琼脂糖凝胶电泳及SSCP法在淋巴瘤克隆性TCRγ基因重排检测中的应用

目的比较琼脂糖凝胶电泳和单链构象多态性分析(SSCP)法对淋巴瘤克隆性T细胞受体(TCR)γ基因重排的检测结果,探讨TCRγ基因重排的有效检测方法。方法从T、B细胞淋巴瘤及反应增生性淋巴组织中提取DNA,分别用两组TCRγ基因重排通用引物进行PCR扩增,扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳和SSCP。结果T、B细胞淋巴瘤均出现克隆性TCRγ基因重排。SSCP法两组PCR产物在T细胞淋巴瘤中的阳性率分别为77.6%和75.9%,B细胞淋巴瘤均为10%;与SSCP相比,琼脂糖凝胶电泳中两组PCR扩增产物的假阳性率分别为15.3%和14.4%,所有反应增生性淋巴组织均出现假阳性。结论T、B细胞淋巴瘤中都存在克隆性TCRγ基因重排,仅用琼脂糖凝胶电泳检测可能出现假阳性,SSCP灵敏性较高。

2种电泳在淋巴瘤TCR-γ基因重排研究中的应用

目的 探讨不同电泳方法在淋巴瘤T细胞受体γ(TCR γ)基因重排研究中的应用及其意义。方法 在聚合酶链式反应 (PCR )中采用T细胞受体γ基因重排通用引物 ,对 3 0例T细胞淋巴瘤和 3 0例B细胞淋巴瘤组织扩增 ,并采用琼脂糖凝胶电泳和单链构型多态性分析实验对扩增产物进行研究。结果 2 9例T细胞淋巴瘤扩增产物在琼脂糖电泳中为阳性 ,其中 2 7例在SSCP分析实验中为阳性。 16例B细胞淋巴瘤在琼脂糖电泳中为阳性 ,其中 3例在SSCP分析实验中阳性。所有在琼脂糖电泳中阴性的PCR产物在SSCP分析实验中也为阴性。在琼脂糖电泳中真阳性与假阳性条带有差异。结论 在TCR γ基因重排扩增产物分析中 ,琼脂糖凝胶电泳可能产生假阳性结果 ,但无假阴性 ;琼脂糖凝胶电泳中的假阳性可在SSCP实验中排除。 2种电泳方法同时应用 ,可以减少工作量 。

降落式PCR和SSCP检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体γ基因重排

目的以降落式PCR和单链构型多态性(SSCP)方法检测淋巴细胞白血病单克隆T细胞受体(TCR)γ基因重排,探讨其在淋巴细胞白血病诊断中的价值。方法盐析法提取淋巴细胞白血病患者外周血白细胞DNA,TCR-γ基因重排通用引物和降落式PCR扩增基因重排。分别采用琼脂糖凝胶电泳、SSCP和DNA直接测序方法检测PCR扩增产物。阳性细胞系DNA模板与反应增生性淋巴组织DNA按不同比例混合后扩增,检测降落式PCR的灵敏度。结果琼脂糖电泳中,18例T淋巴细胞白血病中有15例、4例B淋巴细胞白血病中有2例为阳性,阳性标本经SSCP进一步分析,呈不连续条带。DNA直接测序证实扩增产物为TCR-γ基因重排。阳性对照模板占1%以上时可得到阳性扩增结果。结论TCR-γ基因重排通用引物结合降落式PCR可有效扩增T淋巴细胞白血病基因重排,可用于T淋巴细胞白血病的辅助诊断。

淋巴瘤克隆性TCRγ基因重排的多重引物分析

目的探讨TCRγ多重引物检测淋巴瘤克隆性基因重排的功效及意义。方法引物分为两组扩增淋巴瘤DNA,PCR产物用于琼脂糖电泳和单链构象多态性分析(SSCP)检测。结果两组多重引物PCR的阳性率高于通用引物阳性率;B细胞淋巴瘤组织中存在一定比例克隆性TCRγ基因生重排;部分淋巴瘤中存在两种TCRγ基因重排。结论多重引物和降落式PCR适于淋巴瘤TCRγ基因重排研究,可提高检出率、判断淋巴瘸组织中不同TCRγ基因重排情况;SSCP可排除假阳性。

