复印机不能代替笔记本——谈研究生做笔记的训练

复印机不能代替笔记本———谈研究生做笔记的训练●马涧泉摘要复印的滥用，看得见的损失是资源的浪费，无形的损失则是研究生们忽视了做笔记的自我训练。在阅读大量参考文献的同时，养成做笔记的习惯，可更牢固、深刻地掌握新知识，培养出精读的本领，并在一定程度上有助...

用定点突变技术研究转录终止——rpoBC操纵子上~tL7茎环结构的作用研究

E.coli RNA聚合酶ββ'亚单位编码的基因rpoBC与核糖核蛋白基因rplJL共同构成rpoBC操纵子。rpl-rpo间区转录终止信号~tL7的转录产物RNA有两组富含C-G的反向对称结构及一串寡聚U;反向对称区可形成1:2和3:4茎环或单一5:6茎环。 用M13mp11噬菌体插入~tL7的112bp片段重组M13mp11-490,在此基础上用定点突变技术建立~tL7的七核苷酸缺失突变体,从而破坏1:2茎环,建成M13mp11-85。 分别把原型~tL7及缺失型~tL7~v克隆到表达质粒pHR24中,构建成pHR37(P_ftsQ^tL7-galk)及pHR24-9(p_ftsQ-~tL7~v-galk)。测定galk基因产物半乳糖激酶活性,推算转录的终止效率。结果表明:~tL7终止效率为50％,~tL7~v为20％。说明仅有3:4茎环及寡聚U,即具终止作用; 1:2茎环通过某种方式加强3:4茎环从而提高终止效率。

基因工程技术及其在医学上的应用第一讲如何获得目的基因

基因工程技术及其在医学上的应用第一讲如何获得目的基因中山医科大学生化教研室马涧泉，伍新尧基因工程是７０年代出现的高科技，对生命科学及医学发展有深远影响。本连载就如何获得目的基因，基因工程的酶学基础，如何得到高效表达，核酸探针的临床应用，聚合酶链反应（...

克隆技术与人类基因组定位计划——并答“克隆热”是否降温

去年初,英国科学家宣布克隆绵羊成功,社会舆论掀起了一阵"克隆热"。自然科学、社会科学界和广大公众都加入了议论。我当时应约在报上发表了两篇介绍克隆基本知识的文章。最近竟收到几封读者来信,有些熟朋友也问同一问题:克隆话题最近较少见报,却见有把抄袭作品、假冒商品讽刺为"克隆"的标题。克隆竟成了贬义词!到底克隆是好事还是坏事?克隆热在降温吗?首先肯定。

什么是安吉奥斯塔丁

5月初,广州各大报的国际新闻栏目版首,都不约而同地简介了5月3日美国《纽约时报》发布有关癌症治疗新药,引起股票狂升的消息。这是新闻,又是转引,不可能有足够背景材料特别是科技上的背景材料向读者作详尽说明。本文试作为"新闻导读"向读者介绍这两种新药物——安吉奥斯塔丁和恩多斯塔丁出现的来龙去脉。科技新闻引起股票狂升的联想政治新闻可以使股票行情起落已是一般人的常识。

