以色列急性麻痹病毒(IAPV)的特性及入侵受体的研究进展

以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus,IAPV)是一种严重危害蜜蜂健康的病毒,其感染特性主要表现为较强的传染性和致病性。IAPV能感染多种宿主,不仅能感染蜜蜂,还能感染熊蜂、无刺蜂、胡蜂和蚂蚁等昆虫以及狄斯瓦螨Varroa destructor。受体是决定其宿主范围和嗜性组织的重要因素,病毒入侵过程中关键的一步就是与受体蛋白结合,但迄今为止,国内外针对蜜蜂病毒的受体研究较为匮乏,尚无该病毒受体报道。NPC(NPC intracellular cholesterol transporter),一种细胞内转运胆固醇的蛋白,是多种昆虫病毒的胞内受体,在病毒感染中扮演着关键的角色。之前研究表明,该蛋白可能与蜜蜂病毒的感染过程有关。本文综述了IAPV的特性和可能的入侵受体,包括病毒分子结构特征、流行与传播、宿主范围以及感染机制,以期深入认识IAPV的发病机制。

小鼠仙台病毒HN蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备小鼠仙台病毒(Sendai virus,SeV)HN蛋白单克隆抗体,试验采用SeV参考毒株HN基因(GenBank登录号为NC_001552.1)对编码HN蛋白的基因密码子优化后克隆重组至原核表达载体pGEX-6P-1上获得重组质粒pGEX-6P-1-HN,将其转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中,用IPTG进行诱导表达,并对纯化的重组蛋白rHN进行SDS-PAGE分析。用重组蛋白rHN免疫Balb/c小鼠6次,取其脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,通过亚克隆技术和间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,然后注入小鼠腹腔制备抗HN蛋白单克隆抗体,分析单克隆抗体的免疫活性、特异性和稳定性。结果表明:获得3株分泌抗SeV HN蛋白抗体的杂交瘤细胞2F9、5D8、10H2,分泌的抗体效价均为1∶16 000左右。3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,均可特异性识别SeV,并不与其他小鼠病毒产生交叉反应,具有良好的特异性。经过10次传代,3株单克隆抗体的效价均在1∶8 000以上,稳定性较好。说明试验成功制备了具备良好免疫活性、特异性和稳定性的抗SeV HN蛋白单克隆抗体,可以为SeV的检测提供有效试剂。

杆状病毒表达系统中NLS序列对鸭圆环病毒Cap基因表达的影响及其免疫原性研究

为了研究核定位信号肽(Nuclear localization signal,NLS)序列对鸭圆环病毒(duck Circovirus,DuCV)Cap蛋白表达的影响,并探究不同免疫策略下重组蛋白的免疫原性,试验将去除和未去除NLS序列的DuCV Cap基因分别克隆至杆状病毒载体pFastBacⅠ中,通过杆状病毒表达系统进行表达,分析NLS序列对Cap蛋白表达的影响。采用不同的免疫策略,分别以原核表达系统构建的重组蛋白rCap(rCap组)、杆状病毒表达系统构建的rvAc-Cap(rvAc-Cap组)及rCap与rvAc-Cap联合(Prime-Boost组)作为免疫源免疫Balb/c小鼠,并设置PBS对照组,定期采血,检测DuCV IgG抗体水平、淋巴细胞增殖指数(SI)和γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)等细胞因子水平,评价其免疫效果。结果表明:利用杆状病毒表达系统成功表达出重组杆状病毒rvAc-Cap和rvAc-NLS-Cap,且去除NLS序列的Cap基因表达水平更高;小鼠免疫重组蛋白rCap后,重组蛋白rCap与重组杆状病毒rvAc-Cap均能够刺激小鼠产生特异性IgG抗体,三免后Prime-Boost组的IgG抗体水平最高,而与其他免疫组差异不显著(P>0.05);三免后各免疫组淋巴细胞增殖指数显著高于PBS对照组,差异显著(P<0.05);各免疫组IFN-γ、IL-2和IL-4水平与PBS对照组比较差异显著(P<0.05),且Prime-Boost组水平最高。说明在杆状病毒表达系统中去除NLS序列可以提高Cap基因的表达;重组杆状病毒rvAc-Cap能够活化小鼠的免疫系统,刺激小鼠机体产生体液免疫与细胞免疫,而Prime-Boost免疫策略有效提高了免疫效果。

