三角帆蚌CypA基因的克隆及其在嗜水气单胞菌感染后的表达分析

为研究亲环蛋白A(Cyclophilin A,CypA)在三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)免疫系统中的作用,研究利用PCR与RACE技术克隆获得三角帆蚌CypA基因全长cDNA序列(基因序列登录号:MN121742)。三角帆蚌CypA基因cDNA序列全长1237 bp,其5′非编码区(UTR)长度为57 bp,3′非编码区长度为688 bp,三角帆蚌CypA基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长度为492 bp,编码164个氨基酸,CypA蛋白质理论等电点为8.9,相对分子量为17.29 kD。在GenBank中进行同源序列检索,三角帆蚌CypA氨基酸序列与其他贝类CypA的相似性依次为池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)(99.39%)、青蛤(Cyclina sinensis)(77.44%)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)(78.05%)、近江牡蛎(Crassostrea ariakensis)(78.66%)和大竹蛏(Solen grandis)(75.05%)。通过SWISS-MODEL预测三角帆蚌CypA含有8个β折叠和2个α螺旋,可能形成CypA的活性中心区域。利用MEGA 5.1软件将三角帆蚌CypA与其他物种CypA基因进行序列比对并构建系统进化树,分析发现三角帆蚌CypA与池蝶蚌的CypA聚为一支,其与池蝶蚌CypA具有最近的亲源关系。通过qRT-PCR检测CypA基因在三角帆蚌不同组织中表达,发现三角帆蚌性腺中CypA基因的表达量最高,肝脏、肾和鳃中的表达量次之。对三角帆蚌浸泡感染嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),CypA基因在肝脏、性腺、肠和鳃中的表达水平在感染72h先升高后降低,其表达量在性腺和鳃中6h最高,肝脏中12h达到峰值,肠中24h达到最高值,表明三角帆蚌感染嗜水气单胞菌后,可显著诱导CypA基因的表达。CypA基因在性腺中的表达量到达峰值的时间要早于肠与肝脏,且到达峰值时的相对表达量(14.91)也显著高于肝脏(9.89)、肠(9.78)和鳃(7.53),推测CypA在三角帆蚌性腺中具有防御细菌感染的重要作用,三角帆蚌性腺可能不仅具有生殖的功能,同时在免疫防御系统中也发挥着重要的作用。

镉胁迫对团头鲂免疫系统与抗氧化系统的影响

为研究镉暴露对团头鲂免疫系统与抗氧化系统的影响,将团头鲂暴露于浓度为0(对照组)、0.05、0.10和0.50 mg/L镉水体中养殖60d,发现胆囊随镉浓度的增加而变大,在高浓度镉暴露组(0.50 mg/L Cd)胆囊颜色加深变成墨绿色,各镉暴露组团头鲂肝脏体指数与脾脏体指数均显著高于对照组,且脾脏体指数随着镉浓度的增加逐渐升高。团头鲂经0.50 mg/L镉暴露养殖60d,镉在肠中富集含量最高(240±1.41)mg/kg,其次是中肾、肝、鳃、脾、头肾、心、精巢、卵巢和脑,肌肉中镉的含量最低(0.35±0.04)mg/kg。团头鲂经0.50 mg/L镉暴露养殖60d后,与对照组比较,体色偏黄;脾脏肿大,细胞出现空泡;肝脏发黑并有出血的症状,肝窦增宽;肠绒毛长度变短,肠壁肌肉层厚度增大;鳃组织出现动脉瘤,细胞增生,鳃小片发生弯曲。血清中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和总超氧化物歧化酶(SOD)活性随着镉浓度的增加逐渐降低,溶菌酶(LYS)含量、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)及过氧化氢酶(CAT)活性在低浓度镉暴露组显著升高,在高浓度镉暴露组呈下降趋势,且LYS含量、AKP与ACP活性在高浓度镉暴露组(0.50 mg/L)显著性低于对照组。il-6、il-1β、il-10、tnf-α与c3基因在头肾、脾脏及肝脏中的表达量随着镉浓度的增加逐渐降低,肠中tnf-ɑ、c3与igm基因及鳃中c3基因的表达量均随着镉浓度的增加逐渐升高,头肾中igm基因的表达量在低浓度镉暴露组显著升高,在高浓度镉暴露组显著性降低。研究表明,低浓度镉诱导团头鲂表现出一定的毒物兴奋效应,但随着镉浓度增高,团头鲂解毒与免疫相关组织被损伤,机体抗氧化与免疫系统被抑制,镉对团头鲂的抗氧化系统与免疫系统均存在毒性。研究为进一步深入探索镉对鱼类的毒性作用机制提供了基础的实验依据。

