27nt-miRNA对血管平滑肌细胞SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响

目的:探讨27nt-微小RNA(27nt-miRNA)对血管平滑肌细胞(VSMCs)中平滑肌22α蛋白(SM22α表达的调节及其对细胞活力、迁移和表型改变的影响。方法:构建27nt-miRNA高表达、反义序列(anti-27nt-miRNA)以及阴性对照的表达质粒,经慢病毒包装后分别转染大鼠原代VSMCs,加入血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导VSMCs表型转换。MTT实验检测细胞活力,划痕实验检测细胞迁移能力,RT-PCR、Western blot和免疫细胞化学染色法检测细胞中SM22α的mRNA和蛋白表达情况。结果:与正常组相比,PDGF-BB组的细胞活力上升(P <0.05)、迁移能力上升(P <0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P <0.05);与阴性对照慢病毒组相比,27nt-miRNA高表达组的细胞活力下降(P <0.05),迁移能力下降(P <0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量明显升高(P <0.05);而anti-27nt-miRNA组细胞的细胞活力上升(P <0.05),迁移能力上升(P <0.05),SM22α的mRNA及蛋白表达量下降(P <0.05)。结论:27nt-miRNA促进SM22α表达,同时抑制VSMCs的活力及迁移,并有可能抑制VSMCs从收缩型转变为合成型。

27nt-miRNA对人脐带间充质干细胞定向内皮细胞分化和管腔形成的影响及其分子机制

目的探讨27nt-miRNA对人脐带间充质干细胞(h UCMSCs)定向内皮细胞分化和分化后细胞管腔形成能力的影响,并探讨其分子机制。方法构建27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及对照慢病毒载体。将h UCMSCs分为27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组、对照组,分别转染27nt-miRNA、anti-27nt-miRNA及对照慢病毒载体后观察转染效率,诱导分化并观察细胞形态变化,MTT检测分化后细胞增殖能力,硝酸还原酶法检测分化过程中细胞的一氧化氮(NO)产量,人工基底膜检测分化后细胞的成管能力,RT-PCR、免疫细胞化学和Western blotting分别检测分化后细胞的内皮型一氧化氮合酶(eNOS)mRNA和蛋白。结果与对照组相比,27nt-miRNA组h UCMSCs分化程度低,未见管腔样网络结构;分化第9天,27nt-miRNA组细胞NO产量较对照组降低33.49%(P<0.05)、eNOS mRNA表达量较对照组降低23.81%(P<0.01)、eNOS蛋白表达较对照组降低24.56%(P<0.05);anti-27nt-miRNA组的上述指标较对照组及27nt-miRNA组升高(P<0.05或P<0.01)。结论 27nt-miRNA明显抑制h UCMSCs定向内皮细胞分化及管腔形成能力,其作用机制与27nt-miRNA抑制eNOS蛋白表达及NO合成有关。

微RNA-24对过氧化氢诱导的人脐静脉血管内皮细胞凋亡的影响及作用机制

目的探讨微RNA-24(miR-24)对H2O2诱导的人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)存活、迁移和凋亡的影响及作用机制。方法通过转染miR-24高表达、miR-24抑制物(anti-miR-24)及其阴性对照慢病毒质粒(miR-24 NC)构建稳转细胞,3种细胞用H2O2500μmol·L^-1处理12 h。采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞存活率,划痕实验检测细胞迁移率,Hoechst33258染色及流式细胞术检测细胞凋亡,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-24,Bax,Bcl-2和胱天蛋白酶3 mRNA表达水平,Western印迹法和免疫细胞化学法检测Bax、Bcl-2和胱天蛋白酶3蛋白表达水平。结果与miR-24 NC组比,miR-24高表达组miR-24表达升高(P<0.05),而anti-miR-24组降低(P<0.05)。与正常对照组比,H2O2组细胞凋亡率增加(P<0.05)、细胞存活和迁移率降低(P<0.05),表明氧化损伤模型构建成功。与H2O2+miR-24 NC组比,H2O2+miR-24高表达组上述指标较H2O2+miR-24 NC组升高(P<0.05),促凋亡蛋白Bax和胱天蛋白酶3 mRNA与蛋白表达量增加,抑凋亡蛋白Bcl-2 mRNA和蛋白表达量降低(P<0.05),而H2O2+anti-miR-24组可降低细胞凋亡率、增加细胞存活和迁移率,降低Bax和胱天蛋白酶3 mRNA与蛋白表达水平,增加Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平(P<0.05)。结论氧化应激状态下,miR-24可通过上调Bax、胱天蛋白3表达和下调Bcl-2蛋白表达,促进HUVEC凋亡和抑制其存活和迁移能力。

