猪非典型瘟病毒广西流行株的鉴定与遗传进化分析

为了解猪非典型瘟病毒(APPV)广西流行株的遗传进化特点,本研究从广西3个地区共采集23份患先天性震颤(CT)症状的新生仔猪脑、肝脏、脾脏、肾脏等组织样品,采用荧光定量RT-PCR (RT-q PCR)检测APPV,经RT-PCR分段扩增APPV阳性样品的全基因组序列,结果显示,检出18份APPV阳性样品,RT-PCR分段扩增并经测序拼接后共获得4条APPV广西流行株全基因组序列,结合Gen Bank登录的共有9条APPV广西流行株全基因组序列,采用BLAST及Bio Edit软件分析APPV广西流行株全基因组序列的相似性;利用Mega 7.0软件绘制ORF、N^(pro)、E^(rns)及E2基因的系统发育树;通过Bepipred 2.0软件预测APPV囊膜糖蛋白E^(rns)、E2蛋白的线性抗原表位;利用Net NGlyc 1.0在线软件预测APPV E^(rns)、E2蛋白N-糖基化位点;利用RDP5和Sim Plot软件分析APPV广西流行株全基因组的重组性。相似性结果显示,9条APPV广西流行株全基因组序列与Gen Bank中APPV流行株全基因组序列的相似性最高为89.9%~99.8%,且这些流行株分别来源于河北、湖北、湖南、四川、广西及广东等地;APPV广西流行株之间及与国内外APPV参考株全基因组序列的相似性分别为79.4%~99.6%及77.1%~98.3%,表明APPV广西流行株基因组进化来源广泛且复杂,并且APPV广西流行株之间的差异较大。遗传进化分析显示,ORF系统发育树分为3个基因型,APPV广西流行株GX01-2019属于I-2基因亚型,GX02-2018株属于I-3基因亚型,GX02-2019株属于Ⅱ基因型,其余则属于I-1基因亚型,N^(pro)、E^(rns)、E2基因的系统发育趋势与ORF基本一致。表明APPV广西流行株以I基因型为主,且无时间地域分布特点,并具有生物遗传多样性特征;抗原表位和N-糖基化位点预测结果显示,E^(rns)蛋白主要含aa7~aa14、aa24~aa36、aa39~aa66等7个抗原表位,E2蛋白主要含aa5~aa9、aa16~aa25、aa35~aa111等5个抗原表位;APPV广西流行株E^(rns)蛋白N-糖基化位点分别为^(12)NSTG^(15)、^(43)NETI^(46)及^(64)NYTC^(67),E2蛋白N-糖基化位点分别为51NG(D或E)S(T)L54和64NTSS(I)67;重组分析结果显示,广西流行株APPV_China/GX-WZ/2017有重组信号,主要亲本为广西GX01-2018株,二者相似性为99.7%,次要亲本为韩国的KU16-2株,二者相似性为100%。本研究为广西地区APPV分子流行病学研究和遗传进化分析提供了基础数据。

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的原核表达、纯化及鉴定

【目的】通过原核表达及纯化获得A型口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1,为建立A型FMDV的ELISA诊断方法及开发安全、高效、广谱的新型基因工程疫苗提供技术支持。【方法】以含A型FMDV VP1基因的重组质粒p MD18-T-A-VP1为模板,通过特异性引物扩增A型FMDV的VP1基因,构建表达质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入感受态细胞E.coli BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白。【结果】诱导表达获得的VP1融合蛋白主要以包涵体形式存在,分别经His·Bind和GST·Bind柱层析纯化,SDS-PAGE分析结果表明融合蛋白纯度较高;Western blotting检测分析发现,VP1融合蛋白能与豚鼠抗A型FMDV阳性血清发生特异性结合,但不与豚鼠抗O型和Asia1型FMDV阳性血清反应。【结论】经原核表达及纯化获得的A型FMDV VP1融合蛋白具有良好的特异性和抗原性,可用于易感动物的免疫及血清抗体筛查。

