基因，新的等位基因序列已递交GenBank（EU081878和EU081879），经世界卫生组织HLA命名委员会正式命名为HLA_B＊9536和HLA-B＊4612。HLA-B＊9536第2～4外显子序列与最接近的B＊1505相比，在第3外显子存在一个碱基的不同，即第544位G—A改变，导致第158位氨基酸Ala—Thr；HLA-B＊4612第2～4外显子序列与最接近的B＊4601相比，在第3外显子存在一个碱基的不同，即第363位G→C导致第97位氨基酸Arg—Set。结论在同一标本中发现两个新的HLA-B等位基因，并被世界卫生组织HLA命名委员会正式命名。

新的HLA-B等位基因B＊5522的测序分析

人类白细胞抗原（HLA）在造血干细胞移植和器官移植中发挥重要作用。HLA系统是目前所知最具多态性的系统，现已命名的HLA等位基因超过2941个，并且仍不断在发现新的等位基因。本文在检测造血干细胞捐献者样本中发现一例新的HLA—B等位基因，已被世界卫生组织（WHO）HLA命名委员会于2006年4月正式命名为HLA—B＊5522，现将结果报告如下。