重组人白细胞介素-11的胰蛋白酶切肽图分析

目的 建立标准肽图分析法 ,用于rhIL 11的质量控制。方法 应用AllianceHPLC系统及其温控自动进样器探索最佳胰蛋白酶切和色谱条件。结果 连续 3批rhIL 11样品的RP HPLC图谱完全一致 ,与rhIL 11对照品比较 ,有 2 0个峰与对照品吻合 ,但第 6峰的峰高和峰面积均明显较小 ,且在第 9和第 10峰之间多一个峰 ,说明rhIL 11样品蛋白质结构与对照品比较存在细小差别。这种差别经多肽片段分离和氨基酸序列测定证明是由于样品N端多 2个氨基酸引起的。结论 本法精确度高、重复性好、自动化程度高 ,可用于rhIL 11的质量控制。

应用荧光法测定重组细胞因子中残余DNA含量

目的:建立荧光微量 DNA 含量测定方法,用于重组细胞因子的质量控制。方法:应用 PicoGreen 荧光试剂与 DNA 结合能产生可激发荧光的复合物、再用荧光酶标仪对复合物进行检测并用 SOFTmaxPRO 分析软件进行分析。结果:该荧光法 DNA检测灵敏度达到312 pg·mL^(-1),DNA 含量在0.31～80n·mL^(-1)范围内线性良好,r≥0.996。应用该法对7种重组细胞因子共13批制品的外源 DNA 含量进行测定,结果表明:除重组人 BMP 和 IL-11以外,其它重组细胞因子 DNA 含量均小于10ng·剂量^(-1),与地高辛标记的 DNA 杂交试验结果基本一致。结论:该方法具有简便、快速、自动化程度高等特点,可用于重组细胞因子残余外源 DNA 含量的常规检定。

重组人干扰素α1b质量肽图分析及二硫键定位

目的:液质联用绘制重组人干扰素α1b 的质量肽图并鉴定二硫键位点。方法:LC-MS 联用绘制重组人干扰素α1b 的胰蛋白酶酶切质量肽图;对比特定肽段的实测相对分子质量与理论相对分子质量初步定位二硫键,对比烷基化及还原烷基化处理后特定肽段实测相对分子质量的变化确证二硫键位点。结果:重组人干扰素α1b 的质谱测定相对分子质量为19382.50,与理论相对分子质量19382.18一致,其质量肽图中共发现16个匹配肽段,有3个理论酶切片段(单一氨基酸:Lys 135、Lys 165、Glu 166)未发现,氨基酸覆盖率为98.2%。通过分析胰蛋白酶酶切质量肽图,发现主要存在2种二硫键连接方式:Cys 29-Cys 139、Cys 86-Cys 99,同时还存在少量其他二硫键连接方式,如:C1-C99。结论:质量肽图可作为一种对重组蛋白制品进行质量控制的手段,并可定位蛋白中的二硫键。

应用ELISA测定重组细胞因子中残余大肠杆菌菌体蛋白含量

目的建立灵敏度高，重复性好的残余宿主菌Ｅ。ｃｏｌｉ菌体蛋白含量的测定方法。方法电泳显示 ５株大肠杆菌ＤＨ５２、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５、Ｎ８４３０和ＨＢ１０１的蛋白质组分各不相同，但均可被免疫印迹显色，说明免抗 Ｅ．ｃｏｌｉ．Ｋ１２，Ｃ６００抗体包括了其主要菌体蛋白的抗体，因此，用ＥＬＩＳＡ检测相应的菌体蛋白含量。结果优化后的 ＥＬＩＳＡ对 ＤＫａ、ＪＭ１０３、ＪＭ１０５和 ＨＢ１０１检测灵敏度均达到 １０ ｎｇ／ｍｌ。用混合菌体蛋白作为 Ｅ．ｃｏｌｉ菌体蛋白通用标准， 其灵敏度达到７．８ｎｇ／ｍｌ，含量在７．８－２５０ｎｇ／ｍｌ范围内，一次方程（ｙ＝ａ＋ｂｘ）线性良好（ｒ＞０．９９０）；在７．８－１０００ｎｇ／ｍｌ 范围内，二次方程（ｙ＝ａ＋ｂｘ＋ｃｘ２）线性良好（ｒ＞０．９９０）。变异系数小于１４％（ｎ＝４）。应用该法对国内外重组产品 进行测定，发现不同厂家不同产品其菌体蛋白含量各不相同。 ８种细胞因子共 ５７批，菌体蛋白含量大于 １％的 ３ 批，占５．３％；大于０．１％的９批，占１５．８％；大于０．０１％的２８批占４９.１％。说明还有不少厂家其重组产品纯化工艺 有待进一步提高。结论本方法灵敏度高，重复性好，可用于重组产品?