丁鱥鱼胚胎及仔鱼发育的观察

【目的】研究丁鱥鱼在南方较高水温条件下的生长发育情况,解决丁鱥鱼在南方推广养殖中苗种欠缺的瓶颈问题。【方法】对丁鱥亲鱼进行人工繁殖,然后对其胚胎及仔鱼发育过程进行观察记录。【结果】丁鱥鱼催产效应时间11h,受精率为75.3%,孵化率为82.7%,仔鱼成活率59.3%,育成规格为1.5～2.0cm鱼苗20.0万尾。丁鱥鱼受精卵呈卵圆形,大部分呈青灰色,直径0.50～0.77mm,具粘性;在27.0～31.0℃的温度下,受精卵历时1936min发育后孵出,有效积温为908.89℃·h;胚胎发育可划分为6个阶段30个发育时期。刚孵出仔鱼全长3.84～3.87mm,出膜后第3d卵黄囊吸收60%~80%,约有30%仔鱼开口摄食;第4d卵黄囊吸收90%,约有90%仔鱼开口;出膜第5d卵黄囊基本吸收完,但出现少许死鱼苗。【结论】丁鱥鱼适宜在南方进行繁殖及鱼苗培育,水温应稳定在20.0～27.0℃,不宜超过30.0℃,在孵化及鱼苗培育过程中注意清除敌害生物及保持清新水质,并根据水温情况及时投喂开口饵料,提高仔鱼成活率。

六须鲶暴发性败血症病原菌的分离与鉴定

从患暴发性败血症的六须鲶Silurus soldatovi身上分离到致病菌株(FY-024),用常规细菌培养方法对其观察,并进行生理生化特性测试。结果表明,该致病菌均符合鲶爱德华氏菌Edwardsiella ictaluri特征。为了进一步确认该致病菌的分类地位,对其进行了16S rRNA基因序列分析、遗传距离距阵及系统发育树分析,共扩增出1 417 bp基因片段(GenBank登录号为GQ924477)。系统发育结果显示,菌株FY-024与鲶爱德华氏菌的16S rRNA基因同源性达99.6%～99.9%,聚为同一分支,进一步确认致病菌是鲶爱德华氏菌。药敏试验和毒力试验结果显示,菌株FY-024对环丙沙星、恩诺沙星药物高度敏感,按Reed和Muench氏法计算LD50=1.08×106 cfu/尾。

丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术

【目的】探讨丁鱥鱼人工繁殖及鱼苗培育技术,满足广大水产养殖户对丁鱥鱼苗的需求,为加快丁鱥鱼在广西的推广养殖奠定基础。【方法】2004年11月和2005年3月,两次引进丁鱥1龄鱼进行培育,2005年春挑选成熟鱼进行人工繁育。【结果】亲鱼经过半年强化培育,平均体重600g/尾以上,雌雄鱼性腺发育到第IV～V期;以促黄体生成素释放激素类似物(LRH-A2)和地欧酮(DOM)混合物催产,经11～13h的发情效应,均出现产卵行为;经人工孵化和鱼苗培育,第1批的人工孵化率最高,为85.0%,但由于采用池塘孵化,仔鱼遭受池塘敌害生物残食,培育失败;第2、3批的人工孵化率分别为59.3%和63.0%,采用小水泥池孵化,两批共孵化出仔鱼约93.9万尾,培育获得规格为3.0～5.0cm鱼苗64.8万尾。【结论】通过科学合理的亲鱼强化培育、药物催产、人工孵化及鱼苗培育,可以成功繁育获得丁鱥鱼苗,但繁育过程中要注意水温调控,当水温上升到20℃以上、最好稳定在23～27℃时,应及时安排生产,以利于提高丁鱥鱼苗数量和质量。

