短期血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢及自噬发生的影响

旨在研究短期饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,SMSCs)代谢及自噬发生的影响,解析自噬机制在骨骼肌发育调控网络中的地位和作用,为改良家猪产肉性状提供理论依据。将本实验室分离并保存的SMSCs细胞系复苏,按培养体系中血清浓度将细胞分为20%血清组(对照组)、15%血清组、10%血清组、5%血清组和0%血清组,以形成不同程度的饥饿胁迫。当细胞融合度达到70%~80%后再培养24 h进行检测,每组4个重复。流式细胞术检测各组细胞凋亡率、膜电位和活性氧水平;试剂盒测定ATP水平;WB检测自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ、p62和通路相关蛋白AMPK、mTOR的表达;透射电镜检测细胞线粒体形态和细胞器的变化。结果显示,随着细胞中血清浓度降低,细胞活力、p62蛋白量、p-mTOR/mTOR比值逐渐降低;细胞凋亡率、ROS水平、ATP水平、LC3B-Ⅱ蛋白水平、p-AMPK/AMPK比值、细胞内自噬溶酶体数量、细胞核及线粒体异常率则逐渐升高;与对照组相比,15%组膜电位显著升高,5%和0%组极显著降低。这表明,短期血清饥饿胁迫能诱导基于AMPK/mTOR信号通路的自噬发生,加快细胞代谢,但同时存在加快细胞凋亡、抑制细胞增殖等毒副作用。

运动减肥改善肥胖小鼠卵子质量和早期胚胎发育的研究

为探讨肥胖对雌性动物生育力的影响并探索通过游泳减肥的运动方式改善肥胖对生殖影响的可行性,将3周龄C57BL/6小鼠分为3组:(1)高脂饮食建立肥胖小鼠模型组(HFD组);(2)肥胖小鼠通过运动(游泳锻炼)减肥组(SE组);(3)正常饮食饲养小鼠组(ND组)。通过统计卵巢系数、小鼠超数排卵后排卵数、卵母细胞体内及体外成熟率、体外受精后早期胚胎发育率、卵母细胞中纺锤体结构完整性、线粒体分布同质性来评估肥胖及游泳锻炼减肥对小鼠生育力的影响。结果表明:HFD组卵巢系数、超数排卵后排卵数、卵母细胞体外成熟率、卵巢中卵泡数量均显著低于ND和SE组,ND与SE组无显著差异,HFD组卵母细胞体外受精率和早期胚胎发育率均显著低于ND和SE组。HFD组小鼠MⅡ期卵母细胞纺锤体正常的比例[(22.94±4.73)%]显著低于ND[(85.63±6.63)%]和SE组[(81.05±5.5)%];HFD组小鼠均质型线粒体分布的百分率[(25.73±13.42)%]显著低于ND[(50.77±3.08)%]和SE组[(52.05±7.15)%]。这一研究提示肥胖对小鼠卵母细胞质量和早期胚胎发育均产生负面影响,通过游泳运动减肥可改善肥胖引起的负面影响,为后续深入研究肥胖对雌性动物生殖力影响提供了试验基础。

长时间血清饥饿胁迫对猪骨骼肌卫星细胞代谢和自噬的影响

为了探究长时间、不同程度饥饿胁迫条件对原代猪骨骼肌卫星细胞(SMSCs)代谢和自噬的影响,本试验通过控制SMSCs培养体系中血清浓度以形成不同程度饥饿胁迫,其中20%血清培养浓度为正常对照组,15%、10%、5%和0%血清培养浓度为试验组。细胞培养96 h后,通过流式细胞术检测各组细胞凋亡率、线粒体膜电位和活性氧(ROS)水平,通过ATP检测试剂盒测定细胞内ATP水平,通过Western blot检测各组细胞蛋白中自噬标志蛋白LC3b、p62以及AMPK-mTOR自噬信号通路中p-AMPK/AMPK和p-mTOR/mTOR蛋白的表达。结果显示,与20%血清组相比,0%血清和5%血清细胞凋亡率极显著上调(P<0.01),10%血清组细胞凋亡率显著上调(P<0.05);各试验组线粒体膜电位均极显著下降(P<0.01),ROS水平和ATP水平均极显著上调(P<0.01);细胞中LC3b蛋白的相对表达量随血清浓度降低而升高,p62蛋白的相对表达量随血清浓度降低而降低;p-mTOR/mTOR比值随血清浓度降低而降低,p-AMPK/AMPK比值随血清浓度降低而升高。结果表明,通过长期减少SMSCs培养体系中血清浓度,可以促进细胞代谢加快和凋亡发生,并且通过AMPK/mTOR信号通路激发细胞发生自噬,上述变化的程度与血清减少的程度呈正相关。本试验为后续探索不同程度饥饿胁迫对动物肌肉发育影响的研究提供理论依据。