广西H3N8亚型马流感病毒耐药性分析

【目的】了解广西H3N8亚型马流感病毒(Equine influenza virus,EIV)对抗流感病毒药物的耐药性,为临床科学用药提供参考。【方法】采用RT-PCR对广西H3N8亚型EIV分离株A/Equine/Guangxi/1/09(简称GX09株)进行M基因和NA基因扩增,测序分析M2基因和NA基因特征及其与耐药性相关的氨基酸位点,并进行生物学耐药性试验。【结果】GX09株M2基因的相关耐药性位点(L26F、V27A、A30T、S31N、G34E)均未发生变异;在NA基因相关耐药性位点方面,也仅在S247A位点处出现氨基酸替换,其他位点均较保守,未出现氨基酸替换。生物学耐药性试验结果表明,GX09株对金刚烷胺敏感,对奥司他韦已产生耐药性。【结论】广西目前流行的EIV对金刚烷胺敏感,在流感易发季节仍可选用烷胺类药物对广西地区的马流感进行预防和治疗。

H1N1猪流感病毒广西分离株HA基因序列分析

【目的】了解H1N1猪流感病毒广西分离株的分子特征,为广西猪流感疫情监控提供参考依据。【方法】采用RT-PCR对2011年分离获得的H1N1猪流感病毒广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）的HA基因进行扩增,然后利用DNASTAR分析软件对测序基因片段进行整个阅读框架的核苷酸序列及其推导氨基酸序列同源性比对分析,并用MEGA4.0绘制遗传进化树。【结果】广西分离株HA基因长1701bp,编码566个氨基酸,核苷酸序列与经典SIV的同源性为88.0%~99.6%,与季节性H1N1人流感病毒的同源性为76.3%~77.3%,与欧洲类禽SIV分离株的同源性为72.9%~75.4%,与2009甲型H1N1流感病毒的同源性为99.2%~99.6%;从核苷酸遗传进化树可知,广西分离株与类禽H1N1流感病毒和人H1N1流感病毒分离株的亲缘关系较远,而与2009甲型H1N1流感病毒分离株的亲缘关系最近。广西分离毒株HA基因的裂解位点序列为IPSIQSR↓G,具有典型低致病性流感病毒的分子生物学特征;共有8个糖基化位点,其中6个位于HAl区,两个位于HA2区;广西分离株HA蛋白RBS位点的氨基酸同时具有人和猪流感病毒的特点。【结论】广西分离株（A/swine/Guangxi/1/2011）属于2009甲型H1N1流感病毒。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA检测方法的初步建立

用纯化的融合蛋白p GEX-6p-1-VP1作为包被抗原,4E12单抗为检测抗体与待检血清竞争固相抗原,建立了单抗竞争ELISA方法来检测口蹄疫A型抗体,并进行了反应条件的优化,确定阴阳临界值。结果表明,抗原最适包被浓度为0.625μg/m L,待检血清稀释度为1∶2,单抗最大稀释度为1∶400,酶标抗体工作浓度为1∶5000,封闭液、待检血清和单抗作用时间分别为60、60、45 min;阴阳性判断抑制率(PI)≥30%为阳性。与液相阻断ELISA检测试剂盒比对,符合率为84.8%。试验表明,建立的单抗竞争ELISA检测方法具有特异性强、稳定性好等优点,可用于口蹄疫A型血清抗体的检测,这为口蹄疫A型免疫抗体水平检测、疫情监控及流行病学调查提供了技术平台。

A型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了深入了解VP1蛋白的结构和功能,并建立A型口蹄疫(FMD)血清抗体检测方法,试验采用纯化的重组蛋白p ET-32a-VP1免疫Balb/c小鼠,以纯化的重组蛋白p GEX-6p-1-VP1作为检测抗原包被酶标板检测抗体效价。将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合,其杂交瘤细胞用间接ELISA法进行筛选,获得4株能稳定分泌抗口蹄疫病毒(FMDV)结构蛋白VP1的特异性杂交瘤细胞株,分别命名为1D10、3D12、4E12和5G7。结果表明:这4株单克隆抗体均为Ig M亚型和κ轻链,单克隆抗体间可能识别同一个表位,或表位重叠性大。4株单克隆抗体均能被A型FMDV阳性血清所阻断,具有特异性,且以单克隆抗体4E12产生的抗体效价最高、稳定性强、亲和力最大,并能与重组蛋白FMDV-A-VP1特异性结合。说明单克隆抗体4E12可作为单克隆抗体竞争ELISA法的竞争抗体用于检测A型FMDV血清抗体。