重组人蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与测序

蛋白激酶ＣＫ２是一种存在的信使非依赖性丝／苏氨酸蛋白激酶．它是由两个催化亚基（α或α′）和两个调节亚基（β）组成的不均一四聚体．用反转录ＰＣＲ从ＨＬ－６０细胞中获得了人蛋白激酶ＣＫ２β亚基编码区ｃＤＮＡ，将ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切ＰＣＲ产物连接到表达载体ｐＴ７－７的ＮｄｅⅠ／ＨｉｎｄⅢ双酶切位点中．转化感受态细菌ＤＨ５α获得转化子，阳性筛选率为７２％．限制性酶切分析结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论推测值相符．随机挑选４个阳性质粒测定其插入片段ＤＮＡ序列，结果显示有２个含有正确插入的人蛋白激酶ＣＫ２βｃＤＮＡ，命名为ｐＴＣＫＢ．其余２个克隆分别存在１个和２个点突变，即在其编码区ｃｏｎｄｏｎ１４８的ＴＣＡ→ＴＴＡ，结果Ｓｅｒ→Ｌｅｕ；另一个则在Ｃｏｎｄｏｎ１４３ＧＴＧ→ＡＴＧ，Ｖａｌ→Ｍｅｔ；Ｃｏｎｄｏｎ１７０ＧＴＧ→ＧＣＧ，Ｖａｌ→Ａｌａ．重组质粒（ｐＴＣＫＢ）克隆的成功，将为在原核细胞中表达蛋白激酶ＣＫ２β亚基以及利用ＣＫ２βｃＤＮＡ作为探针进行深入研究打下基础．

目的基因

基因工程是七十年代出现的高科技,近20年来,基因工程的成果,已广泛用于工、农业生产;用于生命科学的研究;对生命科学包括医学的发展有深远的影响。基因是指染色体上有功能的片段,染色体上的核酸就是遗传的物质基础。分子生物学的中心法则所描述的遗传信息流动方向如下: 这个过程,也称为基因的表达。按照人的愿望,设计和建造自然界中并无天然存在的基因表达体系,就是基因工程的基本构思;其具体定义为:把核酸分子插入质粒、病毒或其他载体,组成重组体。

DAPK1基因开放读码序列的克隆、序列分析及诱导Raji细胞凋亡

目的 :探讨死亡相关蛋白激酶 (DAPK1)在肿瘤的形成、转移中所起作用 ,克隆DAPK1基因的开放读码序列 (ORF)。方法 :根据GenBank提供的核苷酸序列 ,自行设计引物 ,用RT -PCR从K562细胞中扩增DAPK1基因的ORF ;用质脂体将pcDNA3 1(+ ) -DAPK1转染到Raji细胞 ,Hoechst 3 3 2 58染色观察细胞凋亡 ,MTT法观察DAPK1基因对细胞生存的影响。结果 :DAPK1基因的ORF克隆到质粒pMD18-T ,测序鉴定 ;分析结果显示 ,从K562细胞成功扩增 43 0 0bp的DAPK1基因ORF有 7处突变 ,其中 6处是同义突变 ,1处是基因的单链核苷酸多态性 ;DAPK1基因的ORF克隆到真核表达载体pcDNA3 1(+ ) ,转化到Raji细胞 ;转染 48h后 ,可以检测到DAPK1的表达 ,并可以观察到细胞发生凋亡。结论 :大片段的基因可以采用RT -PCR法直接克隆 ,采用常规的转染技术可以将大片段基因转染到宿主细胞 ;成功克隆具有活性功能DAPK1基因ORF 。

六种中草药有效成分对钙调素依赖环核苷酸磷酸二酯酶的作用

用正交设计观察了6种中草药有效成分和三氟啦嗪（TFP）对钙调素依赖环核苷酸磷酸二酯酶（CaM-PDE）激活活性的影响，结果表明：a）两面针碱（Nit）、槲皮素（Que）和TFP对CaM－PDE激活活性具有明显抑制作用（P＜0．01），其抑制强度：Qne＞TFP＞Nit；小檗碱（Ber）、麻黄碱（Eph）和鱼腥草素（Hou）对CaM－PDE无明显作用（P＞0．05），青藤碱（Sin）对酶的作用可疑；c）Qne与TFP、Nit与TFP之间有协同作用。结果提示Nit和Que可能是CaM拮抗剂，两者的作用位点似乎不同于TFP。