XRCC1在卵子和早期胚胎中的定位与功能的初步分析

X射线修复交叉互补蛋白1(XRCC1)是一种支架蛋白,其在碱基切除修复中发挥重要作用。本文检测了XRCC1在卵母细胞和胚胎中的亚细胞定位,并研究了其对小鼠卵母细胞减数分裂成熟的影响,以及对随后的胚胎发育和基因组DNA甲基化的影响。结果显示,在卵母细胞成熟和受精后胚胎发育过程中,XRCC1主要定位在细胞核中。通过显微注射特异性抗体来阻断XRCC1后,卵母细胞生发泡破裂率和胚胎卵裂率出现显著性下降,同时2细胞胚胎中基因组DNA去甲基化水平异常。这说明XRCC1主要定位于细胞周期间期的细胞核,功能正常的XRCC1有助于减数分裂中小鼠卵母细胞质量的维持和早期胚胎的正常发育。

利用改良的CRISPR/Cas9系统构建猪PPARD载体及效率检测

为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测,本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统,根据PPARD基因结构和序列特点,设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列,将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞,提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后,通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现,PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比,PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体,并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑,将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率,推进对PPARD基因的功能研究。

整合型诱导表达猪生长激素(pGH)载体的构建及表达研究

旨在构建整合型诱导表达猪生长激素(Porcine growth hormone,pGH)载体,在细胞水平验证其诱导效率及表达效率。从pTRE-GH12载体上扩增TRE-GH片段,通过Sal I酶切位点连接到pCAGGS-rtTA载体中,构建重组载体pCAGGS-rtTA-TRE-GH12(下称pTTGH),将pTTGH质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,在培养液中添加诱导底物强力霉素(Doxycycline,DOX)后不同时间段通过实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内pGH mRNA的表达;在培养液中添加不同浓度的的DOX,通过QRT-PCR及Western blot测定细胞内pGH的表达变化。酶切及测序结果表明成功构建了pTTGH载体;QRT-PCR结果表明,和对照组相比,试验组细胞培养液中添加诱导底物后外源GH基因表达在36h时最高;在一定浓度范围内,外源GH表达水平和添加DOX的浓度呈现出正相关性,而正常细胞组中GH的表达水平不受DOX添加与否及量的影响。通过条带灰度分析Western杂交结果验证了培养基中一定范围内DOX浓度和pGH表达量呈现出正相关。试验结果表明,本研究成功构建了整合型诱导表达GH载体并能实现GH的可控表达,本研究为以后制备可控表达GH转基因动物、进一步研究GH对机体影响奠定基础。

大肠杆菌植酸酶appA2基因联合人MxA基因真核表达载体的构建及表达研究

本研究旨在探讨通过构建同时表达大肠杆菌植酸酶appA2及人抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)的真核表达载体,比较双基因表达载体和相应单基因表达载体中外源基因的表达效率;从pcDNA-ap-pA2载体上扩增CMV-appA2-BGHpA片段,通过MluI酶切位点连接到pcDNA-MxA载体中,构建重组载体pcDNA-appA-MxA(下称AMP),分别将pcDNA3.1(+)、pcDNA-MxA、pcDNA-appA2及AMP质粒转染猪PK15细胞,经G418筛选后,取细胞通过实时荧光定量PCR测定细胞内appA2及MxA的表达,同时部分细胞通过Westernblot测定细胞内MxA蛋白表达量,采用改进的钼酸铵显色法测定细胞内植酸酶活性;酶切及测序结果表明成功构建了AMP载体;QRT-PCR结果表明,转AMP细胞组MxA表达水平是转pcDNA-MxA组的1.118倍,转AMP细胞组appA2表达水平是转pcDNA-appA2组的1.134倍,上述各组间差异显著(P<0.05)。灰度分析结果表明,AMP细胞组细胞内MxA表达量是转染pcDNA-MxA细胞组的1.07倍;植酸酶活性测定试验结果表明,转AMP、pcDNA-appA2细胞组及对照组细胞内植酸酶酶活和对照组平均酶活分别为0.294、0.235及0.082FTU·μL-1,2个试验组间差异不显著,试验组和对照组间差异极显著(P<0.01);试验结果表明本研究构建双基因表达载体中外源基因的表达效率比相应单基因表达载体表达效率高,本研究为以后多基因共表达及制备多基因转基因动物奠定了基础。