规模猪场猪瘟免疫抗体监测和效果分析

当前,我国防控猪瘟的主要手段仍然以100%高密度免疫为主,实践中猪瘟免疫失败现象也时有发生。因此,了解猪场猪瘟免疫抗体的现状,对该病的防控提供依据具有重要的意义。本试验通过对不同规模猪场不同日龄猪群的猪瘟抗体水平进行监测,对当前的猪瘟免疫效果进行调查,供各位养殖户参考。1材料与方法1.1血清由南宁、百色、崇左、桂林4个市的17个猪场提供。

规模猪场不同免疫次数对口蹄疫抗体产生效果的影响

【目的】探讨规模猪场不同免疫次数对口蹄疫病毒(FMDV)抗体产生的影响,为指导口蹄疫(FMD)免疫提供理论依据。【方法】以存栏母猪100头为分界,从广西16家不同规模养猪场采集经FMD疫苗一免、二免和三免后1个月的血清,共720份,然后使用ELISA试剂盒对血清样品的FMDV抗体水平进行检测。【结果】两种规模猪场猪群一免、二免和三免后1个月产生的FMDV抗体总合格率分别为52.08%、72.08%和86.67%,对应平均抗体离散度分别为53.83%、75.75%和106.46%,S/N值分别为0.527、0.387和0.294。其中,一免和三免的FMDV抗体合格率、S/N值差异极显著(P<0.01),FMDV抗体离散度差异显著(P<0.05)。从猪场规模分析发现,100头母猪以上猪场的FMDV抗体平均阳性率为75.83%,抗体离散度为87.71%,平均S/N值为0.350;而100头母猪以下猪场的FMDV抗体平均阳性率为64.72%,抗体离散度为67.47%,平均S/N值为0.455。不同规模猪场猪群的FMDV抗体合格率及S/N值差异极显著(P<0.01),但离散度差异不显著(P>0.05)。【结论】FMD免疫一次远达不到国家要求的免疫效果,经过三免后FMD免疫效果最佳。实际生产中,规模化猪场应加强对猪群FMDV抗体的监测,并根据抗体消长规律有针对性地进行免疫,提高猪群抗体水平的均匀度,有效防控FMD流行。

2型猪链球菌SspA基因序列及其免疫原性分析

【目的】明确2型猪链球菌的枯草杆菌素样丝氨酸蛋白酶(Ssp A)基因序列特征及其原核表达重组蛋白的免疫原性,为2型猪链球菌病的诊断及疫苗研究奠定基础。【方法】针对Ssp A基因上、下游序列分别设计1对引物,从112株2型猪链球菌临床分离株中扩增其相应片段,并进行测序分析;同时以Ssp A基因的重组质粒p ET28a-Ssp N、p ET28a-Ssp M和p ET28a-Ssp C分别转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导表达,再以SDS-PAGE检测融合蛋白表达情况,Western blotting鉴定其免疫原性。【结果】Ssp A基因上游片段较保守,而下游片段变异区间较大。在IPTG诱导下,含有重组质粒p ET28a-Ssp N、p ET28a-Ssp M和p ET28a-Ssp C的菌株表达出3段融合蛋白,其中,Ssp N和Ssp C重组蛋白存在于破碎菌体的上清液中,而Ssp M重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀中,其大小为:Ssp N重组蛋白66 k D,Ssp M重组蛋白65 k D,Ssp C重组蛋白32 k D。Western blotting鉴定结果显示,3段重组蛋白均能与2型猪链球菌感染血清发生反应,且以Ssp N重组蛋白反应最强烈,而与以全菌灭活苗制备的猪血清未发生特异性反应。【结论】2型猪链球菌Ssp A基因上游片段较保守,经大肠杆菌重组表达的Ssp N蛋白免疫原性较强,且具备鉴别2型猪链球菌感染与免疫的潜力,可作为研究猪链球菌病血清学诊断的候选抗原片段。

猪巨细胞病毒GX株gB基因的克隆与序列分析

从广西病猪的肺组织中分离到猪巨细胞病毒GX株,通过PCR扩增得到猪巨细胞病毒GX株gB基因的一个1736bp片段,扩增产物经克隆、测序,得到的核苷酸序列与GenBank上已发表的猪巨细胞病毒其他分离株的核苷酸序列相比,其同源性在97.8%～98.9%,与人巨细胞病毒分离株的同源性在32.0%～43.6%,表明gB基因在同种动物间比较保守。在系统进化树中,GX株与其他猪巨化细胞病毒株亲缘关系较近,属于同一个分支,而与人巨化细胞病毒差异较大。

