意识活动的神经生物学机制

人类神经系统可能是生物界最后有待攻克的功能系统之一,而尤以其中枢部分、特别是大脑的功能活动最为复杂和奥秘。目前,神经科学工作者对神经系统的一般功能及其生物学机制已有相当深入的了解,但仍然不能清楚地说明大脑是如何产生意识、并以此为基础完成各种高级神经或精神活动的。本文主要从神经科学的角度出发,对近年来利用更为精确的脑电信号记录和功能性脑立体成像等先进技术在意识活动研究方面取得的进展作一概略介绍,并重点介绍意识研究领域中几个比较有影响的学说。

大鼠终纹床核卵圆核及其邻近区域的传出纤维联系——WGA-HRP顺行追踪法研究

本实验选用150～260g的雄性Sprague-Dawley大鼠13只,把WGA-HRP/HRP混合水溶液加压注入一侧终纹床核群前外侧区的卵圆核区域,冰冻切片,TMB法呈色后,在中枢看到顺行标记终末最密集的部位是:下丘脑后部外侧区、中央杏仁核、中脑中央灰质、臂旁核、三叉神经中脑核、蓝斑;比较多的部位是视前区、下丘脑室周区、弓状核、丘脑中线核群、内侧纽核、腹侧背盖核、脚桥背盖核、中脑网状结构、中缝背核以及迷走神经复合体;在线形中缝核、中央上核、腹侧背盖区、黑质,以及延髓中介核,也看到少量标记终末。本工作对卵圆核的传出纤维联系,进行了较全面的观察。

大鼠终纹床核卵圆核的传入联系——FG和WGA-HRP逆行追踪法研究

实验选用雄性Sprague-Dawley大鼠24只,分2组进行。第1组11只,将2～4％的荧光金(fluoro-gold,FG)水溶液加压或电泳导入一侧终纹床核群卵圆核,检查中枢不同区域逆行标记细胞的分布。第2组13只,将WGA-HRP/HRP混合水溶液注入一侧卵圆核,检查逆行标记细胞在不同脑区的分布。比较两组结果,发现所标记的神经元分布范围和趋势大致相同;但FG标记的神经元突起远较HRP标记长,并在对侧某些区域出现标记细胞。这表明作为一种逆行束路示踪剂,FG较WGA-HRP敏感性高。逆行标记细胞主要见于梨状皮质、纹底、海马下托、视前区、斜角带水平支、大细胞视前区、腹侧苍白球;杏仁体的中央核、内侧核、皮质核;丘脑的中线核群、束旁核、室旁核有散在的标记细胞;下丘脑的前区、外侧区、背侧区和腹内核、弓状核、前乳头体核有数量不等的标记细胞;中脑的中央灰质腹侧半、中缝背核、脚桥被盖核、中缝核群和腹侧被盖区、黑质致密带、脚间核、束间核;脑桥的臂旁核、蓝斑、三叉神经中脑核、A_5区、中缝核群;延髓的孤束核/迷走神经背核和C_1/A_1等区域均可看到一定数量的标记细胞。本工作首次较系统地观察了大鼠卵圓核的传入纤维联系。

大鼠终纹床核卵圆核内CRF与NT的共存——相邻切片法研究

实验选用170～210g的雄性Sprague-Dawley大鼠,侧脑室注入秋水仙素80～120μg,48小时后经左心室灌流固定,恒冷箱连续切片,厚5μm,每两个相邻的切片相对应,融表在两组载片上,分别用促肾上腺皮质激素释放因子抗血清(Anti-CRF)和神经降压素抗血清(Anti-NT)孵育,ABC或PAP免疫组织化学反应后,DAB呈色,检查、比较配对切片上免疫反应阳性细胞的位置和形态。结果,在相邻切片上看到卵圆核内有数量不等的位置相同、形态相似的免疫反应阳性细胞,即CRF-NT双标记或两种神经肽共存神经元。本组实验首次发现卵圆核内有CRF-NT共存神经元。

