转基因水稻TT51—1标准物质的研制

将筛选后的转基因水稻qT51—1和非转基因水稻明恢63种子分别冷冻研磨成粉末，采用重量法配置了5个不同水平的标准物质。经检验该标准物质的均匀性良好，可在4℃保存条件下存储1年。标准物质采用重量法的质量分数作为标准值，数字PCR测定拷贝数分数作为参考值，通过转基因水稻与非转基因水稻种子粉末提取效率比值校准的数字PCR定值结果与重量法质量分数定值结果之间具有等效一致性，该标准物质可用于转基因水稻TT51—1的定量PCR检测及其特异性检测方法的评价。

食源性细菌检测方法研究进展

据世界卫生组织（WHO）统计,每年全球死于食源性和水源性微生物疾病的人数总共约有220万人,因此WHO将食品安全定为本世纪优先解决的重大问题之一[1]。我国卫生与计划生育委员会（卫计委）每年都会在官方网站通报全国食物中毒事件,以2013年为例,卫计委通过突发公共卫生事件网络直报系统共收到全国食物中毒类突发公共卫生事件报告152起,中毒5 559人,死亡109人,

粘质沙雷氏菌测量方法研究

粘质沙雷氏菌是生物防护评价的指示菌。对粘质沙雷氏菌营养琼脂平板涂布法进行了方法验证和协同实验验证以及不确定度分析。结果显示,该方法重复性和复现性均较好,室内重复性相对标准偏差为8.93%,室间相对标准偏差为14.95%。经统计分析,营养琼脂平板涂布法相对扩展不确定度为12.60%(k=2),适用于粘质沙雷氏菌定量测量。

枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢测量方法研究

枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢是生物防护和灭菌效果评价的重要指示微生物,其量值准确可以保证评价的有效性和可比性。对枯草芽孢杆菌涂布平板法进行了方法验证和协同实验验证以及不确定度分析。结果显示,当平板上的菌落数在30~300 CFU之间时,该方法重复性和再现性均较好,室内重复性相对标准偏差为10.0%,室间相对标准偏差为14.1%。经统计分析,胰蛋白胨大豆琼脂培养基平板涂布法相对扩展不确定度为12.0%(k=2),适用于枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢定量测量,对于人员防护装备防护性能评价、消毒剂检测及灭菌质量控制具有重要意义。

转基因水稻种子核酸提取方法的比较研究

以转基因水稻克螟稻2号及其受体水稻秀水11的种子为试验材料,将水稻种子脱壳磨成粉末后,称取100mg粉末分别用传统CTAB法和5种核酸提取试剂盒进行水稻基因组DNA的提取,其中试剂盒A和试剂盒B为磁珠法,其余为硅胶过柱法,将提取的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、荧光定量PCR等3种检测方法比较其提取效果,并结合提取时间和提取成本的比较,以期找到性价比最佳的提取方法。结果表明,试剂盒A和试剂盒B提取的基因组DNA完整性最好、纯度和提取效率最高,综合提取效果、耗时及成本等因素考虑,试剂盒B的性价比最佳。本研究为转基因水稻种子的检测和研究奠定了基础。

转基因植物Real-time PCR方法检出限和定量限的研究

目前Real-timePCR(Rt-PCR)方法在转基因植物定量检测中应用最为广泛。有关该方法的检出限和定量限的计算并没有达成统一。本文采用统计模型对三种转基因植物进行实时荧光定量PCR方法检出限和定量限的研究。实验结果表明:转基因玉米NK603检出限5拷贝,定量限14拷贝;转基因棉花Mon15985检出限5拷贝,定量限12拷贝;转基因油菜Oxy235检出限4拷贝,定量限9拷贝。是利用统计学方法对转基因植物荧光定量PCR方法检出限和定量限研究的一个积极尝试,可用于其他转基因植物检测中检出限和定量限的确定。

中国乙肝病毒核酸检测试剂盒现状

我国是乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)的高发区,应用核酸扩增技术对HBV核酸生物标志物进行定量检测是HBV诊断和治疗监测中的重要方法。然而,目前我国市场上的商业化HBV核酸检测的试剂盒很多,有必要对不同厂商生产的乙肝病毒核酸检测试剂盒进行评价和分析。本文对乙肝病毒核酸检测方法、乙肝病毒核酸检测试剂盒现状和比较分析等方面作一介绍,以供试剂盒使用者和研发者参考。

基于数字PCR的单分子DNA定量技术研究进展

数字PCR是一项针对单分子目标DNA的绝对定量技术.该技术是将含有DNA模板的反应溶液分配到大量独立的反应室中并且发生扩增反应,通过统计反应室中的阳性信号来定量DNA的拷贝数.DNA样品在反应室中随机和独立分布是单分子成功扩增和准确定量DNA拷贝数的关键因素.本文综述了数字PCR的发展历史、数字PCR与实时荧光定量PCR的区别,以及数字PCR在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达、环境微生物检测和下一代测序等方面的最新进展,并展望了该技术的应用前景.