营养对奶牛繁殖性能的影响

动物摄取营养是为了生存和生产。繁殖是动物的一种特殊生产 ,营养状况与其密切相关。近些年奶牛在泌乳量得以提高的同时 ,繁殖能力下降。营养主要通过影响奶牛的排卵率、胚胎存活率等直接影响受精率。适量的限饲可以提高奶牛优质胚胎的数量 ,但若出现能量负平衡 ,则会通过抑制促黄体素 (L H)的分泌和降低卵巢对 L H的敏感性 ,使卵巢上的优势卵泡不能及时排出 ,容易形成卵巢囊肿 ,从而影响下一轮卵泡发育。营养状况可以改变血液中孕酮的浓度而改变受胎率。营养状况也会通过改变血液中的尿素和氨的浓度来改变子宫内 PH值的变化 ,从而影响胚胎的着床和早期发育。另外 ,营养还可以改变动物机体内的胰岛素和胰岛素样生长因子的水平来影响胚胎的发育。因此 ,在生产中通过改善营养状况 ,可以充分发挥奶牛的生产性能。

奶山羊细菌人工染色体基因文库构建的初步研究

细菌人工染色体（BAC）文库是进行动物基因组学研究的一个重要手段，为配合山羊乳腺生物反应器的研究，对构建山羊基因组BAC文库进行了初步研究。用Hind Ⅱ酶对莎能奶山羊基因组进行部分酶切，用CHEF（箝位匀强电场）二次电泳法回收150kb大小条带，电透析回收高分子量（HMW）DNA；同时以BAC载体pBeloBAC11为材料，分别采用限制性内切酶HindⅢ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷，将该载体自连并通过凝胶回收线性段DNA，获得了可用于构建BAC文库的线性载体。将HMW与载体进行连接，电击转化感受态DH10／3大肠杆菌，一次转化得到近2000个克隆。插入片段大小为50～200kb，基本满足建库的需要。

《兽医产科学》课程理论与实践教学探讨

《兽医产科学》是为兽医专业开设的很重要的一门专业课,课程理论和实践教学的发展和进步是这门课教与学的重要方向。本文结合《兽医产科学》课程理论和实践教学过程中的一些经验和体会,从课程的总体目标和要求、课程设置、教学方法和手段等几个方面进行初步探讨和分析,并对今后本课程的发展和建设提出几点建议,期望能进一步提高本课程的教学效果,有助于学生掌握本课程规定的内容。

犬子宫蓄脓的诊治

子宫蓄脓是发生在成年母犬的一种常发病,给犬的饲养和管理带来了很大的经济损失。笔者近两年根据该病的发病特点以及临床症状初步诊断出门诊接触的35例子宫蓄脓疑似病例,经X-线摄影对患病犬子宫角对应的区域进行拍片,均可见患病犬子宫角有不同程度的增大,大大提高了该病的确诊率。同时,经X-线摄影提示,根据患病犬不同的发病情况分别进行保守治疗和手术摘除,取得了非常理想的治疗效果。

体内A型精原细胞介导转MxA基因小鼠的制备

本研究旨在探讨内源性A型精原干细胞介导法制备转抗黏液病毒基因A(Myxovirus resistance gene,MxA)基因小鼠的可行性。将pcDNA-MxA质粒和新型转染试剂ExGen500混悬后分5点注射至7日龄的ICR公鼠两侧睾丸组织内,睾丸内基因注射(testis gene transfer,TGT)鼠在性成熟后的不同阶段(6、12及24周龄)与正常母鼠交配,检测后代外源基因整合及表达情况,选取表达MxA基因的小鼠进行H5N1亚型禽流感病毒攻毒试验,观察小鼠的健康状况并观察肺及气管的组织病变情况。结果表明,TGT鼠和正常母鼠交配后能稳定产生转基因后代小鼠,2只TGT鼠在6、12及24周龄交配后代整合率分别为11.11%(2/18)、11.76%(2/17)、11.54%(3/26)及13.64%(3/22)、13.33%(2/15)、11.76%(2/17)。2只TGT鼠后代外源基因平均整合率分别为11.47%及12.91%,之间差异不显著(P>0.05)。RT-PCR检测表明,MxA基因整合小鼠中有21.43%(3/22)测到MxA的表达;所制备的MxA表达鼠H5N1亚型禽流感病毒攻毒后全身症状、肺及气管病变程度明显比正常鼠轻。试验结果表明体内精原干细胞介导的转基因方法是一种可行的、具有很大应用前景的转基因方法,制备的转MxA基因小鼠对H5N1亚型禽流感病毒具有一定的抵抗力。