DAPK1基因转染对高转移性肺癌细胞PGCl_3的影响

背景与目的:死亡相关蛋白激酶DAPK1失活是影响非小细胞肺癌患者生存的独立因子,过表达的DAPK1可以诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤转移,但抑制转移的机制尚未完全清楚。本文探讨DAPK1基因抑制高转移性肺癌PGCl3细胞生长及转移的可能机制。方法:利用基因重组技术构建含DAPK1基因开放读码框(ORF)的真核表达载体pcDNA3.1-DAPK1,用脂质体LipofectAMINE2000介导转染PGCl3细胞系,检测转染后PGCl3细胞的生长曲线、体外软琼脂克隆形成率、体外侵袭、运动和粘附能力的变化,同时检测了胶原酶活性,p53,bcl-2基因表达的变化。结果:转染DAPK1基因的细胞生长比空白组及pcDNA3.1转染组减缓;体外软琼脂克隆形成率下降P<0.05;pcDNA3.1-DAPK1转染组体外侵袭能力是空白组的68.5%,而pcDNA3.1转染组是空白组的88.0%;pcDNA3.1-DAPK1转染组运动能力是空白组的87.3%,pcDNA3.1转染组是空白组的95.7%;pcDNA3.1-DAPK1转染组粘附能力是空白组的62.7%,pcDNA3.1转染组是空白组的91.2%;各组的胶原酶变化不明显;pcDNA3.1-DAPK1转染组p53基因表达升高,bcl-2基因下调。结论:DAPK1基因的过表达可以在一定程度上逆转PGCl3细胞的恶性表型,使PGCl3细胞生长受抑制,体外侵袭、运动和粘附能力下降,p53基因表达的上调及bcl-2基因表达下调。

地塞米松诱导裸鼠脾细胞程序性死亡的研究

本文用地塞米松（ＤＥＸ）与裸鼠脾细胞共培养，发现ＤＥＸ能有效地诱导脾细胞（包括ＮＫ细胞）发生细胞程序性死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）或凋亡（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）从而明显抑制脾ＮＫ细胞活性。结果表明：（１）常规电镜显示细胞收缩但胞膜完整，核凝缩，呈现典型的ＰＣＤ特征。（２）加入ＤＥＸ的脾细胞ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳呈现特征性梯状图谱，片段大小为１８０ｂｐ或其倍数，（３）脾ＮＫ细胞活性测定结果表明ＤＥＸ浓度在１０￣（－８）～１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ范围内可诱导出明显的ＰＣＤ现象发生；而当浓度太低（１０￣（－１０）ｍｏｌ／Ｌ）时则ＰＣＤ现象不明显；当浓度太高（１０￣（－４）ｍｏｌ／Ｌ）时ＰＣＤ现象也不明显，呈现特有的剂量效应关系。（４）动力学结果显示（根据电镜及电泳图）在ＤＥＸ作用１２ｈ已开始有典型的ＰＣＤ现象发生，２４ｈ后则以坏死现象为主。

丁酸钠诱导Raji细胞表达DAPK的研究

目的探讨丁酸钠(SB)对人淋巴瘤Raji细胞生长和DAPK表达变化的影响。方法用丁酸钠作用于Raji细胞株,观察形态、增殖情况、细胞周期分布变化、死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化的变化及该酶表达的变化。结果成团悬浮生长的Raji细胞呈现贴壁生长,细胞增殖速度明显被抑制,细胞阻滞在G0/G1期;DAPK启动子去甲基化,DAPK表达量增加,细胞凋亡增加。结论丁酸钠具有诱导Raji细胞DAPK基因启动子去甲基化,使DAPK重新表达,诱导细胞凋亡的作用。

云南产钝顶螺旋藻多糖对D-半乳糖所致衰老小鼠的作用

雌性NIH小鼠每天颈背sc D-半乳糖80mg/kg,连续42d,造成亚急性衰老模型。在注射D-半乳糖的同时每天分别ig钝顶螺旋藻多糖(PSP)200mg/kg、100mg/kg,能显著降低小鼠心、肝脑组织MDA含量,明显促进红细胞、肝及脑SOD活性,使全血及肝GSH-Px活性与GSH含量恢复至正常水平,同时使肝、脑MAO-B活性显著降低,皮肤羟脯氨酸含量显著回升。提示PSP对D-半乳糖所致衰老小鼠有明显的改善作用。