Jurkat细胞株TCRγ基因重排及多重引物扩增分析

目的分析Jurkat细胞株TCRγ基因重排特点,观察多重引物PCR扩增Jurkat细胞株TCRγ基因重排的效果。方法 TCRγ基因重排正向、反向引物配对组合,分别扩增Jurkat细胞株DNA,阳性PCR产物测序并比对分析;多重引物组合、降落式PCR扩增Jurkat细胞株TCRγ基因重排,比较多重引物与单对引物扩增效果。结果两组单对引物扩增产物电泳出现强阳性条带,测序并比对证实为TCRγ基因重排;与胚系基因比对发现,重排后TCRγ基因存在删除和增加的碱基序列;多重引物扩增产物中出现阳性条带的组合,其引物与单对引物组合一致。结论 Jurkat细胞中存在两种不同的TCRγ基因重排,重排序列体现了基因重排多样性。多重引物结合降落式PCR扩增TCRγ基因重排,扩增效果与单对引物一致。

端粒酶反义脱氧核苷酸与多糖对HL-60细胞的影响

目的 研究人类端粒酶反义脱氧核苷酸及其与梁金菇多糖协同作用对HL 6 0细胞凋亡及端粒酶活性的影响。方法 端粒酶反义脱氧核苷酸单独或与梁金菇多糖协同处理HL 6 0细胞后 ,分别用涂片法、流式细胞仪法和电镜检测两种药物处理后对细胞凋亡的影响 ,以TRAP Elisa法检测对端粒酶活性的影响。结果 端粒酶反义核酸单独或与梁金菇多糖协同处理HL 6 0均可提高细胞的凋亡率并抑制端粒酶活性 ,两者协同处理效果更显著。结论 端粒酶反义核酸可降低细胞的端粒酶活性并诱导细胞调亡 ,梁金菇多糖则可加强这种作用。

非霍奇金淋巴瘤365例WHO新分类的临床病理分析

目的 探讨广东地区非霍奇金淋巴瘤的临床病理特征。方法 按照WHO恶性淋巴瘤新分类诊断标准对广东地区 3家医院 36 5例NHL进行重新分类。从患者的年龄、性别、部位、免疫标记、基因重排检测、病理诊断 6个方面进行统计学分析。结果 36 5例NHL中 ,结内 14 1例 ,结外 2 2 4例 ;在 2 2 4例结外淋巴瘤中 ,最常见的部位依次是消化道、鼻腔、颅内 ;B细胞淋巴瘤 2 71例 ,T细胞淋巴瘤 92例 ,非T非B淋巴瘤 2例 ;113例B细胞淋巴瘤IgH基因重排检测 ,阳性率为 82 3% ;4 5例T细胞淋巴瘤TCRγ基因重排检测 ,阳性率为 91 1%。在B细胞淋巴瘤中 ,最常见的依次是弥漫性大B细胞淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织型边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤。在 92例T细胞淋巴瘤中 ,最常见的是周围T细胞淋巴瘤。结论 广东地区结外淋巴瘤的比率超过结内 ,T细胞淋巴瘤的发病率较西方国家高 。

三氧化二砷诱导人类恶性淋巴瘤细胞凋亡及机制探讨(英文)

目的研究三氧化二砷(As2O3)在体外对人类伯基特氏淋巴瘤细胞凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法分别采用来源于人类伯基特氏淋巴瘤的EB病毒阳性细胞Raji和EB病毒阴性细胞BJAB为模型,利用细胞形态学检测、DNA凝胶电泳和蛋白质Western blotting分析等方法,从细胞形态、DNA水平和蛋白质水平探讨As2O3诱导恶性淋巴瘤凋亡及作用机制。结果分别采用2, 5和10 mol/L的As2O3与Raji和BJAB细胞作用24 h后,DNA凝胶电泳证实As2O3通过诱导细胞凋亡而抑制细胞的增殖。BJAB和Raji细胞对应于上述浓度As2O3的凋亡率分别47.6%±4.8% (Mean±SD, n=3), 66.4%±5.1% , 87.0%±7.3% 和35.5%±3.8%, 51.5%±6.2%, 62.2%±7.9,BJAB细胞对As2O3的敏感性要高于Raji细胞(P<0.05)。Western blotting蛋白质检测表明,As2O3通过下调抗凋亡蛋白Bcl-xL的表达和激活凋亡分子caspase-3诱导细胞凋亡。结论As2O3通过下调Bcl-xL蛋白的表达和激活caspase-3诱导人类恶性淋巴瘤细胞的凋亡;本研究可望为临床应用砷剂治疗恶性淋巴瘤提供实验依据。