基于网络药理学和体外实验探讨复方苦参注射液抗非小细胞肺癌的作用机制研究

目的基于网络药理学及体外实验探讨复方苦参注射液(CKI)抗非小细胞肺癌(NSCLC)的分子机制。方法通过网络公开数据库及查阅文献,分别获得CKI和NSCLC的靶点。筛选两者共有靶点后,构建靶点蛋白互作网络,进而找到CKI抗NSCLC的关键靶点。利用David数据库对关键靶点进行GO和KEGG信号通路分析,通过R软件对结果进行可视化。通过qPCR技术对富集到与NSCLC相关的信号通路进行体外实验验证。结果共收集到CKI相关靶点372个,NSCLC相关靶点426个。生物信息学分析共富集到93个生物过程(BP)以及30条信号通路,其中缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(AMPK)信号通路、磷脂酰肌醇3'-激酶(PI3KAkt)信号通路可能与CKI抗NSCLC相关。体外实验表明,经CKI治疗后,ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因相对表达量显著降低。结论CKI可能通过抑制ERBB2、MTOR、IGF1R及VEGFA基因相对表达,进而调控HIF-1、AMPK、PI3K-Akt信号通路发挥其抗NSCLC的作用。

27nt-miRNA通过靶向哺乳动物雷帕霉素靶蛋白调控血管平滑肌细胞凋亡及其分子机制研究

目的:探讨来源于一氧化氮合酶基因第四内含子的27碱基重复序列微小RNA(27nt-miRNA)对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)介导的主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)凋亡调控作用及潜在分子机制。方法:将大鼠主动脉VSMC分为空白对照组、雷帕霉素组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27ntmiRNA)组、阴性对照组。27nt-miRNA组:转染27nt-miRNA正义链慢病毒载体;anti-27nt-miRNA组:转染27ntmiRNA反义链慢病毒载体;阴性对照组:转染随机阴性序列慢病毒载体。除空白对照组外,雷帕霉素组与各转染组细胞给予100 ng/ml雷帕霉素诱导培养2 h诱导凋亡。荧光定量逆转录PCR(qRT-PCR)验证27nt-miRNA慢病毒稳转细胞株构建情况;CCK-8法、流式细胞术、qRT-PCR法与蛋白免疫印迹(Western blot)法分别检测各组细胞增殖能力、细胞凋亡率与周期分布以及mTOR、磷酸化-mTOR(p-mTOR)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的信使RNA(mRNA)和(或)蛋白表达水平。结果:慢病毒转染VSMC后,27nt-miRNA稳转细胞株构建成功,雷帕霉素可抑制VSMC的mTOR mRNA与p-mTOR蛋白表达水平。与阴性对照组相比,27nt-miRNA组细胞的活力与增殖能力显著增强,且细胞凋亡率显著降低(P均<0.05),细胞周期G1期向S期分裂进程阻滞减弱(P<0.05);Bax和caspase-3蛋白表达量显著减少,Bcl-2蛋白表达量显著增加(P均<0.05);mTOR基因转录水平与p-mTOR蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:27nt-miRNA通过负调控m TOR基因转录水平与蛋白磷酸化水平抑制VSMC凋亡,其机制可能与上调Bcl-2蛋白表达,下调Bax和caspase-3蛋白表达有关。

27nt-miRNA对氧化型低密度脂蛋白诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的影响

目的:探讨27nt-miRNA(27nt-miR)对氧化型低密度脂蛋白(Ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(HU⁃VECs)凋亡的影响及分子机制。方法:体外培养HUVECs,分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组和阴性对照+Ox-LDL组。正常对照组给予正常培养;Ox-LDL组用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡;27nt-miR+Ox-LDL组、anti-27nt-miR+Ox-LDL组及阴性对照+Ox-LDL组分别以相同的操作方法转染相应慢病毒质粒后用40 mg/L Ox-LDL作用48 h诱导细胞凋亡。采用CCK-8法检测细胞活力,划痕实验检测细胞的迁移能力,caspase-3活性试剂盒检测细胞内caspase-3活性,RT-qPCR法和Western blot法检测细胞内Bcl-2、Bax和caspase-3 mRNA及蛋白的表达情况。结果:与阴性对照+Ox-LDL组相比,27nt-miR+Ox-LDL组HUVECs的27ntmiR高表达可显著降低细胞活力和迁移能力(P<0.05),显著增加Ox-LDL所致的caspase-3活性和细胞凋亡(P<0.05),亦可显著上调Ox-LDL所致的Bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达(P<0.05),下调Bcl-2的mRNA和蛋白表达(P<0.05);而anti-27nt-miR+Ox-LDL组,上述所测指标均表现出相反趋势。结论:27nt-miR可能通过调控Bax、cas⁃pase-3和Bcl-2凋亡/抗凋亡蛋白的表达促进Ox-LDL体外诱导的HUVECs凋亡进而抑制HUVECs活力和迁移。

