补阳还五汤减轻氧化应激保护脑缺血再灌注损伤大鼠血脑屏障的作用研究

目的探究补阳还五汤(Buyang Huanwu Decoction,BYHWD)降低氧化应激水平保护脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia/reperfusion injury,CIRI)大鼠血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的机制。方法采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型,应用PeriCam PSI激光散斑血流成像系统检测脑血流量判定模型建立是否成功。通过Zea Longa评分评价大鼠神经功能缺损情况;HE染色观察大鼠脑组织病理学改变;干湿重法检测脑水肿程度;伊文思蓝(Evans blue,EB)染色检测BBB通透性;透射电镜观察BBB超微结构改变;试剂盒检测氧化应激相关指标活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的含量及总超氧化物歧化酶(SOD)活性;免疫组织化学染色及Western blot检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达水平;免疫荧光双染及Western blot检测紧密连接蛋白(tight junction protein,TJP)中Occludin、ZO-1、Claudin-5蛋白的表达水平。结果BYHWD能够降低MCAO/R大鼠神经功能缺损评分,减轻脑组织病理学损伤,减轻血脑屏障结构破坏,延长紧密连接结构致密区,减轻缺血侧大脑脑水肿情况,降低BBB通透性。BYHWD可以降低ROS与MDA水平,提高SOD活性,降低MMP-9表达水平,提高Occludin、Claudin-5、ZO-1蛋白表达水平。结论BYHWD可以升高BBB紧密连接蛋白的表达水平,降低血脑屏障通透性,保护血脑屏障超微结构,减轻脑水肿,其机制可能与BYHWD抗氧化应激,抑制MMP-9的激活相关。

补阳还五汤对脑缺血再灌注大鼠线粒体氧化损伤和PKCε-Nampt通路的影响

目的探讨补阳还五汤对脑缺血再灌注(I/R)大鼠线粒体氧化损伤及PKCε-Nampt通路的影响。方法大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组(14.3 g/kg)和依达拉奉组(3 mg/kg),除假手术组外均采用MCAO法建立脑I/R损伤模型,术后24 h各组给予相应剂量药物,给药7 d后通过神经功能评分评估神经功能缺损情况,免疫荧光检测神经元标志物MAP-2表达,观察神经元损伤情况,检测ROS、MDA水平和SOD活性评价氧化损伤情况,荧光探针JC-1检测线粒体膜电位变化,修饰酶循环法检测NAD^(+)/NADH比值,Western blot法检测PKCε、p-PKCε、Nampt蛋白表达,免疫组化法检测p-PKCε、Nampt蛋白阳性表达。结果与模型组比较,补阳还五汤组脑梗死体积、神经功能评分降低(P<0.05),脑组织MAP-2荧光强度增强(P<0.05),神经元损伤减轻,脑组织ROS、MDA水平降低(P<0.05),SOD活性、线粒体膜电位、NAD^(+)/NADH比值升高(P<0.05),p-PKCε、Nampt蛋白表达升高(P<0.05)。结论补阳还五汤可通过激活PKCε-Nampt信号通路、提高线粒体功能来减轻大鼠脑I/R损伤。

补阳还五汤增强GPX4表达抑制铁死亡减轻脑缺血再灌注损伤

目的探讨补阳还五汤减轻脑缺血再灌注损伤是否通过增强GPX4的表达抑制铁死亡的机制。方法选取健康雄性SD大鼠48只,随机分为4组:假手术组(Sham组)、模型组(MCAO/R组)、补阳还五汤组(BYHWD组)、阳性对照药组(DFO组)。所有实验动物均建MCAO/R模型(假手术组仅剥离)。BYHWD组给予补阳还五汤灌胃处理,DFO组给予DFO腹腔注射处理,其余组予以生理盐水灌胃处理。再灌注72 h进行指标评定及取材。神经功能评分检测神经功能;TTC染色测定脑梗死面积;尼氏染色观察脑组织形态结构;生化试剂检测血清GSH、丙二醛(MDA)、脑组织铁含量;免疫荧光和Western blot检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的蛋白表达。结果与假手术组相比,模型组大鼠神经功能损伤明显,脑梗死体积增多,脑组织病理学损伤明显,尼氏体数量减少,脑组织铁含量、血清MDA含量明显增加,血清GSH含量、脑组织GPX4的蛋白表达显著降低(P<0.05);与模型组相比,补阳还五汤组大鼠神经功能明显好转,脑梗死体积降低,脑组织病理学损伤减轻,脑组织铁含量、血清MDA含量降低,血清GSH含量,脑组织GPX4的蛋白表达显著增加(P<0.05)。结论补阳还五汤抑制脑缺血再灌注损伤可能通过增强GPX4的表达抑制铁死亡而发挥作用。

