绵羊NYD-SP27基因在BHK-21细胞中的稳定表达及其特征鉴定

旨在构建稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞株,对NYD-SP27基因的表达特征进行分析,为进一步研究NYD-SP27基因功能奠定基础。本研究克隆绵羊NYD-SP27基因,并将其插入到真核表达载体pDsRed1-C1中,利用猪捷申病毒2A肽(P2A)将NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白连接以实现共表达,将重组质粒pDsRed-P2A-Flag-NYDSP转染至BHK-21细胞中,经G418筛选获得稳定转基因细胞株,利用RT-PCR、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay,IFA)和Western blot对NYD-SP27基因的表达进行鉴定。结果表明,NYD-SP27基因稳定整合至宿主细胞基因组;NYD-SP27蛋白能够在BHK-21细胞中正常表达,分子大小约为63ku;在NYD-SP27蛋白和红色荧光蛋白翻译过程中,P2A成功自我剪切。本研究成功构建了绵羊NYD-SP27基因的真核表达载体,建立了稳定表达绵羊NYD-SP27基因的BHK-21细胞系。

重组人睫状神经营养因子蛋白质定量检测方法的建立

采用ELISA双抗体夹心法,建立一种快速灵敏的定量检测rhCNTF成品蛋白含量的方法。结果显示,rhC-NTF抗原浓度在(0～25)ng范围内线性良好(r>0.99),灵敏度为0.3ng/ml,与其他重组细胞因子无交叉反应,样品的检测结果与理论含量相吻合,CV<15%,该方法检测速度快、重复性好、灵敏度高、特异性好。

产纤维素酶真菌菌株的分离筛选及产酶条件优化

【目的】由于真菌的纤维素酶系较全,且可分泌至胞外,易分离,所以试验致力于筛选高产纤维素酶真菌菌株.【方法】利用羧甲基纤维素钠培养法、刚果红染色法、纤维素酶活性测定法从样品中分离筛选出产纤维素酶菌株,同时结合菌落形态观察、显微镜观察和ITS序列同源性分析进行鉴定.【结果】通过初筛,筛选出15株Hc值较大的产纤维素酶真菌菌株,再经过液体发酵复测羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活,筛选出一株产纤维素酶活最高的菌株B-2-3,经鉴定B-2-3为烟曲霉（Aspergillus fumigatus）,其羧甲基纤维素酶活为2 341.76U/mL,滤纸酶活为398.18U/mL.经过产酶条件优化,确定其最适产酶条件为温度25℃、接种量4μL、蛋白胨0.5~0.6g/L、CMCNa 0.3~0.35g/L、pH 6.5.【结论】筛选出一株产纤维素酶活较高的烟曲霉菌株B-2-3.

苹果树内生菌筛选及其对苹果腐烂病防治效果

为了获得苹果腐烂病菌的内生拮抗菌株,并初步研究其拮抗特性以及防治效果,用平板对峙法从苹果树根部、茎部、叶片筛选到具有拮抗作用的内生菌,明确其无菌滤液的抑菌效果,并测定拮抗菌株对苹果离体果实腐烂病害的防治效果。从分离纯化的56株内生菌中筛选出12株苹果腐烂病菌的拮抗菌,其中G2、G9、J32和Y40的抑菌效果比较明显,分别为69.64%、58.93%、67.86%、67.88%,当G2和G9的无菌滤液浓度达到8%时,其抑制率最高,分别达到了78.26%、76.29%,J32和Y40的无菌滤液浓度达到8%时抑制率均达到72.33%;在苹果果实离体试验中,G2、Y40的抑制率分别达到32.56%和26.89%;所筛选的这4株菌株对小麦赤霉病菌(Fusa Hum graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、烟草赤星病菌(Alternaria longipes)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporun f.sp.vasinfectum)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerium)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)均有一定的抑制作用,其中抑制率最高达79.65%;4株菌对苹果腐烂病病原菌的抑制大多数会导致病原菌菌丝畸形。试验结果表明拮抗真菌G2、G9、J32和Y40均对苹果腐烂病菌有较强拮抗作用,为进一步开展苹果主要病害的生物防治研究提供了潜在资源菌。