广西部分地区猪瘟免疫抗体产生效果的监测分析

从广西32家养殖场分别按100头以上母猪和100头以下母猪的不同规模猪场采集经过猪瘟疫苗一免、二免和三免后1个月的血清1083份,使用阻断ELISA方法对样品的猪瘟抗体水平进行检测。结果表明,一免和二免抗体合格率相比差异不显著,但和三免相比差异显著。不同免疫次数的抗体离散度差异不显著,100头母猪以上的猪场抗体离散度低于100头母猪以下的猪场。结果显示猪瘟抗体三免后效果最好,100头以下的猪场应加强对猪群猪瘟抗体的监测,根据个体的抗体消长规律进行有针对性的免疫,以提高群体抗体均匀度。

两种O型口蹄疫ELISA检测试剂盒的对比

为比较哪种ELISA试剂盒能够更准确、简便、快捷地检测出口蹄疫病毒抗体,本研究使用液相阻断酶联免疫吸附试验(LB-ELISA)试剂盒和固相竞争酶联免疫吸附试验(SPC-ELISA)试剂盒,对2014年广西各市县动物疫病预防控制中心送检的已免疫过口蹄疫疫苗的猪、牛、羊血清共计1121份进行了检测,对比两种试剂盒的特异性、敏感性、阳性检出率及符合率。检测结果表明,两种口蹄疫ELISA试剂盒的阳性检出率不同,LB-ELISA的阳性检出率比SPC-ELISA高2.4%;LB-ELISA试剂盒对血清抗体滴度水平的要求相比SPC-ELISA试剂盒要低,因此LB-ELISA试剂盒更适合于口蹄疫病毒感染的检测。

广西马流感H3N8毒株的HA基因序列测定与分析

为了了解广西马群流感病毒流行病学状况,试验通过RT-PCR方法,从广西4个市采集的104份马组织样品中检测出1份马流感病毒阳性,经鸡胚接种分离到病毒,并进行了血清学检测、基因扩增和测序比对。结果表明:分离到的病毒为H3N8亚型马流感病毒,HA基因阅读框为1 710 bp,编码569个氨基酸,与哈萨克斯坦2007年分离毒株(Otar07)的核苷酸、氨基酸同源性最高,分别为99.5%和99.6%。但与Otar07株相比,广西分离株HA基因蛋白在第11,12位多了苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)2个氨基酸,存在变异。绘制的系统进化树显示广西分离株属于美洲谱系中的佛罗里达第2分支。

O型口蹄疫病毒VP1基因及其多表位基因的原核表达与纯化鉴定

【目的】通过原核表达并纯化获得O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因及其多表位基因的重组蛋白,为建立O型FMDV抗体ELISA检测试剂盒及制备动物高免血清提供技术支持。【方法】以O型FMDV VP1全基因重组质粒p MD18-T-T-VP1及串联的VP1多表位基因重组质粒p MD18-T-O-VP1为模板,通过特异性引物扩增并回收目的基因,构建重组质粒p ET-32a-VP1和p GEX-6p-1-VP1,然后转入大肠杆菌BL211(DE3)中诱导表达,并以SDS-PAGE和Western blotting对融合蛋白进行分析鉴定。【结果】O型FMDV的VP1基因及其多表位基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到正确表达,表达的两种融合蛋白主要以包涵体形式存在,纯度较高,且均能与猪抗O型FMDV阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性。【结论】表达获得的融合蛋白具有良好的反应原性,可作为包被抗原应用于O型FMDV抗体检测试剂盒研发。

困惑与选择——从江淹诗赋作品看其宇宙人生观

本文拟从江淹的诗赋作品来探讨其生命的本真世界以及具体的行为方式。通过阅读作品发现，江淹的精神或说生命体验最本质的一点是把宇宙哲学化、人化，反过来又把人生哲学化，从宇宙的高度来审视人生，让人诗意地居住在世界上。与此同时，其具体的行为方式也为当时的士子文人提供人生选择的一种范式。这样，江淹的诗赋作品比同时代人的作品显得含蓄、深沉，“人情练达即文章”，诗格即人格。

