丙型肝炎病毒解旋酶在大肠杆菌中的表达纯化及鉴定

解旋酶(helicase)在HCV基因组复制中负责RNA的解链,在复制中起着关键的作用。利用反转录PCR,从HCV患者血液中扩增出解旋酶基因,克隆入原核表达载体pProEXHTb,成功构建了HCV解旋酶原核表达质粒pProEXHTb-helicase。重组质粒转化DH5α大肠杆菌,经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Westernblot证实系解旋酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化解旋酶。

RNAi对HCV ns5b基因表达的抑制作用

目的 :研究RNAi(RNAinterference)效应对HCVns5b基因表达的抑制作用 .方法 :根据HCVns5b基因序列及其二级结构特征 ,依据Tuschl等设计siRNA的原则 ,确定并合成了针对ns5b基因的siRNAs;利用电转化方法将合成的siRNAs转染NS5B EGFPHepG2细胞株 ,以未转染的细胞为对照 ;细胞爬片后经DAPI染色 ,荧光显微镜下观察和半定量RT PCR法检测siRNAs的抑制效应 .结果 :化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 ,效率可达 70 %-80 %以上 .结论 :在细胞水平上 ,化学合成的siRNAs可以抑制HCVns5b基因的表达 。

在医学微生物学教学中融入医学伦理教育

在医学微生物学课程教学实践中贯彻医学伦理教育和理念,从提高教师医学伦理学素养、将医学伦理学教育融入到教学中的关键环节、联系微生物学研究热点蕴含的医学伦理等几个方面实施医学微生物学的教学改革,对医学生的医学伦理素养养成、对其进入临床实践后加深医学伦理思考并做出独立判断打下坚实的基础。

稳定表达丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶的HepG2细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒单链丝氨酸蛋白酶（scNS4A／NS3）的真核表达载体；建立重组质粒稳定转染的HepG2细胞克隆．方法：根据文献报道设计扩增scNS4A／NS3编码基因的引物，从HCV阳性患者血清中提取病毒RNA，RT-PCR方法扩增出scNS4A／NS3基因片段，BamH Ⅰ／HindⅢ双酶切后连接到经同样酶切的真核表达载体pcDNA3，1（-），转化菌株JM109感受态细胞，获得重组质粒pcDNA3．1（-）～scNS4A／NS3，经酶切鉴定及序列测定．将阳性重组质粒用脂质体法转染HepG2细胞，经持续G418压力选择和克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT-PCR，IFA，Western-blot证实该稳定细胞系可以表达单链丝氨酸蛋白．结果：成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-scNS4A／NS3；建立了稳定转染的HepG2细胞克隆，命名为scpHepG2．结论：获得稳定的scpHepG2细胞克隆可表达单链丝氨酸蛋白，为下一步建立以细胞为基础的评价抗HCV丝氨酸蛋白酶药物系统奠定基础．

HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶在大肠杆菌中表达、纯化

在大肠杆菌中HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶获得表达并进行纯化。根据NS3与NS4A两者形成异源二聚体的结构要求,并参照文献,通过基因拼接的方法设计了单链NS3/4A丝氨酸蛋白酶的基因。合成相应引物,利用反转录PCR从HCV患者血液中扩增出该蛋白酶的编码基因,克隆入原核表达载体pRSET-A,将重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a转化BL211(DE3)大肠杆菌,并诱导表达与纯化。成功地构建了重组表达质粒pRSET-A-ns3/4a;重组质粒转化的BL21工程菌经IPTG诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Western-blot证实为NS3/4A丝氨酸蛋白酶,并用镍离子亲和层析方法获得纯化蛋白酶。获得的纯化NS3/4A丝氨酸蛋白酶为建立其酶活性测定系统奠定了基础。

医学微生物学发现史在教学中应用的思考

医学微生物学具有内容多、不系统、推理少、易混淆的特点,如何提高学生的学习兴趣、变被动学习为主动学习是提高教学质量的关键。通过在课堂教学中引入重要病原微生物的发现史,让学生了解科学探索的思维过程、方法及社会历史背景等,激发了学生学习的兴趣,加深了学生理解微生物学的意义,起到了良好的教学效果。