重组人脑利钠肽质量标准与检定方法研究

目的:建立重组人脑利钠肽(rhBNP)质量标准与检定方法,用于该产品的质量控制。方法:用离体动脉条测定法测定rhBNP的生物活性;用反相HPLC和SDS-PAGE分析蛋白纯度;用肽图、免疫印迹及N-端氨基酸序列测定分析、鉴定产品特性;用固相斑点杂交法测定残余外源DNA含量;用ELISA测定残余工程菌蛋白含量;用《中国生物制品规程》的方法对,rhBNP成品进行无菌、热原、细菌内毒素和异常毒性等常规试验等。结果:用建立的方法对连续3批rhBNP原液和成品进行检定,结果各项指标均符合《重组DNA制品质量控制要点》和《中国生物制品规程》的要求。结论:建立的rhBNP质量标准与检定方法,具有保证产品安全、有效、质量可控等特点,可用于该产品的常规检定。

重组牛碱性成纤维细胞生长因子国家标准品的研制

目的 建立效价测定用的重组牛碱性成纤维细胞生长因子（ｈＦＧＦ）国家标准品。方法 按ＷＨＯ有 关要求制备标准品，分装、冻干后进行检定，以ｂＦＧＦ国际标准品为标准进行协作标定。结果 经检测外观、无菌实 验合格，水分为０．９９％，于－２０、４和２５℃条件下放置２３个月其生物活性稳定。该标准品经３家实验室协作标定， 共２３次测定，平均效价为６９７１支。实验均数的９５％可信区间为６２６６－７７５３ＩＵ／支，单次实验的９５％参考值范围 为３３９４－１０９６５ＩＵ／支，平均可信限率为 １０．９９５％。结抡 该批重组牛ｂＦＧＦ国家标准品各项指标均符合要求，可作 为国家标准品使用，效价定为７０００ＩＵ／支，批号为０１／９６。

重组人粒细胞集落刺激因子活性测定标准品的研制

目的 建立效价检测用的重组人粒细胞集落刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）国家标准品。方法 标准品按 ＷＨＯ有关要求进行制备、分装、冻干、检测，用Ｇ－ＣＳＦ国际标准品为标准进行协作标定。结果 冻干重组人Ｇ－ ＣＳＦ标准品经检测，外观、无菌实验合格，水分为０．９０％，加速热稳定实验表明其生物学活性在－２０、４和２５℃条件 下２０个月保持稳定。该标准品经４家实验室协作标定共３２次测定，加权平均效价为 ５．１５×１０６ＩＵ／支；几何平均效 价为 ４．９１×１０６ＩＵ／支。实验均数的９５％可信区间为４．６４×１０６～５．２０×１０６ＩＵ／支，单次实验的９５％参考值范围为 ３．４５×１０６～６．４７×１０６ＩＵ／支，平均可信限卒为５．４６％。结论 该批重组人Ｇ－ＣＳＦ国家标准品各项指标均符合要 求，可作为国家标准品使用，效价定为５．０×１０６ＩＵ／支，编号为９８／０１。