氟苯尼考单用及联用对爱德华氏菌的体外抑菌试验

为进一步了解爱德华氏菌的药物敏感性,采用肉汤稀释法测定氟苯尼考、恩诺沙星、多西环素、环丙沙星、大黄、黄连、连翘、黄芩等8种药物单用或分别与氟苯尼考联用对斑点叉尾鮰爱德华氏菌的最小抑菌浓度(MIC),并计算氟苯尼考与其他7种药物联用的抑菌浓度指数(FIC)。结果表明,8种药物体外单用对爱德华氏菌均具较强杀菌能力,其MIC依次为:氟苯尼考0.13μg/mL、环丙沙星0.03μg/mL、恩诺沙星0.25μg/mL、多西环素0.31μg/mL、黄芩13.33mg/mL、连翘20.00 mg/mL、黄连30.00 mg/mL、大黄33.33 mg/mL;药物联用时,氟苯尼考分别与多西环素、黄连联用时呈相加作用;分别与恩诺沙星、环丙沙星、大黄、连翘及黄芩联用则均呈无关作用。

创伤弧菌和哈氏弧菌双重PCR检测方法的建立及初步应用

根据创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的溶细胞毒素基因序列和哈氏弧菌(Vibrio harveyi)的toxR基因序列,分别设计并合成两对特异性引物,通过PCR反应条件优化,测试两种菌的特异性和敏感性,建立双重PCR方法,同时快速检测V.vulnificus和V.harveyi。结果表明:纯培养V.vulnificus和V.harveyi的检测灵敏度分别是12 cfu/mL和18 cfu/mL,与无乳链球菌、海豚链球菌、副溶血弧菌及美人发光杆菌无交叉反应;此PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性,具快速、高效等优点,对细菌V.vulnificus和V.harveyi诊断与防治具有较好的临床应用性。

倒刺鲃鱼种耗氧率与窒息点初探

在2个温度条件下，对2种有不同规格的倒刺鲃鱼种进行耗氧率与窒息点的测定。结果表明：耗氧率随着鱼体体重的增加而降低、而窒息点随体重的增加而增加。平均尾重3．53g的小规格倒刺鲃鱼种在水温27．312～28．3℃和30．012～31．0℃时耗氧率分别为0．3577mg／g·h和0．3199mg／g·h，窒息点分别为0．3270mg／l和0．3131mg／l；平均尾重7．62g的大规格倒刺鲃鱼种在水温27．3℃～28．3℃和30．0℃～31．0℃耗氧率分别为0．2819mg／g·h和0．3009mg/g·h，窒息点分别为0．3659mg／l和0．4784mg／l．

三个群体罗氏沼虾线粒体COI基因的遗传多样性分析

运用PCR方法,扩增罗氏沼虾缅甸原种F1代、广西选育群体和江苏养殖群体的线粒体DNA上的细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase subunit I,COI)基因,在此基础上选用10种限制性内切酶对扩增产物进行限制性片段长度多态(RFLP)分析。三个群体共发现2个多态位点,11种酶切图谱,3种基因型。三群体的多态座位比例、平均杂合度和基因型多样性指数分别为:缅甸原种F122.2%、0.0556、0.0472,广西选育群体22.2%、0.0400、0.0398,江苏养殖群体11.1%、0.0106和0.0083,群体间遗传差异未见显著。根据群体间遗传距离构建UPGMA聚类关系图,显示广西选育群体和江苏养殖群体间的遗传关系较近,而与原种F1群体的遗传关系较远。

罗氏沼虾3个群体线粒体COⅠ基因的序列差异和遗传标记研究

利用PCR方法扩增获得罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)线粒体DNA的COⅠ基因,测定该基因片段序列。分析了罗氏沼虾缅甸原种F1代、江苏养殖群体和广西选育F2代3个群体共17只个体的序列核苷酸位点差异和遗传多态。结果表明,缅甸原种F1代遗传多样性最为丰富,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传多样性相对贫乏。在长度为498 bp的基因片段中,共检测到10个多态性核苷酸位点(占2.01%),17只个体具有5种基因型,3群体各自的平均核苷酸位点差异分别为0.88%、0.07%和0。UPGMA分子系统聚类树显示,江苏养殖群体和广西选育群体的遗传关系最近,其单倍型混杂聚成一支,而缅甸原种F1群体相对独立为另外一支。COⅠ基因可以作为区分两分支群体的遗传标记。