Pfs25蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA的建立

目的:制备恶性疟原虫子孢子囊表面膜蛋白Pfs25的单克隆抗体(mAb),建立检测Pfs25蛋白的双抗体夹心ELISA方法。方法:纯化毕赤酵母表达的重组Pfs25蛋白,并免疫BALB/c小鼠,采用骨髓瘤细胞Sp2/0与免疫BALB/c鼠脾细胞杂交的细胞融合技术,通过间接ELISA检测获得分泌抗Pfs25抗体的阳性杂交瘤细胞株,通过免疫F1鼠诱生腹水,纯化腹水,并进行mAb的各项生物学鉴定。辣根过氧化物酶(HRP)标记纯化后的抗体,以4B7为包被抗体,1B4为酶标抗体,建立了双抗体夹心ELISA法。结果:获得3株抗Pfs25的杂交瘤细胞株,其中2株有良好的稳定性和特异性。并建立了双抗体夹心ELISA检测法,检测有效范围在0.07～1 mg/mL,其检测灵敏度为41.6 ng/mL。结论:成功制备抗Pfs25蛋白的单克隆抗体,并建立了一种可用于Pfs25蛋白检测的双抗体夹心ELISA法,为Pfs25蛋白制备传播阻断型疟疾疫苗奠定了基础。

不同有机酸体系中紫薯花色苷热降解稳定性研究

研究了紫薯花色苷在乳酸、酒石酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸体系中的热降解稳定性,通过建立紫薯花色苷热降解动力学模型,分析紫薯花色苷在不同有机酸体系中的热降解速率常数k、半衰期t1/2及热降解活化能Ea,为提高紫薯花色苷的稳定性提供实验参考和理论依据。结果表明:紫薯花色苷的热降解符合一级反应动力学模型,随着温度的升高,紫薯花色苷降解速率明显加快;在有机酸体系中,紫薯花色苷的热降解活化能Ea及半衰期t1/2较空白组均有所提高,即稳定性增强。有机酸辅色后Ea值分别提高了35.71%(酒石酸)、32.06%(乳酸)、20.61%(苹果酸)、12.60%(乙酸)、45.31%(柠檬酸)。其中柠檬酸、酒石酸、乳酸的作用效果较好,可考虑作为辅色剂。

产纤维素酶细菌的分离筛选与鉴定

通过筛选获得高产纤维素酶细菌菌株,为纤维素酶制剂研制及纤维素酶工程菌构建提供试验材料。采用刚果红平板从牛羊粪便及腐败的玉米秸秆和木屑中分离产纤维素酶菌株,以DNS法测定酶活,根据酶活复筛产纤维素酶分离菌株;观察分离菌株的形态、染色与培养特性;应用16S rDNA通用引物扩增菌株基因组DNA,测序结果提交GenBank数据库进行Blast比对分析和相似性搜索,作出复筛菌株种的鉴定。结果表明:分离获得16株纤维素酶产量较高的细菌菌株,均为革兰氏阳性菌,菌体呈短杆状、具中央芽孢,经16S rDNA序列比对分析和相似性搜索,鉴定为10株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、6株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P<0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。

鼠抗肿瘤坏死因子-α单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备高中和活性的鼠抗肿瘤坏死因子-α(TNF-α)单克隆抗体,并进行鉴定。方法用重组TNF-α免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗TNF-α单抗,纯化后,用间接ELISA法和微量细胞病变MTT法检测抗体效价,ELISA相加试验测定抗原表位,硫氰酸铵洗脱法测定单抗的相对亲和力指数,并进行类及亚类、细胞染色体核型、特异性及稳定性检测。结果筛选出7株分泌抗TNF单克隆抗体的细胞株,其中6株具有较高的中和活性和良好的稳定性,其细胞上清及腹水的中和效价分别为1∶40～1∶160和(1～3)×10-4,7株单抗均为IgG类IgG1亚类,轻链类型均为κ,细胞核型分析符合杂交瘤细胞特征,特异性良好,5H10株与其余6株有不同的抗原表位,相对亲和力指数为0.4～1.5mol/L。结论已成功制备具有高中和活性的鼠抗TNF-α单克隆抗体,为抗人TNF-α嵌合抗体的构建奠定了基础。