2.5sNGF酶联免疫检测试剂盒的研制

用成年雄性小鼠颌下腺提纯的 2 5sNGF免疫家兔得到兔抗NGF抗体 ,研制出 2 5sNGFELISA试剂盒。经检测本试剂盒灵敏度达到 1ng ml,在 0 84～ 6 7ng ml范围内线性良好 (r >0 99)。对人、小鼠、大鼠血浆无非特异反应 ,在大鼠血浆中NGF样品回收率在 91%～ 10 7%之间 ,变异系数小于 10 % (n =4)。对NGF参比品进行 6次标定 ,平均值为 13 4± 1 13ng 支 ,板间CV为 8 43% (n =6 ) ,板内CV值均小于 6 % (n =4,3次 )。表明本试剂盒可用于小鼠 2 5sNGF制品的定量检测和药代动力学研究。

应用半干胶转移免疫印迹法分析人白细胞干扰素

应用半干胶转移仪和ABC-试剂盒，建立了高灵敏度的半干胶转移免疫印迹法并用该法分析了不同厂家生产的人白细胞干扰素．结果表明，该法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，很适用于人白细胞干扰素的检定．

小鼠NGF基因治疗型DNA质粒的构建及中试工艺的优化

目的构建小鼠NGF基因治疗型DNA质粒,并进行中试工艺的优化。方法用SignalP3.0 Server软件选择并设计与NGF融合的信号肽;根据哺乳动物密码子偏爱性,对小鼠NGF的编码序列进行优化;通过流加补料等方式优化中试生产工艺;体外瞬时转染测定DNA质粒的表达和体外生物学活性。结果所构建的含有IgG/ngf的重组质粒,通过中试规模的发酵和纯化,获得了大量的高纯度重组质粒,该重组质粒可以在体外表达出具有生物学活性的NGF。结论构建了具有与小鼠NGF相似的生物学活性的重组质粒,并建立了中试生产工艺。

应用生物素探针检测重组人α_1型干扰素中外源DNA

本文应用生物素标记重组人α_1 型干扰素(rHuIFN-α_1)工程菌的总DNA作为探针,检测rHuIFN-α_1制品中的外源DNA,其灵敏度可达10pg。用蛋白酶K(Proteinase K)消化制品中的蛋白,排除了使用生物素所常见的非特异性影响。

我国基因工程药物质量标准研究(上)

基因工程药物,又称为重组药物,是利用基因工程技术,将目的基因(如人干扰素基因)经重组技术导入微生物(如大肠杆菌、酵母等)或动、植物细胞,通过发酵或细胞繁殖来生产出足够量多肽或蛋白质(重组人干扰素)制成的药物.

我国基因工程药物质量标准研究(下)

1.2免疫原性分析 这项指标只能在人体内进行观察.大肠杆菌生产的多肽药物,即使其氨基酸序列与自然结构一致,其免疫原性往往高于自然提取的多肽药物.如个别氨基酸的改变就可增加其抗原性.采用大肠杆菌表达体系时,大肠杆菌的氨肽酶很难有效地去除其产物N端的甲硫氨酸,因而增加其免疫源性.所以在进行表达设计时要设法去除其N端的甲硫氨酸.通常低免疫原性是重组多肽药物的一个重要特点.

重组人肿瘤坏死因子受体-Fc融合蛋白质控方法和标准的研究

目的 建立重组人肿瘤坏死因子受体 Fc融合蛋白质控方法和质量标准。方法 用中和TNF α生物学活性的方法测定重组人肿瘤坏死因子受体 Fc融合蛋白效价 ,用胰蛋白酶酶切分析肽图 ,用ELISA方法分别测定蛋白A、残留宿主细胞蛋白残留量和重组人肿瘤坏死因子受体 Fc融合蛋白含量。结果 建立了重组人肿瘤坏死因子受体 Fc融合蛋白的生物学活性、肽图分析、残留蛋白A等质控方法和质量标准。结论 建立的方法和质量标准已用于重组人肿瘤坏死因子受体