检测禽流感病毒RT-PCR一步法的建立及H5、H9亚型的鉴定

目的建立禽流感病毒(AIV)通用型RT-PCR一步法,并鉴定AIV H5和H9亚型。方法根据流感病毒高度保守的M1基因序列,设计一套通用型引物,建立AIVRT-PCR一步法。根据H5、H9亚型HA基因序列,分别设计一套特异性引物,其上、下游引物分别位于裂解位点两侧,应用RT-PCR一步法检测AIV H5和H9亚型,并验证所建立方法的敏感性;通过检测NDV、IBV和IBDV等RNA病毒及计算机软件模拟检测,验证其特异性。结果所建立AIV系列RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便和快速的特点。结论该方法可用于AIV的检测,H5、H9亚型的鉴定及致病性分析。

口蹄疫病毒复合多表位DNA疫苗的设计及构建

目的构建口蹄疫病毒(FMDV)复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT及其DNA疫苗。方法以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和Asia1型FMDV两个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因作为主要免疫原基因,非结构蛋白3ABC上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白VP4上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因,构建表达盒。将构建好的表达盒OAAT克隆到真核表达载体pVAX1 PCMV启动子下游,构建三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT,并用Western blot和IFA方法检测目的蛋白在HeLa细胞中的表达。结果通过InsightⅡ软件同源建模和DNAStar5.0软件分析表明,所构建的FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT理论上符合设计要求,且在真核细胞获得了正确表达。结论已成功设计FMDV复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT,并构建了三价口蹄疫核酸疫苗pVAX1-OAAT。

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗分子设计及其构建

针对我国口蹄疫（FMD）流行情况,利用计算机软件模拟分析,构建了口蹄疫病毒（FMDV）复合多表位基因工程疫苗表达盒OAAT。该表达盒以O型、A型FMDV结构蛋白VP1全基因和AsiaⅠ型FMDV2个基因拓扑型的结构蛋白VP1基因上的5个抗原表位基因（其中2个抗原表位来源于FMDVIND63/7株,该毒株与我国新疆分离株属于同一基因拓扑型,其余3个抗原表位来源于FMDVYNBS/58株）作为主要免疫原基因,以非结构蛋白上的2个Th2细胞表位基因及结构蛋白上的1个Th2细胞表位基因作为辅助基因。将构建好的表达盒OAAT和猪IL-18基因分别插入到鸡痘病毒（FPV）表达载体pUTA-16-LacZ复合启动子（ATI-P7.5×20）和单一启动子（P7.5）下游,构建了携带OAAT表达盒和猪IL-18基因的重组鸡痘病毒转移载体质粒pUTAL-OAAT-IL18。应用脂质体转染法,将重组鸡痘病毒转移载体质粒与282E4株FPV共转染鸡胚成纤维细胞（CEF）,经BrdU进行3次加压蚀斑筛选后,以不同代次的细胞mRNA为模板,利用FMDVVP1基因和猪IL-18基因特异引物进行RT-PCR和IFA检测,筛选出OAAT和猪IL-18基因共表达的重组鸡痘病毒rF-PV-OAAT-IL18,该重组鸡痘病毒的构建为新型FMDV活载体疫苗的研究奠定了基础。

中蜂囊状幼虫病毒结构蛋白预测与鉴定

采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法、生物信息学软件和质谱分析对中蜂囊状幼虫病毒(CSBV)辽宁株(CSBV-LN)全基因组进行了分子克隆、序列测定、分子生物学特性分析及结构蛋白预测和鉴定.结果表明,CSBV-LN全基因组序列长度为8863个核苷酸,编码一个大的开放阅读框,其中包括178 nt的5'非编码区的前导序列和79 nt的3'非编码区,后面跟着一个poly(A)的尾巴.通过软件分析表明,CSBV-LN蛋白序列类似于哺乳动物的小RNA病毒蛋白序列,预计存在VP1,VP2,VP3和VP4等4个小的结构蛋白;系统进化分析表明,CSBV、囊状幼虫病毒(SBV)和残翅病毒(DWV)的起源相同,推测CSBV有着类似DWV的结构蛋白序列5'-VP2-VP4VP1VP3-3.基于此,根据PAGE蛋白条带的大小,利用NetPicoRNA软件预测结构蛋白的裂解位点.在此基础上,对纯化后的CSBV进行SDS-PAGE分离,对分离到的4个蛋白进行质谱分析,结果鉴定出VP1,VP3和VP0 3个蛋白.

