利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

玉米CBS基因家族的鉴定和特征分析

为研究玉米CBS(ZmCBS)基因家族的特征,探讨其功能,对ZmCBS基因家族进行鉴定,分析其染色体定位、基因结构、保守结构域及进化关系,并对ZmCBS家族基因在玉米组织中的表达情况及其在非生物胁迫下的表达变化进行分析。基于玉米基因组数据库,鉴定到37个CBS基因家族成员,它们不均匀地分布在玉米的8条染色体上。该家族蛋白除保守的CBS结构域外,多数成员还包含其他结构域,包括电压门控的氯化物通道蛋白(voltage gated ClC)、Phox/Bemp1(PB1)结构域、五肽重复序列(penatricopeptider repeat, PPR)和E_SET结构域等。按照基因结构和进化关系可分为6个亚类,且同一进化分支上的基因具有相似的外显子结构和CDS长度,但内含子长度差异很大。启动子分析结果表明,ZmCBS基因启动子上含有响应激素和非生物胁迫的顺式作用元件。转录组数据的基因表达谱分析显示,ZmCBS基因家族部分成员在叶、花粉或胚中优势表达。ZmCBS3和ZmCBS14受冷胁迫诱导表达,ZmCBS14和ZmCBS22受干旱胁迫诱导表达,暗示这些基因在玉米响应外界胁迫中起重要作用。分析结果将为进一步研究ZmCBS家族基因奠定基础。

杂交稻主要亲本的SSR分子身份证数据库的构建

利用前期构建的基于明恢86的SSR电子遗传图谱,筛选得到分布于水稻12条染色体长短臂上的24对多态性好的SSR标记,利用这些标记对139份水稻品种材料进行多态性分析,从而得到142个等位位点,24个标记位点的分布范围在2~10之间,平均值为5.9。这些标记对杂交稻组合的鉴别能力高于对杂交稻亲本的鉴别能力,这在对目前生产中数目繁多的杂交组合的识别鉴定具备突出的优势。对18个杂交稻组合与其亲本材料进行了标记匹配性分析,在确定了母本高精确性遗传的同时,剔除了2个假杂交稻。此外,构建了137个水稻品种材料×24个标记的分子身份证数据库,本库可直接应用于生产中相关的亲本鉴定及种子验杂,从而为杂交水稻品种纯度和真伪鉴定提供科学数据。

获得基因侧翼序列位点信息的几种扩增方法

侧翼序列是指染色体中特定位点两侧的DNA序列。在现代分子生物学技术研究中,常常需要对已知位点的侧翼序列进行分析或克隆,以研究基因的遗传表达调控。该文对近年来发展的几种侧翼序列扩增技术进行简述。

1个水稻雌配子不育突变体的筛选及初步分析

在水稻转基因后代中,筛选到1个与雌配子育性相关的突变体,该突变体自交后代群体外源标记基因(潮霉素磷酸转移酶hpt)保持1∶1的分离规律,连续6代自交没有得到纯合株系;正、反杂交以及测交分析显示,潮霉素抗性基因只能通过雄配子进行传递;结实率统计分析表明具有外源标记基因hpt的单株有近乎一半的雌配子发生败育,胚囊的育性与外源基因hpt共分离;Southern-blot分析表明该突变体T-DNA是以单拷贝方式整合到水稻染色体上。这些分析表明该突变体是1个T-DNA插入导致的雌配子体不育突变体(暂定名为female gametogenesis sterile 1,fgs1)。细胞学观察显示,突变体fgs1花粉育性与野生型明恢86近似,但是其雌配子发育受阻,突变基因型雌配子体在8核胚囊时期,卵细胞、助细胞、反足细胞团以及中央极核依次解体退化,无法完成授粉受精。

水稻胚特异表达基因Os08PTS启动子的克隆及分析

为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良。依据T-DNA插入位点信息,克隆Os08PTS基因启动子,并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征,同时构建启动子与GUS融合表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因植株,验证启动子的表达特征。结果表明:Os08PTS基因启动子片段中包含启动子的基本元件TATA-box和CAAT-box,以及光调控元件、赤霉素应答元件、生长素反应元件、参与防御和应激反应相关元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件,还含有与分生组织表达以及胚乳表达相关元件等。进一步构建Os08PTS启动子的GUS融合载体,并获得水稻遗传转化植株。Os08PTS启动子序列能够驱动Os08PTS基因在水稻茎和种子胚的表达,该启动子具有驱动下游基因转录的活性。

一个水稻Bowman-Birk家族基因功能的研究

采用荧光定量分析和过量表达的方法研究水稻Bowman-Birk家族基因BBTI-13基因的功能.结果显示,BBTI-13在野生型日本晴水稻中具有组织特异性,在胚和花药中表达最低;BBTI-13基因的烟草亚细胞表达定位表明其为组成型表达;过表达株系的田间表型分析发现,过表达转基因植株与野生型相比株型矮化,粒型稍变大.并通过对水稻株形矮化相关基因的表达进一步分析表明,BBTI-13基因的过量表达会引起水稻相关矮化基因的上调和下调反馈,其中Ghd2、DTH7、Ghd7、THIS1和Ghd8表现上调,OsBZR1、OsSIN表现下调.