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。

罗非鱼致病性海豚链球菌药敏及中草药提取液体外抑菌试验

采用琼脂扩散法和二倍稀释法测定了28种抗生素和10味中草药对一株罗非鱼致病性海豚链球菌（Streptococcus iniae）的抑菌作用。结果表明：28种抗菌类药物中,病原菌对头孢克洛、克拉霉素、头孢噻吩、先锋必、菌必治、头孢拉定、新生霉素、先锋Ⅴ、罗红霉素、头孢呋肟、头孢氨苄11种药物敏感,对卡那霉素、氨曲南、头孢克肟、林可霉素4种药物表现耐药性。10种中草药水提取物对海豚链球菌均有不同程度的抑菌作用,其中黄连水提物的抑菌作用最佳,其对海豚链球菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）分别为3.75mg/mL和7.50mg/mL,抑菌圈平均直径达20mm以上;金银花、黄芩、大黄、连翘、黄柏有一定的抑菌作用,MIC为7.50~15.0mg/mL,抑菌圈平均直径均在10mm以上;而大青叶、穿心莲、蒲公英、龙胆草的抑菌作用不明显或无抑菌效果。

用链球菌疫苗免疫罗非鱼前后其差异表达基因的鉴定与分析

采用抑制性差减杂交技术(SSH)成功构建了罗非鱼O reochrom is nilotica被链球菌Streptococcus iniae疫苗免疫前后正、反两个淋巴细胞cDNA差减文库,富集了免疫过程中表达谱发生变化的淋巴细胞基因,并对文库进行了斑点杂交筛选、测序和ESTs初步分析。结果表明:文库富集了高丰度的差异表达基因,阳性率较高。正向文库中筛选得到21个免疫期间表达丰度上调的基因,其中1个基因与罗非鱼已知基因具有相似性,10个基因与其他鱼类已知基因相似,1个基因与其他物种已知基因具有相似性,9个为未知新基因;负向文库中筛选得到24个免疫期间表达丰度下调的基因,其中3个与罗非鱼已知基因具有相似性,15个与其他鱼类已知基因相似,6个为未知新基因。进一步功能注解发现,正向文库功能基因包括免疫信号传导相关蛋白、防御相关蛋白、肿瘤免疫相关蛋白和淋巴细胞相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度升高,提高了机体免疫抵抗力。负向文库功能基因包括细胞免疫相关蛋白、感染相关蛋白和肿瘤发生相关蛋白,这些基因免疫后表达丰度降低,可以降低机体感染和发病几率。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。

不同类型养殖大水域主要理化因子动态变化分析

【目的】了解邕江(河流养殖水域)和西津水库莲塘库区(半封闭、微流水养殖水域)的水质情况,为合理利用开发大水域养殖提供理论依据。【方法】2009年9月～2010年9月,定期定点采集邕江和西津水库莲塘库区水质样本,测定采样点水深、透明度(SD)、水温、pH值、流速及水样溶解氧(DO)、化学需氧量(COD)、氨态氨(NH4+-N)、亚硝酸盐氮(NO2--N)、总氮(TN)、总磷(TP)等主要理化因子。【结果】邕江和西津水库莲塘库区水体COD、TP、TN、NH4+-N、NO2--N的季节变化特点均是:春季>冬季、夏季>秋季,而DO的季节变化趋势为:冬季>春季、秋季>夏季。根据Kaiser正交旋转因子荷载矩阵分析,得知邕江养殖水域水质监测工作重点应为水温、pH值、TP和TN,西津水库养殖水域水质监测工作重点应为水温、COD、NH+4-N、NO2--N、TP和TN。而模糊评价结果表明,邕江养鱼江段水质为中度富营养化,西津水库莲塘库区水质处在轻度营养化与中度富营养化之间。【结论】网箱养殖对河流水域和半封闭微流水域水质主要理化因子均有明显影响,但影响程度不一。邕江和西津水库莲塘库区水域若持续发展水产养殖,则应降低养殖密度以避免水体高度富营养化。