H5和H9亚型禽流感病毒联合RT-PCR检测方法的建立

目的建立H5和H9亚型禽流感病毒(AIV)联合RT-PCR检测方法。方法针对H5和H9亚型AIV血凝素(HA)基因,在其裂解位点两侧设计引物。在确定单项RT-PCR检测方法反应条件基础上,建立、优化联合RT-PCR反应体系和反应条件,并通过相关病毒检测试验,验证其敏感性和特异性。结果所建立的H5和H9亚型联合RT-PCR检测方法具有特异、敏感、简便、快捷等特点。结论该方法可用于AIV的检测及致病性分析。

口蹄疫病毒O/LZ株的分子特性分析

采用RT-PCR方法对口蹄疫病毒O/LZ株基因组序列进行了分子克隆和序列测定。结果表明:获得的O/LZ株除poly(C)和poly(A)外基因组序列长8 104nt,其中包括1 042nt的5′非编码区和6 969nt的多聚蛋白编码区。将O/LZ株与其它参考毒株进行序列比较,结果显示O/LZ株与O/HNK/2002、O/ES/2001、O/CHP/TW/97等遗传关系最近,而与其它毒株遗传关系较远,属于O型口蹄疫Cathay拓扑型。与ME-SA拓扑型PanAsia株的毒株比较,两者在主要抗原位点1和位点3呈现出明显的以拓扑型为特征的氨基酸差别,提示两拓扑型毒株之间有较高的抗原差异。

产学研结合背景下兽医专业研究生培养的模式研究

国家中长期教育改革和发展的目标是培养拔尖创新人才,创立高校与科研院所及企业联合人才培养的新机制,特别是推行产学研联合研究生培养模式,加强高校重点科研创新基地与科技创新平台建设,从而促进高校、科研院所以及企业的科技教育资源共享。在这样的时代背景下,高级兽医专业人才不仅要具备基本知识和临床技能,还要具备工作协调组织能力和创新能力。产学研结合模式可以实现校企双方的优势互补,对高校、用人单位和学生均有益处。

O型口蹄疫病毒O／LZ株拯救

以构建的口蹄疫病毒O/LZ株全长cDNA为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,得到病毒RNA。用脂质体转染法将转录物RNA导入BHK细胞,可观察到典型的口蹄疫病毒致细胞病变效应。对收获的病毒分别用RT-PCR、免疫荧光以及免疫电子显微镜观察等方法进行鉴定,结果表明拯救到特定的口蹄疫病毒。同时用空斑试验法观察了拯救病毒及其母本毒株的生长特性,结果表明二者没有明显差异,这将为进一步探索猪口蹄疫病毒致病的分子机制及研制新型口蹄疫疫苗奠定良好的基础。

O型口蹄疫病毒O/LZ株基因组全长cDNA的构建

目的构建O型口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)O/LZ株基因组全长cDNA。方法根据FMDV基因组和克隆载体的限制性内切酶酶切位点,将FMDV基因组设计为4段,进行反转录和扩增(RT-PCR),得到的片段分别克隆到质粒pMD18T-vetcor,筛选阳性重组质粒,测序正确的重组质粒(pMD18-S、pMD18-I、pMD18-P1和pMD18-P2)保存备用。然后对S区、I区和P2片段重新设计引物,其中S区的上游引物引入T7启动子序列;I区上游引物引入6个C,下游引物带有FMDV基因组中唯一酶切位点NruⅠ;用于3′端扩增的下游引物引入16个T,并以pMD18-S和pMD18-I为模板,对S区和I区进行融合PCR获得IS,以pMD18-P2为模板对P2片段进行2次PCR,获的带16个T的P3片段。将扩增片段克隆到pMD18T-vetcor,在pBuescriptⅡSK(-)中进行长片段的连接,获得基因组全长cDNA克隆。结果获得O型FMDV O/LZ株全基因组,并在此基础上构建了O/LZ株FMDV全长cDNA。结论成功构建了O型FMDV O/LZ基因组全长cDNA克隆,为进一步获得具有感染性的FMDV分子克隆,并研究该病毒基因组结构和功能奠定了基础。