miR-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇诱导的人脐静脉内皮细胞自噬的影响

目的探讨微小RNA(miR)-24对氧化低密度脂蛋白胆固醇(ox-LDL)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)自噬的调控作用及相关分子机制。方法将HUVECs随机分为正常组,ox-LDL组,阴性对照组,anti-miR-24组,miR-24组。正常组细胞正常培养,ox-LDL组细胞用100μg/ml ox-LDL作用6 h诱导自噬,阴性对照组、anti-miR-24组、miR-24组先分别转染相应慢病毒载体,再以同法诱导自噬。实时荧光定量(qRT)-聚合酶链反应(PCR)验证miR-24慢病毒稳转细胞株构建情况及ox-LDL对HUVECs内miR-24表达的影响;透射电镜观察各组细胞内部自噬小体和自噬溶酶体的数量;四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各组细胞活性;Western印迹与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、P62的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后miR-24的表达受到影响;ox-LDL可诱导下调miR-24在HUVECs中的表达(P<0.05);与阴性对照组相比,anti-miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著增加(P<0.05),但细胞活性无显著差异(P>0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著增高(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量降低(P<0.05)。然而,miR-24组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低(P<0.05),LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1的蛋白及mRNA相对表达量显著降低(P<0.05),P62的蛋白及mRNA相对表达量升高(P<0.05)。结论过表达miR-24可通过抑制ox-LDL诱导的HUVECs自噬进而抑制细胞增殖,miR-24可能成为动脉粥样硬化(AS)的潜在治疗靶点。

27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化的影响

为探讨27nt-miRNA对间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化影响,构建27nt-miRNA过表达、反义序列Anti-27nt-miRNA以及阴性对照的表达质粒,慢病毒包装后分别转染人脐带间充质干细胞(hUCMSC),加入Ⅳ型胶原诱导hUCMSC定向分化为血管平滑肌细胞。四唑盐(MTT)比色法检测分化后细胞活力,免疫细胞化学染色法检测分化后细胞SM22α(兔抗平滑肌22α,smooth muscle 22α)的表达,Western印迹法和RT-PCR检测分化后细胞内的SMA (兔抗平滑肌肌动蛋白,smooth muscle actin) mRNA、SM 22α mRNA及其蛋白质表达情况。经检测,27nt-miRNA过表达分化组与阴性对照组相比,细胞活力下降20.48%(P<0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量明显升高(P<0.05);而Anti-27nt-miRNA分化组细胞活力上升了18.07%(P<0.05),SMA mRNA、SM22α mRNA及其蛋白质表达量下降(P<0.05)。综上所述,27nt-miRNA能够促进间充质干细胞向血管平滑肌细胞分化,并且抑制分化后的细胞活力。

微小RNA-24对氧化应激下人脐静脉内皮细胞管腔形成的影响

目的探讨微小RNA-24(miR-24)对氧化应激下人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成的影响及其机制。方法将HUVECs分为5组:空白组、H2O2组、miR-24组、anti-miR-24组和miR-NC组。空白组细胞不做任何处理,H2O2组用500μmol·L^-1 H2O2处理12 h,miR-24组、anti-miR-24组和miR-NC组分别转染miR-24高表达、anti-miR-24及对照慢病毒质粒后,再用500μmol·L^-1 H2O2处理12 h。以二氢乙啶荧光探针法检测活性氧(ROS)水平,人工基底膜检测HUVECs管腔形成能力,蛋白质印迹法检测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)/磷酸化内皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)表达水平。结果空白组、H2O2组、miR-NC、miR-24组和anti-miR-24组的细胞ROS含量分别为(100.00±0.00)%,(208.00±4.58)%,(203.03±5.57)%,(271.67±4.50)%和(138.03±2.65)%;这5组的管腔节点数分别为677.01±52.84,304.55±23.40,311.22±38.17,242.44±12.79和439.11±25.68;这5组的蛋白表达量(p-Akt/Akt)分别为0.72±0.03,0.41±0.01,0.41±0.03,0.27±0.06和0.56±0.02;这5组的p-eNOS/eNOS表达量分别为0.61±0.02,0.38±0.03,0.37±0.01,0.27±0.03和0.47±0.03。上述指标:H2O2组与空白组比,差异均有统计学意义(均P<0.05);miR-NC、miR-24组和anti-miR-24组与H2O2组比,miR-24组和anti-miR-24组的差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论在氧化应激条件下,miR-24可增加ROS水平,降低NO生物利用度,进而抑制HUVECs增殖迁移和管腔形成,这可能与miR-24抑制Akt/eNOS蛋白的磷酸化水平有关。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨27nt-miRNA对血管平滑肌细胞自噬的调控作用