大鼠终纹床核卵圆核的纤维联系——WGA-HRP顺行追踪法研究

Ju和Swanson最近对大鼠终纹床核(BST)进行了细致的研究。根据细胞构筑学特点对其进行了亚核划分并命名。他们的研究结果得到了化学构筑学、发生学以及化学神经解剖学研究资料的支持。在Ju和Swanson划分的前部外侧区,有一个外形呈水滴样的结构被命名为卵圆核(Ov),其纤维联系尚不清楚。本实验选用150—260g的雄性Sprague-Dawley大鼠13只,把WGA-HRP/HRP混合水溶液加压注入一侧Ov区域,冰冻连续切片,TMB法呈色,暗、明视野观察不同平面内顺行标记终末的分布情况。

大鼠终纹床核卵圆核的传入纤维联系—荧光金和WGA-HRP逆行追踪法研究

终纹床核(BST)是边缘系统重要结构之一,参与多种生理功能的调节。BST是一个复杂的非均一性结构,但由于各个实验室对BST的划分、命名不一致,给文献结果的比较和生理活动机理的深入研究带来困难。最近,Ju和Swanson对大鼠BST进行了全面而细致的研究,把前外侧区背部的卵圆形均质结构命名为卵圆核(Ov)。本组实验选用Sprague-Dawley雄性大鼠,把荧光金(FG)和WGA-HRP加压注入一侧Ov,荧光显微镜(紫外线激发)下观察FG逆行标记细胞和明、暗视野下观察HRP逆行标记细胞(TMB法呈色)在中枢神经系统不同平面的分布情况。

激光穴位照射对大鼠束旁核单位伤害性反应的影响

48个束旁核痛敏单位在激光穴位照射后,有16个单位(33.33％)的痛敏放电被明显抑制,13个单位(27.1％)的痛敏放电受到部分抑制,其余19个单位(39.6％)的痛敏放电在激光照射前后未见明显变化。在4个激光照射有明显抑制效应的单位,注射吗啡受体阻断剂纳络酮后,有3个单位的抑制效应被明显削弱;另外1个单位的抑制效应依然存在。在3个痛敏放电不受激光照射影响单位,注射吗啡后只有1个单位的痛敏放电受到明显抑制。

Biocytin在在体脊髓细胞内标记中的应用

细胞内记录脊髓背角神经元之后，将玻璃微电极中的ｂｉｏｃｙｔｉｎ用去极化方波电流导入。切片经ＡＢＣ法孵育，ＤＡＢ呈色。标记细胞呈Ｇｏｌｇｉ样，胞体直径从数μｍ到数＋μｍ不等，形态各异；树突树完整，光滑或有棘；轴空有时可以显示，如出现串珠样轴突终末及侧枝则提示细胞标记完整。上述结果表明，在在体细胞内记录与细胞内标记相结合中，ｂｉｏｃｙｔｉｎ能够完整地显示所记录细胞的形态。特别是在用于标记中、小细胞有其独到之处。

终纹床核

终纹床核是边缘系统的重要结构之一,它参与内分泌、内脏活动及性行为等多种生理功能的调节。终纹床核各个组成部分的形态构筑、纤维联系和免疫组织化学特征均不相同。

神经信息物质

本世纪初,Cajal提出了神经元之间没有原生质联系的观点,即所谓神经元学说(neuronal doctrine)。尽管当时争议颇大,且遭到了Golgi的强烈反对,但随着神经元科学研究手段的发展,这一学说得到了证实。神经元是一个独立的结构与功能单位,彼此之间不连续。神经元之间的信号传递主要发生在特化了的膜结构——突触部位。突触传递的中心环节是必需有神经递质参与;近年来的研究还表明,神经元也能在非突触部位释放所含的神经活性物质,经细胞外液或/和脑脊液扩散,和远隔部位靶细胞上的受体结合,产生特异的生物学效应。

大鼠中央杏仁核内M-ENK和CCK免疫阳性神经元投射到终纹床核卵圆核——荧光金逆行标记结合免疫荧光双标记法研究

我们最近把荧光金(FG)和WGA-HRP注入雄性Sprague-Dawley大鼠一侧卵圆核(Ov),在中央杏仁核(Ce)等许多核团看到了大量逆行标记细胞。为了了解Ce至Ov投射神经元的化学性质,本组实验把FG逆行束路追踪法和间接免疫荧光法相结合,进行双标记法研究。实验选用雄性Sprague-Dawley大鼠,把FG注入一侧Ov区域,动物存活3~4天,常规方法灌注、取材,冰冻冠状连续切片,厚40μm。荧光显微镜下(紫外线激发)选择注射部位准确,且Ce内有较多FG标记细胞的切片进行免疫荧光反应,即先用M-ENK或CCK兔血清孵育,4℃2~3天;再用F1TC结合的羊抗免IgG孵育,37℃30—40分钟,荧光显微镜下观察结果。