护理学专业医学微生物学教学改革与实践

护理专业人才的工作质量与掌握的医学微生物学知识密切相关，护理专业的学科特点也决定了在护理教学中医学微生物学应该有自身的教学体系，而不同于临床医学。立足护理专业，注重联系实际、结合临床，从培养符合现代医学需要的护理人才出发，对医学微生物学教学进行了一系列改革，取得了良好的教学效果。

丙型肝炎病毒多表位基因核酸疫苗的构建及其免疫原性

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,用该重组质粒免疫BALB/c小鼠,并检测其免疫原性.方法 用BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切含有HCV C区、E2区模拟表位和NS3～NS5区细胞表位串联基因的原核表达载体pQE30-CtEm,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（-）,脂质体瞬时转染CHO细胞,并检测其表达.以100 μg重组质粒免疫BALB/c小鼠,检测其体液免疫和细胞免疫效果.结果 所构建的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm在CHO细胞中能获得有效表达.该质粒免疫小鼠后可诱导高水平的抗体,特异性淋巴细胞增殖反应、IFN-γ水平及CTL活性均明显高于空载体和生理盐水对照组.结论 已成功构建HCV多表位基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-CtEm,免疫小鼠后可诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答.

天花粉蛋白的聚乙二醇定点修饰及其性质的初步研究

用聚乙二醇(PEG)定点修饰天花粉蛋白(TCS),并比较了修饰前后TCS的生物活性、免疫原性及药代动力学等诸多性质.选择TCS分子上可能的抗原决定簇位点KR173-174进行定点突变,并将所构建的突变体TCSKR173-174CG在大肠杆菌中表达及纯化.通过该突变体第173位引入的半胱氨酸残基进行PEG定点修饰.通过比较研究,分析所构建的PEG修饰型TCS的DNA酶活性、致核糖体失活活性、免疫原性、急性毒性以及药代动力学性质,研究结果表明,所构建的突变型TCS(mTCS)的活性与野生型TCS(wTCS)活性几乎相当,而免疫原性已显著降低.PEG修饰型TCS虽有活性下降,但其免疫原性、急性毒性以及药代动力学性质得到显著提升.表明通过基因工程及化学修饰方法改造TCS是可行的,所构建的突变型及PEG修饰型TCS值得进一步研究.

HCV复合多表位抗原基因的克隆表达及其免疫学特性分析

目的构建丙型肝病炎病毒（HCV）截短C基因和多表位基因重组原核表达质粒，表达纯化融合蛋白，分析其免疫原性和抗原性。方法PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位与NS3～NS57个表位基因Em；分别将Ct、Em克隆人原核表达质粒pQE30，筛选阳性重组质粒pQE30-CtEm，转化E．coli M15，IPTG诱导融合蛋白表达，薄层扫描分析表达蛋白；可溶性分析后用Ni^2＋-NTA凝胶亲和层析柱纯化、透析并浓缩融合蛋白；Westernblot分析纯化蛋白的特异性和抗原性；纯蛋白免疫小鼠后分析其免疫原性。结果成功构建了HCV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pQE30-CtEm，目的基因可高效表达，表达产物主要以包涵体形式存在，Ni^2＋-NTA纯化可获得目的蛋白，纯化蛋白具有良好的抗原性和免疫原性。结论HCV复合多表位抗原基因融合蛋白可高效表达并得到纯化，该融合蛋白可作为HCV诊断抗原，也为丙型肝炎新型疫苗的研究提供了靶抗原。

天花粉蛋白突变体TCS_(KR173-174CG)的构建、表达与纯化

目的构建天花粉蛋白(TCS)突变体基因,并进行表达及纯化。方法应用计算机预测TCS分子上可能的抗原决定簇,并进行定点突变。以栝楼基因组DNA为模板,经PCR扩增突变基因,与pRSET-A表达载体连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,并对表达产物进行Ni-NTA层析纯化。结果目的蛋白在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,表达产物经纯化后,得到均一的TCS突变体蛋白。结论已成功构建了TCS突变体基因,并获得高效表达。