肠病型T细胞淋巴瘤临床分析(附5例报道)

背景:肠病型T细胞淋巴瘤(ETCL)是一种临床少见、预后差的疾病,了解其临床病理特征对诊断和治疗有重要的临床意义。目的:通过分析ETCL患者的临床表现、病理改变和分子生物学特征及其与EB病毒(EBV)感染的关系,提高临床医师和病理医师对ETCL的认识,以期改善患者的生存率。方法:回顾我院2001年7月～2004年1收治的5例ETCL患者的内镜活检或手术切除标本的临床和组织病理学表现;采用免疫组化方法标记CD45RO、CD3、CD56、CD20、CD79α、CD68、Lys;采用聚合酶链反应(PCR)检测EBV感染和T细胞受体(TCR)-γ基因重排情况。结果:5例ETCL患者均无肠病史,多发生于青年男性,4例发病年龄为24～38岁,病程进展迅猛,确诊后4个月内死亡。病变多发生于结肠和小肠,1例与胃部同时发生,均为多发性溃疡性病变。肿瘤细胞为多形性T细胞,组织学形态为多形性淋巴细胞弥散分布,有血管中心性浸润,淋巴上皮病变,大片或多灶性坏死为特征。5例患者肿瘤组织CD45RO和TCR-γ基因重排均为阳性,1例CD56阳性且EBV阳性。结论:ETCL多发生于青年男性,临床症状多无特异性,病程发展迅猛,预后差,病损肠管表现为多发性溃疡,TCR-γ链克隆性重排,多数为自然杀伤(NK)样T细胞淋巴瘤和外周T细胞淋巴瘤非特殊型;有EBV感染的ETCL为NK样T细胞淋巴瘤。

姬松茸多糖抗肿瘤的实验研究

应用细胞培养技术 ,观察了姬松茸多糖对K5 6 2和HL - 6 0细胞系的影响。研究结果表明 ,实验组活细胞数、集落形成明显减少 ,荧光显微镜下所见凋亡细胞显著增加。提示姬松茸多糖具有抗肿瘤效果。为了探讨姬松茸多糖抗肿瘤的机理 ,本实验还应用反义寡聚脱氧核糖核酸技术 ,进一步观察了姬松茸多糖与人端粒酶反义核酸协同诱导HL - 6 0细胞系凋亡的作用 ,实验结果表明 ,姬松茸多糖与反义寡核苷酸联合使用 ,可促进HL- 6 0细胞凋亡。

IgH和IgL引物联合检测对提高石蜡组织淋巴瘤基因重排检出率的价值

背景与目的:通过聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)扩增免疫球蛋白重链(immunoglobulinheavychain,IgH)基因对其克隆性的检测,可以辅助诊断淋巴瘤。缺点是假阴性率较高,在石蜡包埋组织中尤为明显。本研究拟采用手工显微切割、免疫球蛋白重链和轻链(immunoglobulinlightchain,IgL)联合测定等方式,探讨该方法在石蜡包埋组织中非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin\slymphoma,NHL)诊断中的价值。方法:选用1对IgH引物、1对T细胞受体γ(Tcellreceptorγ,TCRγ)、TCRγ引物、2对新设计的轻链引物,通过PCR、琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染技术,检测经形态学及免疫组织化学确诊的58例石蜡包埋组织标本,包括39例B细胞淋巴瘤、16例T细胞淋巴瘤和3例淋巴结反应性增生组织。以DG75和Jurkat淋巴瘤细胞系DNA作为对照。结果:IgH引物P1在39例B细胞淋巴瘤检出阳性率79.5%(31/39),假阳性率6.25%(1/16),IgL引物在B细胞淋巴瘤检出阳性率71.8%(28/39),假阳性率12.5%(2/16),经统计学分析二者检出率无显著性差异(P>0.05)。二者联合检测,B细胞淋巴瘤阳性检出率可以达到92.3%,假阳性率并无明显提高(12.5%)。以上重排引物在反应性增生淋巴结组织中均未检出。结论:IgH与IgL引物联合检测可明显提高石蜡包埋组织中B细胞淋巴瘤的检出率,并为B-NHL的诊断及鉴别诊断提供了有效的辅助手段。