大鼠RGS4基因的克隆及在原核中的表达

目的构建pGEX4T-1-RGS4载体,并检测融合蛋白GST-RSG4在原核中的表达水平。方法采用RT-PCR方法,将克隆SD大鼠G蛋白信号转导调节因子(regulator of G protein signaling4,RGS4)基因全长编码区的cDNA连接到原核表达载体pGEX4T-1中,IPTG诱导原核表达,通过Western blot检测融合蛋白GST-RSG4的表达水平。结果成功构建了pGEX4T-1-RGS4载体;经IPTG的诱导,RGS4可与GST以融合蛋白的形式高效表达。pGEX4T-1-RGS4在原核内表达产物相对分子质量约为50×103,与预期融合蛋白大小一致。结论构建的重组质粒能够在大肠杆菌中高效表达。

由成年转基因山羊体细胞而来的克隆山羊

在已经获得的乳腺特异性表达人促红细胞生成素 (rhEPO)成年转基因山羊 (Caprahircus)的基础上 ,取其耳尖成纤维细胞和卵巢颗粒细胞 ,进行体外传代培养 ,然后将这种培养的转基因山羊的体细胞移入去核的处于第Ⅱ次减数分裂中期的卵母细胞中 ,并进行电融合 ,构建重构胚胎 ,重构胚胎在体内培养 6d ,再将发育至囊胚或桑椹胚的重构胚胎移入同步情期的寄母羊子宫内。结果 ,有 2只寄母羊妊娠并最终产下 2只成活的克隆山羊。她们分别来自同一成年母羊的耳尖成纤维细胞和卵巢颗粒细胞。克隆羊经PCR RFLP图谱分析显示 :以克隆羊组织DNA为模板的PCR产物与相应的提供体细胞的基因羊的PCR产物的酶切图谱完全一致 ;并且经PCR对外源hEPO基因检测表明 2只克隆山羊均携带hEPO外源基因。

酪蛋白和巨细胞病毒复合启动子激活人乳铁蛋白cDNA基因在转基因小鼠乳腺中的表达

为了提高转基因动物乳腺特异性表达水平，构建了两种不同启动子的乳腺特异性表达载体，以比较其乳腺特异性表达效果。应用山羊β-酪蛋白或牛αs1-酪蛋白调控序列、鸡β-球蛋白隔离元件、巨细胞病毒（CMV）基因表达调控元件构建了乳腺特异性表达复合启动／增强子（Pcmv），以单一的酪蛋白启动子作为对照，与人乳铁蛋白cDNA组成乳腺特异性表达载体，并制备了转基因小鼠。经ELISA检测，复合启动／增强子构件指导人乳铁蛋白cDNA在原代转基因小鼠乳腺中重组人乳铁蛋白（rhLF）表达水平（2．0～8．1g·L^-1）明显高于单一酪蛋白启动子构件（0—12mg·L^-1），而在所有转基因小鼠的血清和唾液中未检测到rhLF。结果提示：酪蛋白-Pcmv复合启动／增强子不仅可提高转基因小鼠乳腺特异性表达水平，而且具有良好的乳腺表达特异性。