几种水处理方法对污水中病毒清除作用的评估

目的 评估不同水处理方法 (沉淀过滤法、超滤法、臭氧消毒法、氯消毒法 )对病毒的清除效果。方法 在污水中人为添加定量的柯萨奇病毒作为病毒指示剂 ,采用不同的水处理方法处理污水 ,以细胞培养法 ,细胞半数致死剂量 (TCID50 )为检测指标 ,检测各种水处理方法对柯萨奇病毒的清除效率。结果 臭氧消毒法对病毒清除最为有效 ,其次为沉淀过滤法与超滤法 ,氯消毒法效果不明显。结论 对污水中病毒的清除不能采用单一工艺 。

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达

目的 :建立稳定表达丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白的原核表达系统 ,获得高产量的纯化核心蛋白。方法 :应用多聚酶链反应 (PCR) ,以HCV -H株全长cDNA序列为模板 ,扩增获得核心区基因片段 ,克隆入原核表达载体pBVIL1,构建原核表达载体pBVIL1-C ,转化HB10 1宿主菌 ,通过温度诱导表达核心蛋白。结果 :扩增得到目的基因长度为 5 73bp ,构建pBVIL1-C表达载体 ,在HB10 1宿主菌中通过温度诱导获得稳定表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白含量的 2 1% ,Western -Blot检测证实表达产物可与HCV患者阳性血清发生特异性结合反应。结论

HCV NS3蛋白单克隆抗体的制备及其识别区域的分析

目的制备针对丙型肝炎病毒(HCV)非结构区NS3全长蛋白的单克隆抗体(MAb),并分析获得的单抗识别表位所在区域,为建立以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究提供抗体工具。方法用原核表达的HCV非结构区NS3全长蛋白作为免疫原,采用小鼠腹股沟皮下NC膜包埋法免疫小鼠,按常规杂交瘤细胞的制备方法,经细胞融合、克隆化制备抗NS3蛋白的MAb。用间接免疫荧光法和Westernblot鉴定其特异性。分别构建NS3丝氨酸蛋白酶(NS3蛋白的N末端13)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3p、NS3解旋酶(NS3蛋白的C末端23)编码基因的真核表达质粒pcDNA3.1()ns3h,将其瞬时转染COS7细胞后,以获得的单克隆抗体作为一抗,通过免疫荧光分析获得单抗识别表位所在的区域。结果获得了2株抗NS3蛋白的单克隆抗体,这2株MAbs均特异识别NS3蛋白,并确定了它们的结合区域。结论获得了针对NS3蛋白的单克隆抗体,并对其单抗识别表位所在的区域进行了分析,为下一步进行以NS3蛋白为靶位的抗HCV研究奠定了良好的基础。

人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达

目的:应用毕赤酵母表达系统表达人羧肽酶A1(carboxypeptidaseA1,CPA1)活性中心蛋白.方法:从pGEX-CPA1重组质粒中扩增出CPA1活性中心基因,亚克隆入酵母表达载体pPIC9K,酵母重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter电转化入毕赤酵母SMD1168,并进行营养缺陷筛选和G418抗性筛选,对高拷贝整合的重组酵母表达菌株诱导表达.结果:构建得到酵母融合重组表达载体pPIC9K-CPA1activecen-ter,经G418浓度梯度筛选得到串联整合16个重组表达载体的重组酵母表达菌株,诱导表达后得到CPA1活性中心蛋白.结论:在毕赤酵母中成功表达了CPA1活性中心,为进一步研究CPA1活性中心在抗体导向酶-前体药物疗法中的应用打下了基础.