转基因定量检测用质粒分子标准物质研究进展

近10年来,应用于转基因植物产品定量检测的质粒分子标准物质凭借其易于富集,快捷高效等优点,成为各国检测机构的研究热点。对国内外转基因植物核酸定量检测用的质粒分子标准物质研究进展进行总结和评述,并且对该类标准物质在研制过程中的问题进行分析,同时展望了该类标准物质的发展与应用。

金黄色葡萄球菌标准物质的研制

将金黄色葡萄球菌添加到复合保护剂中,经冻干制备成干粉状标准物质,通过比较冻干前后活菌数来验证保护剂保护效果,并研究标准物质的均匀性和稳定性。结果表明复合保护剂的保护率达到51.74%,可以在冻干过程中有效保护菌体,制备的金黄色葡萄球菌标准物质均匀性良好,可以稳定保存半年。该标准物质可用于食品检测实验室质量控制和食品中金黄色葡萄球菌检测结果的评价。

大肠杆菌定量检测用标准物质的研制

采用平板计数法考察复合保护剂对大肠杆菌标准物质冻干粉的保护效率以及均匀性、稳定性。结果显示：复合保护剂对大肠杆菌保护率达到53．19％，可以在冻干过程中有效保护菌体。将大肠杆菌与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥制备成干粉状标准物质，形态好、复水速度快、均匀性良好，可以稳定保存半年。该标准物质可用于食品检测实验室质量控制和食品中大肠杆菌检测结果的评价。

数字PCR方法准确测量质粒DNA拷贝浓度

中国计量科学研究院(NIM)利用数字PCR技术针对国际比对样品质粒DNA,通过设计2对特异性的引物和探针、优化PCR扩增体系、排除PCR mastermix中的DNA污染,成功建立了定量该质粒DNA的数字PCR方法。比较了采用单重PCR和双重PCR方法定量结果之间的差异,最终实现了对比对样品的定量和不确定度评定。对线性质粒样品的测量结果及其扩展不确定度(k=2)为(8.06±0.55)×10~3 copies/nag,该结果在比对参考值不确定度范围内,且与参考值非常接近。

数字PCR和下一代测序方法用于KRAS基因突变检测中的可比性研究

针对KRAS基因中的2个常见突变G12R和G12S,建立了基于数字聚合酶链反应(PCR)和下一代测序(NGS)技术的特异性检测方法。利用含有目标突变的细胞系配制成不同突变比例的样本,考察了所建立的数字PCR和NGS方法的分析灵敏度和2种方法测量结果的可比性。结果发现对突变比例≥0.83%的样品,NGS和数字PCR的测定结果无显著差异(p>0.05)。突变比例<0.83%的样品,2种方法的测定结果差异显著(p<0.05),而数字PCR方法的测定结果与配制值无显著差异。这表明2种方法在检测高丰度突变时测量结果可比,而数字PCR方法在测定低丰度突变时准确性更高。

转基因大豆Mon89788基体标准物质协同实验研究

对研制的3个含量水平的转基因大豆Mon89788基体标准物质进行多家实验室的验证研究。研究过程包括转基因大豆中基因组DNA的提取和转基因组分的定量PCR方法确认，标准物质的多家实验室协同实验，以及测最的不确定度评估。多家测定分析结果表明，转基因大豆Mon897883种不同外源基因／内源基因含量水平的标准物质参考值和扩展不确定度分别为0．35％±0．17％，0．61％±0．14％，3．17％±1．70％（k=2）。基体为大豆粉的该标准物质可用于转基因大豆含量的定量检测。