鼠源神经生长因子临床受试者血清抗体检测

目的:采用酶联免疫测定法(ELISA)检测鼠神经生长因子临床用药病人的血清抗体。方法:通过直接标记鼠神经生长因子(NGF),建立了一种检测人抗鼠NGF抗体的检测方法;即双抗原夹心法检测人抗鼠NGF抗体。将此方法应用于检测临床用药病人的血清抗体,并与间接法进行了比较。结果:双抗原夹心法检测94份正常人血清,无一份假阳性,在检测临床病人血清时,亦得到了较好的结果。而间接法的非特异性则达10％。结论:双抗原夹心法方法可靠,可用于鼠源神经生长因子临床试验;血清样本检测证明临床实验病人血清抗鼠NGF抗体含量与正常人无显著差异。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。

鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法的建立及初步应用

为了建立一种快速、高效和简便的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法,根据沙门菌侵袭蛋白基因invA的高度保守区域,利用Primmer 5.0软件设计2对特异性的套式引物,以提取的沙门菌DNA为模板克隆invA基因,将其连入T载体并计算拷贝数作为套式PCR的模板,在对反应条件进行优化的基础上,建立最佳的套式PCR反应条件,确定其上、下游引物用量分别为0.3μL,套式PCR的第1次退火温度为57.4℃,第2次为53.5℃。应用该方法对已构建好的不同浓度的标准阳性质粒作为模板进行检测,其灵敏度为102拷贝数/20μL,远高于常规PCR的106拷贝数/20μL。用建立的套式PCR方法对从新疆石河子某鸡场采集的25样品进行检测,与传统的诊断方法比较符合率达95.00%。建立的鸡白痢沙门菌套式PCR检测方法具有快速、可行、特异性强、准确率高等特点,为鸡沙门菌病的早期诊断和研究提供了技术支撑。

恶性疟原虫膜蛋白Pfs25在毕赤酵母中的组成型表达

目的:Pfs25蛋白是传播阻断型恶性疟疾疫苗的侯选抗原,在毕赤酵母中表达Pfs25蛋白,并对表达产物进行鉴定。方法:参照GenBank中公布的pfs25基因序列,通过毕赤酵母喜好密码子分析人工合成目的基因;采取定向克隆策略构建重组表达质粒pfs25/pGAPZαA,经BstXⅠ线性化,电转染法转化酵母菌株GS115,在Zeocin抗性的筛选培养基上获得表达目的基因的pfs25/pGAPZαA/GS115重组酵母菌,SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物;通过在YPD培养基上传代培养和目的基因表达,验证重组菌株的遗传稳定性。结果:在毕赤酵母中表达了Pfs25蛋白,且重组菌株遗传性质稳定。结论:为研制基于Pfs25蛋白的传播阻断型恶性疟疾疫苗奠定了基础。

马鞍面上的多元Birkhoff插值问题研究

以二元Birkhoff插值研究为基础,进一步研究了三维欧氏空间中马鞍面上的Birkhoff插值。首先给出了马鞍面上的多元Birkhoff插值相关定义,对插值条件组的拓扑结构进行了较为深入的研究,然后给出了构造多元函数插值适定泛函组的添加马鞍面法,最后给出具体实例进行验证。Based on the research of two-dimensional Birkhoff interpolation, this study further investigates Birkhoff interpolation on a saddle surface in three-dimensional Euclidean space. First, relevant definitions of multivariate Birkhoff interpolation on saddle surfaces are provided. An in-depth study of the topological structure of the interpolation condition set is conducted. Then, the method of adding saddle surface techniques to construct a suitable functional set for multi-variable function interpolation is introduced. Finally, specific examples are provided for verification.