O型口蹄疫病毒VP1蛋白竞争ELISA诊断方法的初步建立

利用表达的重组融合蛋白pGEX-6P-1-VP1作为抗原,用PET-32a-VP1蛋白免疫家兔获得的阳性血清作为FMDV阳性血清的竞争抗体,建立了检测FMDV抗体的竞争ELISA,并进行了条件优化,利用统计学方法计算竞争ELISA的阳性临界值。结果显示,重组蛋白抗原的最适包被质量浓度为1μg·mL^(-1),待检血清、酶标抗体和高免血清的最佳稀释度分别为1∶40、1∶2000和1∶500;与液相阻断ELISA试剂盒相比较,该方法的敏感性为91.3%,特异性为95.1%,符合率为96.7%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、重复性好,可用于O型FMDV血清抗体水平的检测。

广西不同年龄猪群中2型猪链球菌抗体水平调查分析

为调查规模化猪场不同年龄猪群中2型猪链球菌（S.suis 2）抗体水平,本研究采用以荚膜多糖为抗原的间接ELISA对来自广西地区母猪群、肥猪群、生长猪群共1 908份血清样品进行了S.suis 2抗体检测和分析。结果显示：成年猪群中抗S.suis 2的抗体水平普遍较高,种猪场母猪血清抗体阳性率可高达95%以上,不同地区屠宰场的育肥猪血清抗体阳性率在39.2%-97.5%。对不同日龄仔猪群抗体水平检测分析显示：14日龄-42日龄期间,抗体水平随仔猪日龄的增长而呈逐渐下降的趋势;而42日龄-130日龄期间,抗体水平随日龄的增长而呈逐渐上升的趋势。此外,经产母猪群抗体水平略高于后备母猪群,并且随胎次的增加,抗体的离散度缩小。以上结果表明S.suis 2抗体在仔猪生长阶段的空白期即42日龄时,仔猪群抗体水平最低。因此,在这个阶段和之前做好S.suis的预防和免疫工作对猪群链球菌病的防控至关重要。

基于OBE理念的新医科药学专业综合实验课程建设

药学是一门实践性很强的学科,药学专业实验课程是理论课程的重要补充,通过实践过程将理论知识与实践有机结合,培养学生具备专业的意识、能力和素质。以广西大学药学专业为例,基于新医科交叉融合背景,将OBE理念应用到药学专业实验课程教学中,探讨药学专业综合性实验项目的内容设计、教学方法及模式、课程思政、考核及评价机制等方面的教学改革和实践,以期完善药学本科实验课程体系建设,提高广西大学药学专业教学质量,推动药学学科的发展,为培养符合国家标准、具备从事药学专业相关工作的高素质专门人才奠定基础。

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒（CSFV）的E0和E2基因特征，为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT—PCR方法，对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增，经克隆、测序后，利用DNAStar软件对序列进行比对分析，同时绘制系统遗传进化树。结果表明，从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现，GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83．1％～94．1％，其推导氨基酸同源性在85．9％～99．6％；与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81．7％～93．7％，其推导氨基酸同源性为89．0％～97．0％；E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明，E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异；E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异，但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似，与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低，亲缘关系较远，与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高，亲缘关系较近。

广西马流感病毒(A/Equine/Guangxi/1/09)NA基因的克隆与序列分析

【目的】了解广西马流感病毒（Equine influenza virus,EIV）的分子流行病学特征并揭示其遗传变化规律,为其疫苗候选毒株的筛选及有效防控马流感疫情奠定基础。【方法】采用RT-PCR对广西EIV分离株（A/Equine/Guangxi/1/09,简称GX09株）进行NA基因扩增,经克隆测序及序列比对分析,绘制遗传进化树。【结果】GX09株NA基因全长1420 bp,其开放阅读框（ORF）为1413 bp,编码470个氨基酸,包含7个糖基化位点及17个半胱氨酸（Cys）残基。GX09株与参考毒株的NA基因核苷酸同源性为74.7%~99.5%,其推导氨基酸同源性为80.4%~99.4%;与Gansu08株、Heilongjiang08株、Inner mongolia08株及Liaoning08株的核苷酸及其推导氨基酸同源性最高,分别为99.5%和99.4%;与1989年在我国吉林分离获得毒株（Jilin89）的同源性最低,对应的核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为74.7%和80.4%。从遗传进化树可以看出,GX09株与最近几年国内外分离获得的毒株亲缘关系较近,且同属于美洲型分支。【结论】目前广西流行的EIV与国内外的流行毒株一致。