牙鲆(Paralichthys olivaceus)Hsp90 mRNA在温度刺激和鳗弧菌感染下的表达特征

利用qPCR方法,检测Hsp90α和Hsp90βm RNA在不同月龄牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织的表达水平,进一步检测在不同温度刺激、鳗弧菌感染后的表达变化。结果显示,Hsp90α和Hsp90β在不同发育期的13种组织(肝脏、脾脏、头肾、后肾、心、肌肉、背皮、胃、肠、鳃、腹鳍、脑和血液)中均有表达。Hsp90β表达水平整体高于Hsp90α;8月龄牙鲆在肝、鳃、背皮、背肌、腹鳍的Hsp90α表达量要显著高于其他发育期(1月龄、12月龄、24月龄)同组织的表达量(P<0.05),而Hsp90β在不同月龄牙鲆的表达量也存在差异,在肝和肠的表达量较高,在鳃、背肌和腹鳍的表达量较低。将8月龄牙鲆在5–32℃刺激1 h,牙鲆肝、脾Hsp90α在高温(22–32℃)的表达量显著升高(P<0.05),而Hsp90β在低温(5–10℃)的表达量显著升高(P<0.05);在10℃、28℃连续刺激8 h,Hsp90α和Hsp90β的m RNA的表达量呈先上升后下降的趋势,Hsp90α的表达量变化幅度显著高于Hsp90β(P<0.05)。在鳗弧菌感染72 h内,牙鲆脾脏Hsp90α和Hsp90β的表达量先下降后上升,Hsp90β上升的幅度更加显著(P<0.05)。结果显示,Hsp90α和Hsp90β在不同月龄、不同组织的表达水平存在差异,Hsp90α在高温时对热应激的反应明显,Hsp90β在低温和对病原菌感染的反应明显,研究结果可为了解牙鲆Hsp90的作用机制提供参考。

新鲜山羊输卵管液对体细胞克隆和转基因胚胎体外发育的影响

用添加不同浓度发情期山羊输卵管液的培养基,对正常单细胞受精卵、注射外源基因后受精卵和细胞核移植后山羊重构卵进行体外培养,探讨其对胚胎体外发育的影响。结果表明:添加20%输卵管液后正常受精卵桑椹胚分裂率为26.1%(11/42),极显著(P<0.01)高于对照组(未添加输卵管液)(7.6%)、50%输卵管液组(4.7%)和100%输卵管液组(0);添加20%输卵管液后,体外培养显微注射转基因受精卵有20.0%(8/40)发育至16-细胞,极显著(P<0.01)高于对照组(6.7%)和50%输卵管液组(4.8%);细胞核移植重构卵在含20%输卵管液的培养基中桑椹胚分裂率为7.3%,与体内培养桑椹胚分裂率(11.1%)差异不显著。在体外培养条件下,添加20%输卵管液可明显提高正常受精卵、转基因受精卵和克隆重构卵的分裂率和发育率。

miRNA-143表达载体构建及表达活性检测

以大白猪基因组DNA为模板,利用PCR扩增miRNA-143前体序列,构建重组载体pEGP-miR-143,转染猪胎儿成纤维细胞,通过荧光观察转染效率和报告基因表达效率,再利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内miRNA-143的表达,以检测外源基因的表达活性;对PCR产物进行测序鉴定及重组载体酶切验证。结果表明:成功构建了pEGP-miR-143载体;转染细胞后进行荧光观察,载体中GFP有较好的表达活性;QRT-PCR表明,与对照组细胞相比,试验组miRNA-143表达有显著提升,差异极显著(P<0.01)。说明已成功制备miRNA-143过表达载体,为在动物细胞和体内开展miRNA-143相应的功能研究奠定基础。

转基因羊与克隆羊的妊娠分析

用配有 5MHz直肠探头超声断层扫描仪 ,对 1 92只经转基因或细胞核移植后的胚胎移植受体白山羊和 6只自然交配羊进行妊娠检查。结果表明 :胚胎移植后 2 8～ 1 0 2 d试验羊妊娠诊断阴性 (B超判断未怀孕羊 )的准确率为 1 0 0 % ,自然交配羊和细胞核移植受体羊妊娠诊断阳性 (B超判断怀孕 )和阴性的准确率为 1 0 0 % 。

不同杂交方式获得高效表达乙肝病毒基因转基因小鼠

By mating transgenic mice, transgenic mice model of high expression of foreign gene was screened. Making use of conventional way of breeding to mate 2(A♀,B♂)transgenic mice integrated Hepatitis B virus(HBV) gene, 2A(♀♂) and 2B(♀♂)transgenic homozygote mice, and 6 bi-heterozygote mice(4♀2♂) by mating A and B homozygote mice were taken. Blood serum of these transgenic mice and their off-springs’ were collected, and HBV DNA expressing in blood serum of transgenic mice was tested by polymerase chain reaction and ELISA (PCR- ELISA). The results were as follows: HBV DNA expression in the blood of bi-heterozygote mice was much more than that of homozygote and heterozygote mice. Breeding bi-heterzygote mice is likely to be a good way of high expression of foreign gene in transgenic animals.