重组人蛋白激酶CK 2α亚基的原核表达、纯化与鉴定

将构建成功的人蛋白激酶 CK2 α亚基 c DNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌 BL2 1 ( DE3) ,IPTG诱导后获特异高效表达 ,表达蛋白占菌体总蛋白的 30 % ,但大多数重组蛋白以不溶形式存在 .表达产物依次进行 DE- 5 2、P1 1磷酸纤维素和肝素 - Sepharose柱层析分离 ,最后从 30 9mg可溶性蛋白质中得到 6.1 mg纯化蛋白 . SDS- PAGE显示纯化的蛋白质为一分子量 4 2 k D的单一蛋白带 .Western- blot的结果证明 :纯化的表达产物与抗人 CK2α抗体可发生特异性免疫反应 . CK2α和β亚基等摩尔分子混合可组成有完全活性的全酶 .重组的 CK2全酶的性质和功能与该酶的已知特性一致 .这些结果证明重组蛋白是人蛋白激酶 CK2

老年大鼠空间记忆减退与cNOS基因表达变化

目的：从基因表达角度研究原生型NOS（cNOS，包括神经元型nNOS和内应型eNOS）与老年记忆减退发生的关系。方法：用Morris水迷宫将老年大鼠筛选为记忆正常和记忆减退两组，以老年记忆减退大鼠作为老年记忆减退模型；用半定量反转录一聚合酶链反应（RT－PCR）方法测定nNOS和eNOS的mRNA含量。结果：（1）海马组织中老年记忆正常组和老年记忆减退组较青年组nNOS和eNOSmRNA含量均下降，nNOS以记忆减退组下降更为显著；（2）小脑组织中老年记忆减退组nNOS和eNOSmRNA含量的下降与老年记忆正常组和青年组均有显著差异。（3）额叶组织nNOSmRNA含量三组之间均无显著差异；eNOSmRNA含量老年记忆正常组和老年记忆减退组技青年组均下降，以记忆减退组下降更为显著。结论：老年记忆减退的发生可能与有关脑区cNOS基因表达下降有关。

反义bcl-2 DNA促进裸鼠荷人鼻咽癌细胞株CNE_2-baxα凋亡

目的：在裸鼠活体水平上观察ｂｃｌ － ２ 反义寡聚核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ， ＡＳＯＮ） 对鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２ － ｂａｘα凋亡的影响。方法：ＤＮＡ 合成仪合成２２ｎｔ ＡＳＯＮ 片段，ＲＴ－ ＰＣＲ 检测ｂｃｌ － ２ 表达，电镜观察细胞凋亡。结果：反义ｂｃｌ － ２ ＤＮＡ 片段局部注射ＣＮＥ２ － ｂａｘα致瘤组织，ＲＴ－ ＰＣＲ 检测肿瘤组织中ｂｃｌ － ２ 表达被封闭，电镜观察视野下可见大量癌细胞凋亡，癌细胞数目减少，细胞间组织大量纤维化；凋亡的癌细胞电子密度增加，具典型凋亡特征。反义ｂｃｌ － ２ 封闭１ 周，抑瘤率７４－４ ％ ，第２ 周为４６－０ ％ 。结论：反义ｂｃｌ－ ２ 抑制鼻咽癌细胞株ＣＮＥ２ － ｂａｘα致瘤性。