布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立

目的建立布鲁菌属半套式PCR检测方法。方法根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物,扩增目的片段长223 bP,通过条件优化,建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法。利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y.Center O:9,S.TyPh i,E.Coli O:157进行检测验证其特异性,通过对活菌计数检测验证其敏感性。结果检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段,而Y.Center O:9,S.TyPh i和E.Coli O:157不能扩出目的片段。通过对活菌计数最低可检测到20个细菌。结论本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法,为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础。

禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

参照国内外已发表的禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)的基因序列和AIV相关的RT-PCR检测方法,根据AIV高保守、高特异的M蛋白基因设计了一套通用型引物,通过对相关病毒、棉拭子检测,建立了AIV通用型RT-PCR检测方法.根据AIV HA基因设计了H5、H7、H9亚型的联合RT-PCR引物,其上下游引物分别位于裂解位点两侧,在确定各亚型单项RT-PCR检测方法的反应条件和反应体系的基础上,建立、优化了三联RT-PCR检测方法的反应体系和反应条件,并通过相关病毒、质粒、棉拭子检测,建立了AIV三联RT-PCR检测方法.最终建立了AIV系列RT-PCR检测方法,该方法具有快速、敏感、特异等优点,为AIV检测、流行病学调查、致病性分析及疫苗使用等奠定了基础.

口蹄疫三价重组鸡痘病毒疫苗免疫原性研究

目的对本室已经筛选到的共表达O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位免疫原基因OAAT与猪IL-18基因的重组鸡痘病毒vUTA-IL18-OAAT的免疫原性进行研究。方法分别用重组病毒毒vUTA-IL18-OAAT、FPV疫苗株和PBS溶液进行小鼠免免疫,每间隔14d加强免疫1次,第3次免疫后10d杀鼠取血清和脾淋巴细胞检测抗体、T淋巴细胞亚群的数量及CTL活性。结果小鼠免疫试验结果表明,与阴性对照组相比,vUTA-IL18-OAAT免疫组的T细胞亚类数量、CTL杀伤活性,抗O型、A型和Asia1型FMDV的特异性抗体水平差异显著。结论vUTA-IL18-OAAT能有效激发机体的细胞和体液免疫反应。

禽流感的公共卫生意义

流感是由A型流感病毒引起的急性高度接触性传染病,特别是鸡对禽流感有较高的易感性。A型禽流感病毒历来被认为是人类流感的最大基因库,是人流感病毒发生变异的新基因来源。国际兽医局已将其列为A类烈性传染病之一,并被列入国际生物武器公约动物类传染病名单。为此,通过对禽流感在世界流行情况,人流感大流行及与禽流感病毒的关系,A型流感病毒的存在、传播及其演化等内容的介绍,阐明禽流感公共卫生意义,增强对A型禽流感的认识。

口蹄疫病毒致病分子机制

在病毒感染引起机体发病的过程中,既有病毒与细胞间的相互作用,又有病毒侵入细胞后的一系列反应,包括病毒与细胞间吸附、病毒粒子释放、病毒核酸在细胞内复制等过程.从理论上讲,口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)的任何一种结构蛋白和非结构蛋白、病毒BNA元件、参与病毒复制过程的宿主细胞蛋白和内膜(包括FMDV细胞受体)都可以被认为是毒力因子.这些因子缺陷或者缺乏,将可能引起病毒致病力的变化.……

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白实验性核酸疫苗的构建及其免疫原性的初步研究

扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株ORF5基因,并将其克隆至真核表达载体pVAX1、pVIR-IL-18的CMV启动子下游,构建成真核表达质粒。通过Western blot以及IFA检测方法确认,所构建的2个重组DNA疫苗质粒在真核细胞能进行有效的转录,并表达了目的蛋白(GP5)。同时辅以不同佐剂进行了BALB/c小鼠免疫试验,检测了免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量。结果表明:共表达猪IL-18基因的核酸疫苗pVIR-IL-18-ORF5免疫后的ELISA抗体水平和脾T淋巴细胞亚群数量均优于pVAX1-ORF5,而且加佐剂实验组优于未加佐剂的实验组。