大鼠中央杏仁核-卵圆核投射神经元的免疫细胞化学特征——荧光金逆行追踪结合免疫荧光双标记法研究

本实验用雄性Sprague-Dawley大鼠,全身麻醉下将荧光金水溶液注入一侧终纹床核群卵圆核区域,在同侧中央杏仁核看到大量逆行标记细胞。将此切片分别用促肾上腺皮质激素释放因子、神经降压素、甲-脑啡肽和胆囊收缩素抗血清孵育,再用FITC结合的羊抗兔IgG温育,结果在中央杏仁核范围内,看到数量不等的荧光金逆行标记细胞,分别被上述4种神经肽免疫血清标记。本组实验结果表明,中央杏仁核有上述4种肽能神经元投射到终纹床核群的卵圆核区域。

大鼠前连合核神经元对渗透压和血管紧张素Ⅱ刺激的神经性反应——脑片电生理研究

在大鼠下丘脑离体脑片上,用电生理细胞外记录法研究了前连合核神经元的放电频率及其波形。实验观察到的前连合核自发放电神经元有不规则或规则的连续性放电活动,少数神经元有短阵性放电或不放电。这些神经元中的绝大部分可因脑片浸浴液中给予血管紧张素Ⅱ而被兴奋(放电频率增加),约1/3—1/2神经元对高渗透压刺激呈抑制性反应(放电频率减少),也有少数神经元可因高渗透压刺激而兴奋或无反应。前连合核的这些电生理特性大致与视上核、室旁核相似,也有一些与视上核、室旁核不同之处。对记录后的脑片进行组织化学及免疫组织化学染色的结果表明,记录部位在前连合核内,该部位有许多催产素样免疫阳性社经元。上述研究结果提示:前连合核的大细胞神经分泌神经元在水平衡的调节中起重要作用。

用免疫组织化学方法显示电生理记录部位神经元的化学性质——离体脑片法研究

500μm厚的冠状脑片取自新鲜大鼠下丘脑前部。在人工孵育条件下进行电生理观察,看到前连合核和第三脑室前部室周区部分神经元的电活动可被人工脑脊液中加入血管紧张素Ⅱ所兴奋,被提高人工脑脊液中的Ca^(++)浓度所抑制。这些电生理反应与大细胞内分泌神经元的电生理特性一致。记录结束时,记录部位用记录电极中的染料标记,脑片浸泡固定4—8h,恒冷箱切片,用抗催产素和抗加压素抗体孵育,ABC反应。结果在记录电极尖端所在部位看到数量不等的催产素或加压素免疫阳性神经元。上述电生理和免疫组化结果表明,研记录到的部分神经元可能含催产素或加压素免疫反应物质。本文报告了用免疫组织化学方法显示离体电生理标本,特别是记录部位神经元的免疫化学特性的实验结果。

卵圆核内促肾上腺皮质激素释放因子和神经降压素免疫反应阳性神经元向后部下丘脑外侧区投射——荧光金逆行追踪结合免疫荧光双标记法研究

本实验选用雄性Sprague-Dawley大鼠15只,分为3组。第1组5只,将3％荧光金水溶液注入一侧不同平面下丘脑外侧区,检查终纹床核群内逆行标记细胞的分布;第2组3只,免疫酶和免疫荧光法检查终纹床核群卵圆核内促肾上腺皮质激素释放因子和神经降压素免疫阳性神经元的分布;第3组7只,选卵圆核内有逆行标记的切片,进行免疫荧光反应。结果发现,只有当示踪剂注入后部下丘脑外侧区时,卵圆核区域才出现较多的逆行标记细胞。免疫荧光法显示的两种肽能神经元的分布与免疫酶法相似;卵圆核内的逆行标记细胞,有的是促肾上腺皮质激素释放因子免疫阳性,也有的是神经降压素免疫阳性。本实验发现终纹床核群卵圆核内有上述两种肽能神经元投射到后部下丘脑外侧区。