大鼠脑、肝和前列腺一氧化氮合酶mRNA表达

根据大鼠脑型一氧化氮合酶（ｂＮＯＳ）和内皮型一氧化氮合酶（ｅＮＯＳ）的ｃＤＮＡ序列分别设计特异引物，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法检测２种ＮＯＳ在脑、肝脏和前列腺中的ｍＲＮＡ表达差异。结果表明：ｂＮＯＳ在小脑、大脑皮质和海马中有表达，并且在肝脏和前列腺组织中也有表达：ｅＮＯＳ在肝组织中有表达，在小脑、大脑皮质和海马等脑组织中均有表达，但前列腺组织中未检测到ｍＲＮＡ表达。２种ＮＯＳ在上述组织中的广泛分布提示ＮＯ具有多种复杂的、有时甚至是相反的生理功能可能与ｂＮＯＳ和ｅＮＯＳ甚至诱导型一氧化氮合酶（ｉＮＯＳ）分别或共同作用有关。

EBV－DNA酶全基因扩增克隆和鉴定

根据Ｂｅａｒ的ＥＢ病毒（ＥＢＶ）基因全序列，设计包括ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶全基因的一对引物，在引物上设计有一个ＳａｌⅠ切点，以便于克隆。选用蛋白酶Ｋ裂解的Ｒａｊｉ细胞ＤＮＡ为模板，扩增出一条１４６０ｂｐ的特异条带，纯比后经ＴａｑⅠ酶切形成１１９８ｂｐ和２６２ｂｐ的两个片段，证实该扩增片段即为ＥＢＶ特异性ＤＮＡ酶的全基因片段。以ＪＭ１０３为宿主菌，以高效表达质粒ＰＢＶ２２１为载体，按常规方法作酶切、连接、转化，最后在含氨中青霉素的培养基上挑取单菌落扩大培养，用快速法少量制备质粒ＤＮＡ。根据质粒电泳结果粗筛，再行ＢａｍＨⅠ酶切初步鉴定，确定质粒大小为５１１７（１４５１＋３６６６）ｂｐ的菌落为阳性克隆。先后用ＢａｍＨⅠ和ＴａｑⅠ消化阳性重组体，以形成１２００ｂｐ和３９１７ｂｐ两片段的确定为正向连接重组体。

AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的抑制作用

目的 观察Tyrphostin中的AG1112对重组人蛋白激酶CK2全酶的直接作用及其酶动力学机制。方法 利用基因工程克隆、表达和纯化获得重组人蛋白激酶CK2α和 β亚基 ,在体外等摩尔数混合构成有最大生物活性的重组CK2全酶 ,在不同条件下测定CK2的活性。CK2活性通过测定转移到CK2底物上的 [γ 3 2 P]ATP或 [γ 3 2 P]GTP的 [3 2 P]放射活度来检测。结果 重组人CK2是一种Ca2 + 、cAMP和cGMP等第二信使非依赖性蛋白激酶 ,与天然CK2的性质一致。AG1112对重组人CK2全酶具有很强的抑制作用 ,IC50 为 6 0 μmol·L-1,抑制作用大于CK2已知抑制剂DRB和A3。AG1112对重组人CK2的动力学研究表明 :它与GTP和酪蛋白分别呈混合性和非竞争性抑制作用。结论 由于AG1112对重组人CK2显示出很强的抑制作用 。

EGFr在原发性及交链孢酚诱导的食管癌中的扩增

用ＡＯＨ体外诱导不同时间（２４小时，１周和 ３周）的人胎儿食管上皮组织，提取该组织高分子量的ＤＮＡ．从１０例食管癌组织及癌旁“正常”组织中分别提取 ＤＮＡ，用 ＥｃｏＲＩ酶切，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ转移，与ＥＧＦｒ基因探针杂交。结果显示：ＡＯＨ诱导２４小时人胎儿食管上皮中即有ＥＧＦｒ基因扩增，并一直持续到第三周。２例食管癌组织，１例癌旁“正常”组织也有ＥＧＦｒ基因扩增。因此：ＡＯＨ可以激活ＥＧＦｒ。ＥＧＦｒ基因的激活可能是食管上皮癌变的启动性变化，并在食管癌发生发展中起重要作用；提示肿瘤实际病变区域应超越目前病理学诊断的范围。