重组腺病毒载体pDC316-hIL--24的构建及病毒滴度测定

目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达h IL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。

高等院校创新型师资内涵和特征研究

21世纪是以创新为特征的时代 ,高校培养适应时代需要的创新型人才的目标 ,决定了创新型师资的理念内涵、功能内涵和结构内涵 ,同时显示出相应的特征。

可活化细胞穿膜肽的设计及修饰高分子载体pHPMA的作用检测

目的合成一种可活化细胞穿膜肽ACPP,并初步探索其穿膜活性及其对高分子聚合物pHPMA的共价修饰作用。方法通过化学合成的方法合成可活化细胞穿膜肽ACPP,通过免疫荧光法检测细胞内mmp2蛋白的表达;通过荧光显微镜观察鉴定ACPP的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad.egfp及ACPP-pc-Ad.egfp。通过荧光显微镜观察及动态光散射法初步鉴定接合物的合成,通过荧光显微镜观察鉴定接合物ACPP-pc-Ad.egfp亚细胞分布。结果成功合成了可活化细胞穿膜肽ACPP;ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性;通过ACPP修饰高分子聚合物pHPMA合成了ACPP-pc-Ad.egfp;经荧光显微镜观察证实ACPP-pc-Ad.egfp具有较强的感染细胞的能力,并由ACPP介导大分子进行非内吞性跨膜运输。结论成功合成了ACPP,ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性,并成功修饰高分子聚合物pHPMA。

肿瘤靶向细胞穿膜肽的设计合成及活性检测

目的合成一种可活化细胞穿膜肽(ACPPs)并初步探索其穿膜活性及亚细胞分布。方法应用化学合成方法合成ACPPs,采用流式细胞仪检测ACPPs穿膜活性,免疫荧光法及全波长酶标仪检测表达ACPPs的肿瘤靶向性穿膜作用,用荧光显微镜观察ACPPs在细胞内的定位及ACPPs-pc-Ad.egfp复合物的亚细胞分布。结果成功合成了ACPPs,ACPPs-异硫氰酸荧光素(FITC)组较牛血清清蛋白-FITC组荧光量大,差异有统计学意义(F=4 656.600,P=0.000),ACPPs具有肿瘤靶向性穿膜活性,人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞SW480、人卵巢癌细胞OVCAR3细胞质内荧光量较人支气管上皮细胞HBE大,差异有统计学意义(F=37 947.676,P=0.000);ACPPs定位于细胞质并介导ACPPs-pc-Ad.egfp复合物分布于细胞质。结论成功合成了ACPPs,ACPPs具有肿瘤靶向性穿膜活性并分布于细胞质。

可活化细胞穿膜肽-聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及跨膜运输途径检测

目的：合成一种由可活化细胞穿膜肽（ACPP）、水溶性高分子聚合物聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（pHPMA）修饰腺病毒的接合物，并初步探索该接合物的跨膜运输途径。方法通过化学合成的方法合成ACPP。将肺腺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MDA-MB-231、肺支气管上皮细胞株HBE和肝癌细胞株HepG2均分为两组，分别加入培养基及终浓度为10 mg/L基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素，12 h后加入ACPP，通过荧光显微镜观察并鉴定ACPP对各细胞的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad. mda-7.egfp及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp，通过荧光显微镜观察并初步鉴定接合物的合成和对A549细胞的穿膜活性。应用流氏细胞术检测接合物感染A549细胞的能力。通过荧光显微镜观察并鉴定接合物ACPP-pc-Ad. mda-7. Egfp在A549细胞内定位及穿膜活性。结果合成了ACPP 100 mg。ACPP对A549、MDA-MB-231、HepG2细胞株具有靶向性穿膜活性，而HBE细胞内未见绿色荧光，强力霉素组细胞经过强力霉素作用后与ACPP-FITC孵育，4种细胞内均未见明显绿色荧光反应，强力霉素阻断了ACPP的肿瘤选择性穿膜作用。合成了两种接合物pc-Ad.mda-7.egfp（粒径420.6 nm）及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp（粒径462.2 nm）。将ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、pc-Ad.mda-7.egfp接合物、Ad.mda-7.egfp与A549细胞共培养后，可见空白对照组（培养基）无绿色荧光蛋白表达，pc-Ad.mda-7.egfp接合物仅见微量绿色荧光蛋白表达，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、Ad.mda-7.egfp组所有细胞均可见强烈绿色荧光蛋白表达。经流氏细胞仪检测，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp组A549细胞PI荧光值明显高于pc-Ad.mda-7. egfp组。经荧光显微镜观察证实接合物ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp大量分布于A549细胞胞质，而pc-Ad. mda-7.egfp仅出现少量内吞性囊泡。结论成功合成了ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp接合物，并证实ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp以非内吞途径进行跨膜运输。