Hsa-miR9在伯基特淋巴瘤EBV^(+/-)细胞中的差异表达及其与BCL-6调控的关系

目的探究hsa-miR9在伯基特淋巴瘤细胞株EBV^+Raji/EBV-Ramous中差异表达及其与BCL-6的关系。方法荧光定量PCR检测hsa-miR9和BCL-6在EBV^+Raji和EBVRamous细胞中的表达;利用Oligofectamine 2000脂质体法将化学合成的hsa-miR9-inhibitor和随机序列转染高表达hsa-miR9的EBV^+Raji细胞(Raii-miR9-inhibitor组和Raji-CON组),hsa-miR9-mimics和相应的随机序列转染低表达hsa-miR9的EBVRamous细胞(Ramous-miR9-mimics组和Ramous-CON组);运用实时荧光定量PCR、Western blotting检测转染前后BCL-6的表达,AnnexinV/PI双染色法检测细胞凋亡率和观测凋亡细胞形态。结果 hsa-miR9和BCL-6在EBV^+Raji细胞的表达水平显著高于EBVRamous细胞(P<0.01);EBV^+Raji细胞经转染hsa-miR9-inhibitor 48 h后,BCL-6基因和蛋白水平的表达量均降低,而EBVRamous细胞经转染hsa-miR9-mimics 48 h后,BCL-6基因和蛋白水平的表达量均升高,与相应的随机序列组相比均有显著性差异(P<0.05);转染48 h后Raji-miR9-inhibitor组凋亡率明显低于Raji-CON组,Ramous-miR9-mimics组凋亡率明显高于Ramous-CON组,差异具有统计学意义(P<0.05);Raji-CON组和Ramous-miR9-mimics组可见明显凋亡细胞。结论 hsa-miR9正向调控伯基特淋巴瘤细胞株EBV^+Raji/EBVRamous细胞BCL-6的表达和凋亡。

石蜡淋巴瘤组织中IgH FR3区基因重排引物分析

目的利用生物信息学方法分析免疫球蛋白重链(IgH)框架区(FR3)基因重排引物并探讨其在石蜡包埋非霍奇金淋巴瘤(NHL)组织中应用价值。方法通过ClustalW软件比较44条有效的IgH可变区和6条J区的基因片段,选取IgHFR3区3对(P1,P2,P3)基因重排引物,其中,P2为改进的引物。另选一对TCRγ引物作为T细胞淋巴瘤重排引物,通过PCR扩增,检测经形态学及免疫组织化学确诊的144例石蜡包埋组织标本,包括113例B细胞淋巴瘤、24例T细胞淋巴瘤和7例淋巴结反应性增生组织。以DG75淋巴瘤细胞系DNA作为对照组。结果引物对P1、P2、P3在B细胞淋巴瘤检出阳性率分别为71.7%(81/113),82.3%(93/113)和76.1%(86/113),三者检出率差异无统计学意义;在T细胞淋巴瘤检出率分别12.5%(3/24)、12.5%(3/24)、16.7%(4/24)。将P1和P2引物组合分析,B细胞淋巴瘤阳性检出率可以达到92.3%。以上重排引物在7例反应性淋巴结中均未检出。结论3对IgHFR3区中,新改进的P2引物在B细胞淋巴瘤中的检出率最高(82.3%)。2对IgHFR3区引物联合检测可明显提高石蜡组织中B细胞淋巴瘤的检出率。

PCR试验加样过程中无DNA原则控制污染的探讨

目的 探究在PCR操作过程中如何预防污染的一些基本操作方法。方法 首先制定了PCR操作过程中的无DNA原则 ,对实验室的划分 ,操作总原则 ,Eppendorf管开、关 ,有螺旋的离心管开、关 ,装有反应体系Eppendorf管的放置 ,标记反应管的操作 ,移液器的使用方法等进行规范化 ,最大限度地避免DNA污染反应体系。然后通过扩增新鲜扁桃体组织中珠蛋白基因及模拟手套被质粒污染的情况下扩增质粒基因 ,验证该无DNA操作过程对避免污染的有效性。结果 按本实验的规范方法进行操作 ,所有阴性对照均未出现假阳性。结论 采用这种无DNA原则进行PCR操作 ,是控制反应体系污染的一种有效方法。