农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立

以籼稻恢复系明恢86为材料,探讨受体材料、愈伤代龄、预培养时间、筛选时间等因素对转化效率的影响,并建立了高效稳定的农杆菌介导籼稻转化体系。转化技术参数如下,水稻花后15 d幼胚诱导的胚性愈伤(2～6代),作为转化受体材料,经4 d预培养,农杆菌侵染30 min,共培养3 d后,在30 mg·L-1潮霉素筛选出抗性愈伤,抗性愈伤经50 mg·L-1潮霉素筛选10～15 d后立即分化,幼胚的胚性愈伤转化频率可达6.98％,并且能够周年转化。

123份水稻重要品种的SSR核心标记指纹分析

利用前期构建的SSR核心引物的指纹图谱为基础,从中选出123份具有代表性的水稻品种进行品种的特异性及稳定性分析,并据此判定新增核心标记的应用价值。聚类分析结果表明,24对引物共检测到138个等位基因,其中等位位点上只存在一个品种有12个,能特定区分粳稻和籼稻类群水稻品种的等位位点的有21个;按遗传相似系数为0.96的划分标准,所有的品种都具备特异性;以等位位点的纯合性为指标,117份品种具有稳定的遗传基础;在杂交种与其父母本的遗传位点匹配试验中,16份随机配组的杂交组合中含有1~3个不匹配的遗传位点,而且这些位点和6份品种的杂合位点一起,多集中于RM289、RM7492、RM6487和RM583等4个标记中,它们是品种遗传不稳定的分子基础。表明24对核心引物能较好的鉴别123份水稻品种,123份品种中含有可重复发生的不稳定遗传位点。

水稻Dof基因家族的组织表达谱及胁迫诱导表达特征分析

基因的表达与调控是一个复杂的分子网络,受许多转录因子的时空表达调节。Dof蛋白是一类植物特有的转录因子,在多种植物特有生物学过程中起着关键的调控作用。水稻全基因组中发现含30个Dof基因,但对其绝大部分基因的功能尚缺少了解。本研究对30个水稻Dof基因及启动子区进行生物信息学分析,发现OsDof基因上游1.5kb启动子区含有大量的光反应、组织器官表达、植物激素反应及逆境反应等重要的顺式作用元件。进一步通过荧光定量RT-PCR技术分析,结果表明了大部分OsDof基因呈多器官较低丰度表达,少部分为器官优势或高丰度表达。另外,与未胁迫处理的水稻幼苗相比较,28个OsDof基因的表达受光、ABA、NaCl或PEG等胁迫处理的调节,其中27个OsDof基因可以对2种或2种以上的胁迫条件产生响应,表明这些成员可能在生理水平上参与不同胁迫相关信号途径之间的交互作用。

水稻种子发育期间特异锌指蛋白基因的筛选与分析

锌指蛋白基因是植物基因组中最大最复杂的基因家族之一.大部分的锌指模体存在于转录因子中,它们在转录水平上参与植物生长发育及植物对生物和非生物胁迫的反应.为了解锌指蛋白基因在水稻种子发育中的作用,本研究通过多种数据库搜索获得了878个水稻锌指蛋白基因.从中选取311个利用RT-PCR技术分析它们在水稻成熟期根、茎、叶、花及不同发育阶段种子中的表达特征.结果发现,共有196个基因能在至少1个水稻器官中表达,其中10个为种子特异性表达基因.进一步分析发现,10个特异表达基因在水稻种子不同发育阶段中的表达具有种子阶段表达特异性.同时分析它们的基因及蛋白结构特点,结果显示它们的结构较简单,其中3个蛋白含有线粒体靶肽,5个蛋白含有CCCH锌指结构域.另外,分析种子特异性表达基因上游调控区的顺式作用元件,结果表明它们都含有TATA-box、CAAT-box和种子特异调控元件,除此之外还发现了光、激素和胁迫反应相关调控元件.这些结果为进一步研究它们在种子发育过程中的生物学功能提供了有用的线索.

