钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子--微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示:在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100A4和LC3Ⅱ在蛋白表达水平随感染时间的延长先上升后下降,在12 h时表达最高(P<0.001),且自噬体数量明显增多。在mRNA水平上,与siNC组相比,siNC+BCG感染组S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),当BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在mRNA水平的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,P<0.001)下调;在蛋白水平上,与未感染组相比,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量显著增多(P<0.05),BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量均极显著减少(P<0.001);与未感染组相比,BCG组自噬体的数量极显著增多(P<0.01),siS100A4+BCG组与siNC+BCG组相比,自噬体的数量显著减少(P<0.05)。S100A4对BCG感染巨噬细胞诱导的自噬具有调控作用,S100A4能够促进BCG诱导的THP-1细胞自噬。

BCG感染对小鼠肺组织中NLRP3炎性小体相关分子表达的影响

探究牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染C57BL雌性小鼠后,小鼠肺组织中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor pyrin domain-containing 3,NLRP3)炎性小体相关分子的表达水平.设置BCG感染组和对照组,BCG感染组小鼠经气管滴注BCG菌液,对照组小鼠经气管滴注PBS缓冲溶液.BCG感染28 d后处死小鼠并摘取肺组织.经HE染色法观察并鉴定小鼠肺组织的损伤程度,通过Western blot和qRT-PCR实验检测NLRP3炎性小体相关分子的表达水平.结果表明,BCG感染后,小鼠肺组织发生炎性细胞浸润,NLRP3,ASC,Caspase-1,Caspase-11蛋白及mRNA表达量上调,表现出极显著差异(P<0.01).表明BCG感染后,小鼠肺组织发生炎性病变,并上调NLRP3炎性小体相关分子的表达水平.

澳粉作业工人血清超氧化物歧化酶活性变化的研究

为揭示粉尘作业工人血清超氧化物歧化酶活性的变化规律及其影响因素，对某市码头澳粉作业工人血清SOD活性进行规定，结果显示：该作业工人SOD活性显著升高，且高浓度接尘组显著高于低浓度组；肺纹理增加组显著高于肺纹理正常组；吸烟、饮酒的工人亦明显上升，且接尘与吸烟、饮酒三者存在协同作用关系．

PERK/ATF4/CHOP通路对BCG诱导THP-1细胞NLRP3炎性小体活化的调控作用

旨在探讨牛分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1细胞后PERK/ATF4/CHOP通路对NLRP3炎性小体的调控作用。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞后,采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达;在BCG单独感染或与PERK抑制剂GSK2656157共处理THP-1细胞后,分别采用qRT-PCR和Western blot方法检测NLRP3炎性小体相关分子和PERK/ATF4/CHOP通路标志性分子在mRNA、蛋白水平的表达,采用ELISA方法检测白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18)的释放量,采用CCK-8方法检测THP-1细胞活率,采用免疫荧光检测NLRP3与ASC的共定位。结果表明:在BCG单独感染THP-1细胞不同时间后,PERK、NLRP3、ASC和Caspase-1在蛋白水平的表达均随感染时间延长而升高,且在24 h达到最高(P<0.001),IL-1β和IL-18的释放随时间递增,24 h达到最高(P<0.001)。在BCG单独感染或与PERK小干扰RNA共处理THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,siNC+BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.001)上调,而siPERK+BCG感染组与siNC+BCG感染组相比,NLRP3等关键分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01,P<0.001);在BCG单独感染或与GSK2656157共同作用THP-1细胞24 h后,与未感染对照组相比,BCG感染组NLRP3、ASC、Caspase-1、PERK、ATF4、CHOP分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)上调,IL-1β和IL-18的释放极显著增加(P<0.001),细胞活率极显著下调(P<0.001),而BCG+GSK2656157感染组与BCG单独感染组相比,上述分子的mRNA和蛋白表达均显著(P<0.05)或极显著下调(P<0.01),IL-1β和IL-18的释放显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)减少,细胞活率显著上调(P<0.05),免疫荧光的结果显示NLRP3与ASC存在共定位,且GSK2656157可以极显著抑制BCG感染引起的NLRP3和ASC的表达上调(P<0.001)。以上研究结果表明,PERK/ATF4/CHOP通路对BCG感染巨噬细胞后NLRP3炎性小体的活化具有调控作用。