SARS冠状病毒核衣壳蛋白的重组表达及其单克隆抗体的制备

目的: 表达SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N蛋白),并以表达产物为免疫原制备特异性单克隆抗体 (mAb)。方法: 采用RT- PCR方法, 从灭活的病毒抗原标本中扩增编码N蛋白的基因。测序确认后, 再亚克隆至原核表达载体中。从SDS -PAGE凝胶中回收原核表达产物后免疫BALB/c小鼠, 经融合、筛选制备特异性mAb。结果: 从标本中扩增出 1 269bp的DNA, 测序结果证实为N蛋白基因。将该基因克隆至原核表达载体中后, 在大肠杆菌中获得了较好的表达。表达产物经SDS- PAGE后, 在Mr约为 43 000处可见 1条明显的诱导表达带。Westernblot的结果表明, 该电泳带与SARS患者的恢复期血清呈特异的免疫反应。从SDS- PAGE凝胶中回收表达产物并免疫BALB/c小鼠, 制备出 3株抗N蛋白的mAb。这些mAb与SDS- PAGE凝胶上Mr约为 43 000的蛋白带也呈现很强的免疫反应。结论: 所获的重组N蛋白及特异性mAb, 将为进一步建立SARS病毒感染早期诊断的方法奠定了基础。

稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立

目的：构建丙型肝炎病毒（HCV）多表位基因的真核表达载体，获得重组质粒稳定转染的P815细胞克隆．方法：PCR方法扩增核心区羧基端部分缺失的基因片段Ct；合成HCVE2区模拟表位和NS3～NS5七个T细胞表位基因Em；分别克隆入穿梭质粒载体pDE22中．用BamHⅠ／HindⅢ双酶切pDE22得到复合多表位基因CtEm，再将CtEm亚克隆入真核表达载体pCDNA3，1（-），构建重组质粒pCDNA3．1（-）-CtEm，经酶切鉴定及测序正确后，通过脂质体转染至P815细胞，持续G418压力选择和有限稀释法克隆化获得稳定转染的细胞系，用RT—PCR，IFA，Western—blot证实该稳定转染细胞系可以表达多表位基因．结果：构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-CtEm，建立了稳定转染的P815细胞系．结论：构建HCV多表位基因的真核表达载体，稳定转染P815细胞，为进一步在疫苗研究中分析CTL功能建立了靶细胞．

RNA干扰技术抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达

目的:以人类白细胞抗原G基因(HLA-G)为靶基因,采用RNA干扰(RNAi)技术特异性地抑制JEG-3细胞中HLA-G的表达。方法:针对HLA-G基因设计一段小干扰RNA(siRNA),由Ambion公司化学合成,用脂质体lipofectamine2000将该siRNA转染JEG-3细胞,采用RT-PCR、流式细胞术和Westernblot分别从mRNA和蛋白质水平检测该siRNA对HLA-G表达的影响。结果:针对HLA-G的siRNA能够明显下调JEG-3细胞中HLA-G的表达水平,并具有良好的特异性。结论:在JEG-3细胞系中采用RNAi技术特异性下调了HLA-G基因的表达,为进一步研究HLA-G在人类的母胎免疫耐受、正常妊娠的维持及助孕技术应用等方面的作用奠定了实验基础。

天花粉蛋白突变体的构建及其在原核系统中的表达

目的:构建天花粉蛋白(TCS)突变体,并将其在原核系统内进行表达及纯化。方法:借助计算机预测TCS可能的抗原决定簇(YFF81-83)并设计出适当的突变引物。以栝楼基因组DNA为模板,利用重组PCR技术扩增TCS突变体全长基因,经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后与原核表达载体pRSET-A连接,转化感受态E.coliDH5α,提取质粒进行酶切鉴定及测序。将所获阳性重组质粒转化感受态E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达后,对表达产物进行W estern b lot鉴定。最后用N i-NTA亲和层析柱对所获突变体蛋白进行纯化。结果:成功构建了TCS突变体(TCSYFF81-83ACS),并获得了突变体蛋白在大肠杆菌内的可溶性高效表达,经N i-NTA亲和层析柱纯化后,产生出大量均一的TCS突变体蛋白。结论:TCS的定点突变及其在原核系统内的表达,为基因工程方法改造TCS提供了新的途径。

医学微生物学课堂教学与网络课程的比较研究

高校网络课程的发展给传统课堂教学带来了挑战,同时也是传统课堂教学改革的重要契机。文章对这两种教学模式的优点和不足之处进行了深入分析,提出了网络课程和课堂教学进行优势互补和有效整合的几点意见,希望能够为高校医学微生物学探索出一种高效的适应时代发展的新的教学模式,从而激发学生学习兴趣,提高教学质量。