利用BSA-Seq方法鉴定谷丰B抗稻瘟病基因

【目的】挖掘和鉴定谷丰B稻瘟病抗性基因,了解谷丰B稻瘟病抗性遗传模式。【方法】以谷丰B和日本晴杂交获得F1和F2代遗传群体,接种稻瘟菌不同生理小种并分析抗病遗传模式;在F2群体中挑选极端抗/感单株构建DNA混合池,利用群体分离分析法(BSA)定位关联区域。【结果】谷丰B对KJ201、RB22、CHNOS、RB6、2Y838-1、501-3和IR16-1等菌株均表现高抗性,表明谷丰B基因组可能携带了广谱高抗稻瘟病基因。谷丰B和日本晴杂交,F1群体表现抗501-3和IR16-1,F2群体的抗病/感病分离比不符合3∶1,推测谷丰B基因组存在多个位点影响稻瘟病抗性。对F2群体的极端抗病、感病混合池及亲本DNA进行全基因组测序,鉴定了1756964个单核苷酸多态性(SNPs)标记。分析子代△SNP-index,定位到2个与抗病性显著关联区间,分别为Chr.6:10082-11397 kb和Chr.11:120-266 kb。其中,6号染色体的关联区间与Pi2/9抗病位点等位,区间内含有4006个SNPs和623个插入缺失(InDels)标记;11号染色体的关联区间含有752个SNPs和195个InDels标记。【结论】谷丰B对强致病力501-3菌株抗性可能是由第6号和11号染色体上的基因共同控制。研究结果为谷丰B抗性基因的精细定位及基因克隆奠定了基础,并为水稻抗稻瘟病分子标记辅助选择提供标记资源。

水稻密码子优化的cry1Ca基因在大肠杆菌中表达、纯化及抗体制备

将水稻偏好密码子优化并人工合成抗虫基因cry1Ca通过限制性内切酶酶切的方法构建原核表达载体pET-28bca,成功表达了带6个组氨酸标签的His-cry1Ca融合蛋白,其表达量约占菌体总蛋白的24%,表达的融合蛋白主要以包涵体的形式存在。对包涵体蛋白进行可溶性处理,亲和纯化出带6个组氨酸标签的融合蛋白,将其作为抗原免疫家兔获得了滴度(ELISA)为l∶50 000的抗血清,并具有较强的特异性。

2个水稻器官特异表达基因的鉴定及分析

研究组织特异表达基因对揭示植物生长发育机制具有重要的意义。通过生物信息学、RT-PCR及荧光定量PCR方法鉴定了2个水稻特异表达基因,即Os01g18840叶特异和Os01g28500茎叶颖特异表达基因。通过检测它们在PEG、NaCl、ABA及暗处理下的表达情况,发现在各种胁迫处理下,Os01g18840基因的表达受到抑制,Os01g28500基因的表达受到诱导。进一步分析它们的基因及蛋白结构特点,发现Os01g18840蛋白含有1个卷曲螺旋结构域,是1个中间纤维蛋白;Os01g28500蛋白含有1个SCP类似结构域,是与病原反应相关的蛋白。另外,对它们上游启动子区的顺式元件进行分析,结果表明它们都含有大量的与叶片、叶肉细胞或绿色组织中表达相关的顺式作用元件。

水稻紫色颖壳突变体的转录组分析

鉴定水稻花青素新基因及揭示其代谢机制,用于水稻新品种选育,是创制功能性水稻的手段之一。为探讨水稻紫色颖壳形成对花青素积累代谢途径的作用,以从水稻籼稻转化体组织培养中筛选获得的1个紫色颖壳杂合突变体(PiX)为材料,采用Illumina HiSeqTM 6000高通量转录组学(RNA-Seq)技术对其自交获得的突变型、正常型及野生型进行转录组测序研究。结果表明:突变型(ME)与野生型(F8)相比上调基因5108个、下调基因4288个,自交分离正常表型(PD)与野生型(F8)相比上调基因4653个、下调基因4397个,自交分离正常表型(PD)与突变型(ME)相比上调基因2078个、下调基因2829。GO功能富集分析表明水解酶活性类基因差异表达变化显著;KEGG Pathway分析结果表明,与野生型相比,在类黄酮生物合成途径中,突变型中与类黄酮合成相关色素基因数量多,且主要受编码查尔酮异构酶OsCHI影响。该研究结果可为研究水稻花色苷积累的分子机制提供参考。

水稻幼穗分化特异性启动子pRFL的克隆和特征分析

组织特异性启动子能够驱动基因在特定的时期和部位表达,克服组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费,是基因工程技术最重要元件之一.本研究利用PCR技术从水稻基因组中克隆了幼穗分化特异表达基因RFL翻译起始位点上游2 001 bp的启动子序列,命名为pRFL.生物信息分析显示,该片段含有36个转录起始核心启动子元件TATA-box和多个启动子增强子区顺式作用元件CAAT-box,以及多个光反应调控元件和植物激素响应元件等.将其与GUS基因构建成植物表达载体,导入水稻"日本晴",组织化学染色法检测显示,转基因水稻植株叶片、茎均无GUS显色,花序及发育中的小花有较强表达;荧光定量PCR测定幼穗GUS基因转录活性,显示pRFL驱动的GUS基因表达量比actin启动子驱动的GUS基因表达量高2.9倍.上述结果初步证明了pRFL为幼穗分化特异性启动子.