在离体电生理研究标本上进行神经元局部回路追踪

实验在完成电生理记录的离体脑片上完成。用电泳法向记录部位导入麦芽凝集素结合的辣根过氧化物酶(WGA-HRP)或荧光金(FG),在和电生理记录相同的条件下孵育脑片8-12h,浸泡固定后做冰冻切片,常规TMB染色,光镜明、暗视野观察,或直接用荧光显微镜观察。在导入示踪剂周围可看到明确的逆行标记细胞和顺行标记纤维与终末。WGA-HRP和FG标记物全电泳中心最远距离,分别达2cm和500μm以上。结果表明,用常规神经解剖学方法可以在离体脑片上显示电生理记录部位神经元局部联系回路。

卵圆核内CRF和NT免疫反应阳性神经元向中央杏仁核投射——荧光金逆行追踪结合免疫荧光双标记法研究

用雄性Sp:ague-Dawley大鼠14只,分两组。第一组6只,将荧光金(FG)注入杏仁复合体,检查终纹床核群范围内逆行标记细胞的分布。结果发现,只有在FG注射到中央杏仁核(Ce)的动物,卵圆核(Ov)内才出现较多的标记细胞。第二组8只,选FG注入Ce且Ov有较多标记细胞的切片,分别用抗促皮质激素释放因子(Anti—CRF)和抗神经降压素(Anti—NT)兔血清孵育,冉用FITC—IgG(羊抗兔)血清温育,结果发现,Ov内的FG标记细胞中,部分亦呈现CRF或NT免疫反应阳性。结果提示,Ov内有CRF和NT能神经元投射到Ce。

大鼠海马脑中枝形吊灯样中间神经元的形态与电生理学特征

在大鼠海马脑片标本上，用微电极记录并标记了４个校形吊灯样中间，约占所记录到的３９个中间神经元的１０％。与蓝状中间神经元显著不同之处是，这４个神经元均对细胞内去极化电流表现出不同程度的放电频率适应现象。用细胞内注射ｂｉｏｃｙｔｉｎ的方法证实，蓝状中间神经元轴突终末主要分布在锥体和颗粒细胞层，与这些细胞胞体形成接触；而４个枝形吊灯样中间神经元的轴突终末均高度选择性地分布在锥体和颗粒细胞轴突始段区。上述结果表明，枝形吊灯样中间神经元在形态和电生理方面均与蓝状中间神经元不同，它属于中间神经元的一个特殊类型。

Biocytin,一种新型细胞内示踪剂

Biocytin是生物素与赖氨酸的复合物,分子量为373,大约是辣根过氧化物酶的百分之一。分子量小和含生物素使得此化合物容易通过高阻抗玻璃微电极注入所记录的神经元内,并用常规的ABC方法显示。本实验在大鼠离体脑片上进行。将Biocytin泳入完成电生理观察的不同海马神经元内,ABC孵育,DAB呈色。结果看到,锥体细胞和颗粒细胞,被Biocytin显示呈Golgi样标记,中间神经元被Biocytin标记的轴突终末广泛而密集,其效果明显优于当前广泛用于细胞内标记的辣根过氧化物酶和Lucifer yellow。

大鼠下丘脑到脊髓的直接纤维投射——WGA-HRP法研究

实验用28只170~285g SD大鼠。将WGA-HRP/HRP混合液注入颈、胸、腰及骶髓的一侧灰质。在下丘脑看到大量非均一性标记细胞。呈双侧分布,同侧较多;随着注射部位从头端向尾端移动,标记数量明显地递减。标记细胞以室旁核、下丘脑外侧区最为密集;视交叉后区、穹窿周核及未定带次之;下丘脑内侧区、室周核、背部下丘脑和后部下丘脑只有散在标记细胞;弓状核和视前区只有个别标记细胞。与文献相比,本实验表明,室旁核内的脊髓投射神经元并不局限于小细胞区,大细胞区也有较多分布;视上核和视交叉上核可能不直接投射到脊髓。