目的探讨27nt-miRNA对西罗莫司诱导的血管平滑肌细胞自噬的调控作用及分子机制。方法将大鼠主动脉血管平滑肌细胞分为正常组、西罗莫司组、27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组和阴性对照组。正常组给予正常培养;西罗莫司组用100 nmol·L^-1西罗莫司作用6 h建立自噬模型;27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组及阴性对照组先转染相应慢病毒载体,待转染成功后用100 nmol·L^-1西罗莫司作用6 h建立自噬模型。用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法验证27nt-miRNA慢病毒稳转细胞株构建情况,用透射电镜观察5组细胞内部自噬小体数量,用四甲基偶氮唑盐法检测5组细胞活性,用Western blot法与qRT-PCR法检测LC3-Ⅰ/Ⅱ、Beclin-1、PI3K、Akt、p-Akt、mTOR和p-mTOR的蛋白和mRNA表达水平。结果慢病毒转染细胞成功后27nt-miRNA的表达受到影响;与阴性对照组相比,细胞内自噬小体及自噬溶酶体显著增多,27nt-miRNA组细胞的活性显著增强[(0.90±0.03)vs.(0.72±0.01),P<0.05],LC3-Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1的蛋白表达量均显著增加[(1.92±0.21)vs.(1.59±0.09),(9.47±0.61)vs.(7.19±1.32),均P<0.05],LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA表达量均显著增加[(1.83±0.33)vs.(1.27±0.19),(1.77±0.29)vs.(1.36±0.23),均P<0.05],PI3K/Akt/mTOR信号通路被抑制;与此同时,anti-27nt-miRNA组细胞质内自噬小体及自噬溶酶体显著减少,且细胞活性显著性降低[(0.60±0.03)vs.(0.72±0.01),P<0.05],LC3-Ⅱ和Beclin-1的mRNA相对表达量均显著下降[(0.90±0.25)vs.(1.27±0.19),(0.98±0.24)vs.(1.36±0.23),均P<0.05]。结论过表达27nt-miRNA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路促进血管平滑肌细胞自噬进而引起细胞过度增殖,27nt-miRNA可能成为心血管疾病的潜在治疗靶点。

微小RNA在调控血管平滑肌细胞凋亡与心血管疾病的联系与临床应用

微小RNA(microRNAs,miRNAs)是由18～22核苷酸组成的非编码微小RNA,它在体内动态平衡调节和疾病发生发展等许多方面发挥重要作用,经研究已被证实参与心血管疾病的发病机制,包括动脉粥样硬化、心肌梗死、高血压和支架术后狭窄。miRNAs在血液循环中稳定存在,它可调控血管平滑肌细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等,其中细胞凋亡对心血管疾病有特殊生理病理意义,因此可能是心血管疾病诊断治疗的新热点。笔者旨在综述miRNAs调控血管平滑肌细胞凋亡与心血管疾病的联系与临床应用,为miRNAs调节血管平滑肌细胞功能,参与心血管疾病的研究网络提供一定的理论依据。

27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白介导的血管内皮细胞管腔形成活性减弱的影响及其分子机制

目的探讨27nt-miRNA对氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)介导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移和管腔形成能力减弱的影响及相关分子机制。方法将HUVECs分为正常对照组、Ox-LDL组、27nt-miRNA组、27nt-miRNA反义序列(anti-27nt-miRNA)组和miR-NC组。正常对照组不做任何处理;Ox-LDL组用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h;27nt-miRNA组、anti-27nt-miRNA组和miR-NC组分别感染27nt-miRNA高表达、27nt-miRNA反义序列和随机阴性序列的慢病毒载体后,再用40μg·mL^(-1) Ox-LDL作用48 h。采用qRT-PCR法检测27nt-miRNA表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Matrigel实验检测细胞的成管能力;一步法检测细胞的一氧化氮产量;Western blot法和qRT-PCR法检测p-PI3K、PI3K、Akt、p-Akt、eNOS的蛋白和(或)mRNA表达水平。结果与miR-NC组相比,27nt-miRNA组细胞27nt-miRNA高表达(P<0.05)、细胞活力下降(P<0.05)、细胞迁移能力降低(P<0.05),且未见管腔样网络结构;此外,27nt-miRNA组细胞NO的产量显著降低(P<0.05),PI3K、Akt与eNOS的mRNA表达量显著降低(P<0.05),p-PI3K、p-Akt与eNOS的蛋白表达量显著降低(P<0.05);anti-27nt-miRNA组细胞的上述指标均较27nt-miRNA组与miR-NC组升高(P<0.05)。结论在Ox-LDL诱导HUVECs损伤后,27nt-miRNA可能通过抑制PI3K/Akt/eNOS信号通路的激活,抑制HUVECs的增殖和迁移,继而抑制血管形成,可能参与血管疾病的病理生理过程。