CD99基因转染对霍奇金淋巴瘤L428细胞株表型、细胞周期与凋亡的影响

目的:观察CD99基因转染对霍奇金淋巴瘤L428细胞株表型、细胞周期与凋亡的影响。方法:L428细胞分为3组:转染CD99基因组、转染空质粒组及空白对照组。采用免疫细胞化学方法检测3组细胞CD15、CD30与CD99的表达,并用流式细胞术分别检测细胞周期和细胞凋亡。结果:与其他2组相比,转染CD99基因组L428细胞CD15、CD30表达消失,但可检测到CD99的表达。3组细胞周期分布存在差异,转染CD99基因组细胞阻滞于G2/M期(F=24.85,P<0.001)。3组细胞凋亡率相比,差异有统计学意义(F=45.30,P<0.001),其中转染CD99基因组细胞凋亡率为(12.7±4.6)%,高于转染空质粒组的(4.0±0.9)%和空白对照组的(3.6±1.6)%(P<0.05)。结论:CD99基因可能在霍奇金淋巴瘤的发生中起重要作用。

siRNA特异性沉默septin2基因抑制大肠癌LoVo细胞迁移

目的:检测新型骨架蛋白septin 2在不同转移能力的人结直肠癌细胞株中的表达水平,探究其在结直肠癌细胞迁移中的作用。方法:采用实时荧光定量RT-PCR及Western blotting检测septin 2基因及其蛋白在高转移潜能细胞株LoVo和低转移潜能癌细胞株HT-29、SW480、HCT-116中的表达;用siRNA干扰方法沉默高表达的septin 2基因,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效率,免疫荧光共聚焦实验观测干扰前后septin 2蛋白表达的变化,划痕实验检测干扰前后细胞的迁移能力。结果:septin 2在LoVo细胞的表达水平显著高于HT-29、SW480及HCT-116细胞(P<0.05)。沉默septin 2基因后,LoVo细胞septin 2 mRNA表达降低(P<0.05);septin 2与纤维状肌动蛋白(F-actin)存在共表达;F-actin表达减弱,应力纤维减少,片状伪足细而短;细胞迁移能力减弱。结论:septin 2基因在LoVo细胞高表达,干扰其表达能导致细胞骨架重构,从而降低细胞迁移能力。

血清人附睾蛋白4在卵巢癌诊断中的作用

目的:探讨血清人附睾蛋白4(HE4)在卵巢癌诊断中的作用。方法:随机选取因"卵巢肿瘤"拟行手术的患者,经筛选后纳入54例作为研究对象,以ELISA法测定各例术前血清中HE4的水平和卵巢癌患者术前、术后血清中HE4的水平变化。结果:卵巢癌患者术前的血清HE4水平为(298.43±167.31)pmol/L,高于卵巢良性肿瘤组的血清HE4水平(74.76±43.29)pmol/L和正常对照组的血清HE4水平(69.86±41.55)mol/L,差异有统计学意义(P<0.05)。卵巢癌术后1个月血清HE4水平为(87.63±39.96)pmol/L,较术前明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。血清HE4在卵巢癌中的诊断阳性预测值为86.96%、阴性预测值为80.65%、敏感性为76.92%、特异性为89.3%。结论:血清HE4在上皮性卵巢恶性肿瘤中明显升高,且特异性较高,可将其应用于上皮性卵巢良、恶性肿瘤鉴别和术后病情的监测。

霍奇金淋巴瘤潜伏膜蛋白1、p53及bcl-2蛋白的表达及意义

目的探讨EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)、p53、bcl-2的蛋白表达在霍奇金淋巴瘤(HL)致病机制中的作用及其意义。方法对收集的31例石蜡包埋的HL组织进行LMP1、p53、bcl-2蛋白免疫组化染色。结果LMP1、p53、bcl-2的阳性率分别为58.1%、61.3%、35.5%。LMP1与p53相关性分析具有统计学意义。结论p53可能参与LMP1在HL致病机制中的作用,bcl-2可能与HL的致病关系不大。

mic2/CD99基因克隆及在霍奇金淋巴瘤L428细胞株中表达

目的克隆mic2/CD99基因并表达于L428细胞株。方法通过PCR及双酶切方法,从Jurkat细胞基因组RNA中获得mic2/CD99全长基因编码序列,克隆到pcDNA3.1(+)质粒载体上,构建包含mic2/CD99全长基因载体;用脂质体转染法将mic2/CD99全长基因载体转染至L428细胞系;并从分子水平验证其存在。结果RT-PCR方法扩增出大小为558bp片段,序列测定其编码序列正确,酶切鉴定亚克隆序列正确。结论成功构建了mic2/CD99全长基因载体,并稳定转染于L428细胞株中。