Wnt5a介导Wnt/Ca^(2+)通路对BCG诱导牛原代肺泡上皮细胞自噬的调控作用

旨在探讨体外分离培养牛肺泡上皮细胞(bovine alveolar epithelial cells,BAECs)的方法及Wnt5a对牛结核分枝杆菌卡介苗(bacille Calmette-Guérin,BCG)感染BAECs细胞自噬的调控机制。试验选用酶联合消化法和机械刮刷法分离细胞,差速贴壁法纯化BAECs,免疫荧光染色检测上皮细胞标志物角蛋白14(cytokeratin 14,CK14)和角蛋白5(cytokeratin 5,CK5)的表达;BCG感染BAECs,并用Box-5抑制Wnt5a的表达,Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白及非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达。结果表明,采用酶联合消化法和机械刮刷法能够成功分离纯度较高的BAECs,细胞经CK14和CK5鉴定为阳性;BCG感染BAECs促进Wnt5a表达,增加细胞自噬,Box-5预处理下调BCG诱导的细胞自噬相关蛋白LC3II、P62、Atg7及Atg5的表达,且抑制非经典Wnt/Ca^(2+)信号通路相关蛋白Wnt5a、CaMKII及NFAT的表达。综上,试验成功建立BAECs分离培养方法,BCG感染增加BAECs内Wnt5a表达和细胞自噬,抑制Wnt5a下调BCG诱导的BAECs细胞自噬,且Wnt5a是通过非经典Wnt/Ca^(2+)信号通路调控BCG诱导的BAECs细胞自噬。

ATF6/CHOP信号通路对减毒牛结核分枝杆菌感染的THP-1细胞焦亡的调控作用

目的:探讨转录激活因子6(ATF6)/CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路对牛分枝杆菌减毒株(卡介苗,BCG)感染的THP-1细胞焦亡的调控作用。方法:在感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞2、6、12、24和48 h基础上,设置si-NC组、si-NC+BCG组、si-ATF6+BCG组及si-CHOP+BCG组。si-NC组转染干扰阴性对照24 h后正常培养;si-NC+BCG组先转染阴性对照24 h后以感染复数为10∶1的BCG感染24 h;si-ATF6+BCG组和si-CHOP+BCG组分别转染si-ATF6和si-CHOP 24 h后再用感染复数为10∶1的BCG感染24 h。采用Western blot检测cleaved ATF6、CHOP、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、pro-caspase-1、caspase-1 p20、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、IL-1βp17、IL-18 p22及消皮素D-N端片段(GSDMD-N)蛋白表达;采用免疫荧光检测GSDMD蛋白表达;采用CCK-8法检测细胞活力。结果:Western blot结果显示,BCG感染THP-1细胞后,cleaved ATF6和CHOP蛋白的表达随感染时间延长逐渐升高,48 h达到最高,而GSDMD-N蛋白在24 h表达最高(P<0.01)。与si-NC组相比,si-NC+BCG组的cleaved ATF6、CHOP、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1 p20、ASC、IL-1βp17、IL-18 p22及GSDMD-N蛋白表达显著上调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著增加(P<0.01),细胞活力显著下降(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-ATF6+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01);与si-NC+BCG组相比,si-CHOP+BCG组上述蛋白表达显著下调(P<0.01),细胞内GSDMD含量显著下降(P<0.01),细胞活力显著上升(P<0.01)。结论:ATF6/CHOP信号通路对BCG感染的THP-1细胞焦亡具有调控作用。

LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染的巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用

目的揭示LXR-ABCA1/ABCG1通路对BCG感染后巨噬细胞凋亡和炎性反应的调控作用。方法采用T0901317预处理RAW264.7巨噬细胞2 h和BCG感染24 h,设置4个实验组:对照组、T0901317组、BCG感染组和T0901317+BCG感染组。采用Western blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9和TLR信号通路相关蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κB p65、IRF3、TBK1的表达,采用ELISA方法检测细胞培养上清中促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。结果与对照组比较,BCG感染组凋亡相关蛋白cleaved-Caspase3、cleaved-Caspase8、cleaved-Caspase9及依赖MyD88途径蛋白TLR2、TLR4、MyD88、TRAF6、p-NF-κBp65的表达均上调(P<0.01),促炎细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平上升(P<0.01);与BCG感染组相比,T0901317+BCG感染组上述蛋白的表达下调(P<0.01),促炎细胞因子表达水平下降(P<0.01),而MyD88非依赖途径蛋白IRF3、TBK1的表达在各组间差异不显著(P>0.05)。结论激活LXR-ABCA1/ABCG1通路可抑制由BCG感染引起的巨噬细胞凋亡及MyD88途径介导的炎性反应。