转基因水稻克螟稻标准物质的初制备

建立了转基因水稻克螟稻基体标准物质的初制备体系。按照0．5％、1％、2％、5％的质量比分别加入阳性粉末和阴性粉末，配制成4个水平的基体标准物质。实验结果表明，所选的阳性粉末和阴性粉末的水分分别为3．288％和4．039％，粒径均小于200斗m。从标识“金粉”的检测结果也可以看出，4个水平的基体标准物质均具有较好的均匀性。克螟稻基体标准物质的前期制备符合转基因基体标准物质的要求，可为后期进一步考察其稳定性和定值等参数提供基础。

转基因水稻华恢1号检测用质粒标准分子研制

质粒标准分子作为阳性标准品已广泛用于转基因作物及产品的核酸定量检测。但是目前多数质粒标准分子只用于研究,未能成为国家级标准物质。因此,按照国家一级标准物质技术规范,研制了用于检测转基因水稻华恢1号的质粒标准分子,内容包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、可替代性研究、均匀性检验、稳定性考察、定值与不确定度评估。结果表明,该质粒分子标准物质半年内稳定,可替代基因组作为华恢1号定量的阳性标准。

转基因水稻基体标准物质候选物真实性的鉴定技术研究

以PCR技术及琼脂糖凝胶电泳技术为基础，对转基因水稻克螟稻2号和阴性受体秀水11进行真实性鉴定。利用典型性检测、指纹图谱技术对候选物的转基因事件的真实性、转入事件正确性（是否为特异性目标外源基因）、品系遗传背景进行鉴定，结果表明，克螟稻2号只含特异性序列Cry1Ab，秀水11不含所选的外源基因，它们具有相同的遗传背景。随机各抽取克螟稻2号和秀水11水稻100株，通过特异性PCR、免疫印迹实验来检测原材料的纯度，结果表明，克螟稻2号为100％的转基因水稻，秀水11为100％的阴性受体水稻。

转基因玉米NK603基体标准物质协同定值实验

对转基因玉米NK603基体标准物质荧光定量PCR方法的关键参数进行了方法验证，结果表明该方法适合于标准物质量值协同实验。选择7家实验室采用经过验证的方法对3个水平的转基因玉米NK603基体标准物质量值进行了协同实验，通过分析比较各参与实验室的实验条件、标准曲线的参数，进一步证明该方法室间重复性较好。经统计学分析各参与实验室的数据等精度，3个水平基体标准物质的量值和扩展不确定度分别为0．57％±0．11％、1．21％±0．30％和4．92％±1．80％（k=2）。

转基因油菜Ms8质粒分子的制备

随着转基因产品的大规模商业化和我国大规模进口油菜籽,有效管控存在的风险显得非常必要和有意义,试验研究了质粒标准分子pMs8的研制过程,包括质粒分子的构建、纯度分析、特异性检测、均匀性检验、稳定性考察、定值。结果表明,该质粒分子标准物质的内源基因和外源基因的均匀性良好,没有扩增出所选的其他特异性基因,短期稳定性在14 d(处理温度大于25℃)发生显著变化,长期稳定性大于6个月,两种方法对外源基因拷贝数的定值结果相近,因此,p Ms8是有准确量值的质粒标准分子。可替代性研究结果表明,其可替代基因组作为转基因油菜Ms8定量的阳性标准。

北京市石景山区奥运相关餐饮业食源性致病菌监测

目的监测北京市石景山区奥运相关餐饮业中即食食品中大肠菌群及常见的沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、肠致病性大肠埃希氏菌(EPEC)、EHECO157H7、变形杆菌、单核细胞增生性李斯特菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌计数等9种食源性致病菌污染现况和动态变化趋势。方法食源性致病菌检测采用国家标准方法《食品卫生微生物学检验》(GB/T4789—2003)及《变形杆菌食物中毒诊断标准及处理原则》(WS/T9—1996)进行。结果全年监测辖区内奥运相关餐饮单位共计194户次,共监测食品样品978件,其中监测大肠菌群的样品931件,大肠菌群超过450MPN/100g(现行食品卫生标准中大肠菌群最高限量)的样品14件,检出率为1.50%,且全年每月大肠菌群超标检出率均低于北京市同期检出率(5.8%～38.1%)。全区监测致病菌和条件致病菌的食品样品942件,共检出致病菌和条件致病菌5件,总检出率为0.53%,低于北京市同期监测检出率4.6%。结论全区奥运相关餐饮业中即食食品中常见食源性致病菌污染状况在北京市处于较低水平,要进一步加强食品卫生宣教及监督力度,预防食物中毒发生,保障奥运食品卫生安全。