重组人干细胞因子生物学活性测定的质量控制研究

目的 :建立干细胞因子 (stemcellfactor,SCF)体外生物学活性测定方法 ,用于该制品生物学效价测定。方法 :应用类原巨核细胞白血病细胞系的UT 7细胞株 ,比较不同细胞浓度、培养时间等条件下应用MTT染色的效果 ,确定最佳实验条件 ,并用国家参考品校正SCF效价。结果 :UT 7细胞对SCF的反应存在量 效关系 ,并确定了最佳测定条件和剂量范围 ,效价测定重复性好 ,结果准确、客观 ,并用于重组SCF新生物制品的效价测定。结论 :已建立的UT 7细胞依赖株测定SCF生物学活性的方法可用于SCF的生物学活性的常规评价。

长效干扰素质控方法的研究

目的 研究和确定新型长效干扰素制品质量控制方法。方法 采用Wish细胞 VSV病毒系统测定干扰素的生物活性 ,采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱法测定相对分子质量 ,采用毛细管等电聚焦法测定样品的等电点 ,应用胰蛋白酶消化法测定肽图。结果 确定了长效干扰素制品的质控方法 ,应用该方法测定 3批长效干扰素比活性为 10 6IU/mg蛋白 ,相对分子质量为 6 30 5 7,等电点为 5 .6。结论 建立的质控方法可以有效地控制长效干扰素的制品质量。

重组人内皮抑素的质控方法研究

目的 通过研究并建立重组人内皮抑素质量控制方法。方法 用内皮细胞迁移法测定内皮抑素的生物学活性 ;胰酶消化法测定肽图 ;分别用非还原型SDS PAGE和RP HPLC法测定样品的纯度 ;其余项目按《中国生物制品规程》2 0 0 0年版进行测定。结果 建立了内皮抑素的活性测定方法 ,应用该方法测定 3批内皮抑素比活性分别为1 4 5× 10 6 ,1 5 7× 10 6 和 2 73× 10 6 u·mg- 1 蛋白 ,肽图测定结果显示 3批样品批间一致 ,SDS PAGE纯度和RP HPLC纯度均大于 99% ,其余各项指标均符合规定。结论 建立的方法可有效地控制内皮抑素制品的质量。

重组人干扰素-α2a(IFN-α2a)的圆二色谱分析

目的:研究测量温度和蛋白质浓度对重组人干扰素-α 2a(rhIFN-α 2a)圆二色谱的影响,进而研究对 rhIFN-α 2a 二级结构比例的影响。方法:分别研究了测量温度和蛋白质浓度对 rhIFN-α 2a 圆二色谱的影响,另外还对不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱进行了比较。结果:测量温度在60～95℃之间,rhIFN-α 2a 圆二色谱的形状发生改变,三级结构遭到破坏,二级结构发生改变;在5～60℃温度区间,二级结构相对稳定。rhIFN-α2a 的各二级结构比例在1.5～0.006nag·mL^(-1)范围内相对稳定。不同厂家、不同批次的4批 rhIFN-α 2a 的圆二色谱形状基本一致,4种二级结构的比例相近。结论:在一定的温度和浓度范围内,rhIFN-α 2a 的圆二色谱相对稳定,且不同批次的测量结果具有很好的一致性。圆二色谱可用于蛋白质类药物的质量控制。

第4批蛋白含量测定国家标准品的制备和标定

目的:建立蛋白含量测定用国家标准品。方法:按2005年版中国药典三部、WHO 和 ICH 标准品有关要求,对标准品进行制备、分装、冻干、质量检测并开展协作标定。结果:批号为2002/04的蛋白含量测定标准品经检测,外观、无菌实验合格。pH 为7.5,水分含量为0.7%。蛋白含量经过6家单位共计39次的凯氏定氮法协作标定后,确定其含量为21.24 mg·支^(-1),标准差为0.694 mg·支^(-1),总体 RSD 为1.06%。采用 Lowry 法对第3批蛋白含量测定国家标准品与该批蛋白标准品进行比较后,结果表明两者无显著差异。结论:该批蛋白含量测定标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准用于 Lowry 法蛋白含量测定,特定为第4批蛋白含量测定国家标准品。