7种常用渔药及组合对致病性鮰爱德华氏菌的体外抗菌试验

为探讨7种常用抗菌渔药对致病性鮰爱德华氏菌的体外抗菌作用,采用2倍稀释法测定了7种渔药对致病菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC),在初筛MIC的基础上,以MIC、5倍MIC、10倍MIC和20倍MIC下平板抑菌圈直径为参数,分别比较5种药物抗菌效果并优化最佳参数;利用优化的最佳参数比较5种药物单独用药与联合用药对鮰爱德华氏菌的抑菌效果。结果表明,抗菌先锋对鮰爱德华氏菌的MIC和MBC最小,分别为3.2和6.4μg/mL,其次是伯乐立康,分别为12.8和25.6μg/mL,而鱼康和肠炎烂鳃灵的浓度为1638.4μg/mL时仍无抗菌效果;5倍MIC下抑菌圈直径为筛选抗菌药物的最佳参数,5倍MIC下,鮰爱德华氏菌对抗菌先锋高度敏感,对伯乐立康、菌必清、菌毒康和海鱼安中度敏感;菌必清+抗菌先锋的联合抗菌效果最佳。

罗氏沼虾的越冬管理及亲虾培育

罗氏沼虾作为世界淡水虾养殖对象之一,在我国经过20多年的发展,特别是近10年全国兴起大规模养殖罗氏沼虾之后,各地育苗场也如雨后春笋般建立起来。随着各地虾苗流通的泛滥,造成疾病相互传染和种质的混杂,出现罗氏沼虾种质退化、个体变小、抗病力弱、各种致命性的急性或慢性病的快速传播,在一定程度上影响了罗氏沼虾的养殖。

罗氏沼虾不同品系的养殖对比研究

对罗氏沼虾(Macrobraciumrosenbergii)四个选育系——新引进系、原引进系、正交系和反交系,进行了养殖对比研究。研究结果表明:新引进系的生产性能最优,试验池单位养殖产量比反交系增产3·40%,比正交系增产8·35%,比原引进系增产12·16%;试验塘单位养殖产量比反交系增产21·24%,比正交系增产27·60%,比原引进系增产11·12%;杂交系的杂种优势不明显。

养殖条件下倒刺鲃的年龄与生长

研究了倒刺的年龄与生长规律 ,结果表明 :倒刺鳞片年轮特征主要为疏密切割型。体长与鳞长之间的直线相关L =2 .0 85 4+2 .36 2 0R和幂函数相关L =2 .85 12R0 .952 9中 ,以幂函数相关性密切 ;体重与体长呈指数函数相关W =2 .4 984× 10 - 2 L2 .9936 。 4龄以前生长较快 ,生长指标高 ,体长指标高 ,体长和体重的相对增长率大 ,其生长规律可用VonBertalanffy方程表达 :Lt=[1-e- 0 .132 5(t+ 0 .2 0 95) ],Wt=132 76 .4 0 [1-e- 0 .132 4 (t+ 0 .2 0 95) ]3。体重生长曲线的拐点位于t =8.0 9龄、W8.0 9=3933.6 1g ,即Wt=0 .2 96W∞ 处。倒刺雌性一般在 5龄性成熟 ,雄鱼 3～ 4龄时性成熟。建议江河捕捞对象应为 5 + 龄以上的个体。

罗非鱼热休克蛋白70在毕赤酵母中的表达与纯化

以尼罗罗非鱼血液mRNA反转录获得编码罗非鱼Hsp70完整cDNA,重组构建罗非鱼真核表达载体pPIC9K/rtHsp70;在毕赤酵母Pichia pastoris KM71中表达重组罗非鱼的热休克蛋白70(rtHsp70),对表达上清液进行SDS-PAGE及Western blot分析;采用亲和层析、HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化目的蛋白。结果表明:克隆至pMD载体上的基因与目的基因完整编码区序列完全一致;诱导表达上清液经SDS-PAGE及Western blot分析,上清液中蛋白条带大小与目的蛋白相对分子质量大小一致;每升诱导上清液可以获得约2 mg纯化蛋白。本研究中获得的rtHsp70毕赤酵母工程菌及纯化的rtHsp70为后期rtHsp70-肽疫苗研究奠定了基础。