重组铜绿假单胞菌外毒素结构域Ia片段的佐剂功效研究

采用分子克隆技术,将铜绿假单胞菌PA103株编码的外毒素结构域Ia(DomainIa)的基因重组于原核表达载体pET42b(+)上,构建了pETEPA103蛋白表达载体。转化感受态大肠杆菌DE3。经IPTG诱导表达,初步纯化表达蛋白,用以免疫BALB/c纯系小鼠。制备小鼠脾淋巴细胞悬液,经刀豆素A(ConA)刺激后,用MTT比色法检测特异性淋巴细胞增殖反应。通过rEPA皮下注射BALB/c小鼠耳廓,诱导小鼠迟发型过敏反应(DTH)。采用特异性淋巴细胞增殖反应和DTH试验来检测pETEPA103表达蛋白所引起的小鼠细胞免疫应答水平,淋巴细胞增殖情况与DTH均可间接反映细胞免疫应答水平,进而评价重组铜绿假单胞菌外毒素(rEPA)DomainIa蛋白片段的佐剂功效。

高层住宅电梯存在的安全隐患及对策研究

本文对当前高层住宅电梯的安全现状进行了分析,并通过事故树分析法列出高层住宅电梯自身系统方面和其他因素影响方面存在的隐患,并分别对这些隐患所可能造成的事故进行定性和定量的分析,得出相应的解决对策,最后引出高层住宅电梯需要进行更标准化的管理。

正交设计优化电转染CHO细胞的方法

目的:探讨细胞电穿孔转染的优化方法。方法:按照L9(34)正交表安排各因素水平的细胞电敏感性实验,以台盼蓝染色计数确定细胞存活率,最接近50%存活率为最优方案,根据最优方案将CHO-dhfr-细胞与DNA混匀电穿孔转染以验证正交设计结果。结果:CHO-dhfr-细胞电转染的优化参数为低离子强度Tris-Cl缓冲液、750 V/cm、50μF、电击2次、间隔1 min,各因素对转染的影响大小依次为缓冲液、电场强度、脉冲次数、电容。结论:确定了电穿孔法转染CHO-dhfr-细胞的方法,为进一步应用该细胞株表达重组蛋白打下了基础。

等电聚焦法测定2.5S NGF的等电点

采用水平等电聚焦法测定了２５Ｓｍ神经生长因子（ＮＧＦ）的等电点。经测定，纯化的２５ＳｍＮＧＦ的等电聚焦为三条带，这与文献报道相一致，等电点ｐＨ值分别为ｐＨ８７、９０、９３，其主要成分为β亚基ＮＧＦ及其修饰物的混合物，包括在羧基端失去８个氨基酸残基和在氨基端失去１个精氨酸残基，由这三种组分构成的ＮＧＦ统称为２５ＳｍＮＧＦ。

溅射功率对Fe_(81)Ga_(19)薄膜结构和磁性的影响

采用射频磁控溅射技术在Sr Ti O_3(100)衬底上制备Fe_(81)Ga_(19)薄膜。利用XRD、AFM和VSM表征了Fe_(81)Ga_(19)薄膜的生长取向、内应力、表面形貌和磁性,研究了不同溅射功率(60~100 W)对Fe_(81)Ga_(19)薄膜结构和磁性能的影响。结果表明,所有薄膜主要以A_2相和L1_2相存在。随着溅射功率的增大,A_2相衍射峰的强度缓慢降低,内应力显著增加,表面粗糙度降低,薄膜的剩余磁化强度和饱和磁化强度明显减小,而矫顽力保持不变,都为50 Oe。

中医博士学位论文摘要专有名词术语英译失误现状与对策

目的 本研究对中医博士学位论文摘要及英译进行研究,主要探讨摘要中中医专有名词术语英译存在的突出问题,并提出探索性的对策。方法 检索中国知网中北京中医药大学2017—2021年中医博士学位论文摘要共270篇,排除民族语言书写者34篇与未涉及名词术语者90篇,最终纳入146篇。146篇摘要中共提取术语852条。以世界卫生组织、世界中医药学会联合会、国家中医药管理局颁布的术语英译作为参考标准,对名词术语英译进行问题归类与统计分析。结果 失误率≥50的摘要占146篇摘要的半数以上;852条名词术语中,翻译正确者408条,翻译失误者444条。444条翻译失误术语中,误译者243条(54.73%);滥用音译者107条(24.10%);漏译者94条(21.17%)。结论 当前术语翻译失误率整体情况较为严重,且近5年未得到明显改善,提升摘要英译质量,需多方共同努力。