补阳还五汤及主要成分对大脑中动脉阻塞再灌注大鼠脑组织细胞焦亡的影响

背景:细胞焦亡是脑缺血再灌注损伤的重要病理机制,补阳还五汤是中医临床治疗缺血性脑卒中的经典方剂,细胞焦亡可能是补阳还五汤治疗脑缺血再灌注损伤的有效作用靶点。目的:观察补阳还五汤对大脑中动脉阻塞再灌注大鼠脑组织细胞焦亡的影响及作用机制。方法:将48只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、黄芪组及补阳还五汤组。除假手术组外,其余各组均进行大脑中动脉阻塞缺血2 h再灌注72 h处理,黄芪组和补阳还五汤组大鼠均于缺血2 h再灌注后开始连续灌胃相应体积的药物至缺血再灌注72 h,早晚各1次。Zea Longa评分观察大鼠神经功能缺损情况,TTC染色观察大鼠脑梗死体积,苏木精-伊红染色观察大鼠脑组织病理损伤变化,免疫荧光观察脑组织Tunel和Cleaved Caspase-1共表达以及接头蛋白ASC表达情况,免疫组化及Western blot检测大鼠脑组织焦亡相关蛋白表达。结果与结论:①与假手术组相比,模型组大鼠神经功能缺损评分显著升高(P<0.01),与模型组相比,补阳还五汤组及黄芪组大鼠神经功能缺损评分显著下降(P<0.01);②与模型组相比,黄芪组和补阳还五汤组脑梗死体积占比下降(P<0.01);③模型组脑组织神经细胞胞核固缩深染或溶解消失,细胞排列紊乱,与模型组比较,补阳还五汤组及黄芪组脑组织病理损伤较轻;④与假手术组相比,模型组大鼠脑组织Tunel与Cleaved Caspase-1双染色阳性细胞数及ASC免疫荧光表达强度显著增加,Cleaved Caspase-1、NLRP3、白细胞介素18和白细胞介素1β焦亡蛋白表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,补阳还五汤组及黄芪组Cleaved Caspase-1与Tunel双染色阳性细胞数、ASC免疫荧光表达强度及Cleaved Caspase-1、NLRP3、白细胞介素18、白细胞介素1β焦亡蛋白表达均明显下降(P<0.01)。结果表明,补阳还五汤及其君药黄芪可有效缓解大脑中动脉阻塞再灌注大鼠脑组织损伤,其机制可能与抑制神经细胞焦亡有关。

CCK-8抑制LPS作用下大鼠肺间质巨噬细胞NF-κB活性的cAMP-PKA通路研究

目的:用cAMP激动剂forskolin和PKA抑制剂H-89,探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)抑制LPS作用下大鼠肺间质巨噬细胞(PIM s)核因子-κB(NF-κB)活性的cAMP-PKA信号通路机制。方法:分离纯化大鼠PIM s。用电泳迁移率改变分析(EMSA)法检测大鼠PIM s中NF-κB活性,用W estern b lotting分析IκB-α蛋白水平。结果:正常对照组大鼠PIM s核内未检测到与特异性寡核苷酸探针相结合的NF-κB,LPS组细胞内NF-κB活性明显高于正常对照组(P<0.01),胞浆中IκB-α水平显著低于正常对照组(P<0.01)。CCK组和Fsk组细胞内NF-κB活性和胞浆中IκB-α含量均无明显差异(P>0.05)。CCK+LPS组和Fsk+LPS组,细胞内NF-κB活性均低于LPS组(P<0.05),IκB-α含量均高于LPS组(P<0.01)。LPS+CCK+H-89组NF-κB活性高于CCK+LPS组(P<0.01),而IκB-α蛋白水平低于CCK+LPS组(P<0.01)。结论:cAMP-PKA信号通路的活化可抑制LPS诱导的大鼠PIM s细胞内NF-κB活性升高和IκB-α蛋白水平的降低,CCK-8的抗炎作用是通过激活cAMP-PKA信号通路进而抑制NF-κB活性来实现的。

CCK-8对大鼠肺间质巨噬细胞cAMP-PKA信号通路的激活作用

目的探讨八肽胆囊收缩素(CCK-8)对大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)cAMP-PKA信号通路的激活作用。方法分离纯化大鼠PIMs,采用放射免疫分析法测定细胞内cAMP含量,放射激酶法测定PKA活性,受体拮抗剂的IC50值由对数-几率单位法求得。结果正常对照组大鼠静息状态下PIMscAMP含量和PKA活性分别为(2.04±0.13)nmol·g-1和(118.3±11.2)nmol·min-1·g-1。低浓度CCK-8[(10-12～10-10)mol·L-1]对细胞内cAMP含量和PKA活性没有影响(与正常对照组比较:P>0.05);高浓度CCK-8[(10-9～10-5)mol.L-1]可明显提高细胞内cAMP含量和PKA活性(与正常对照组比较:P<0.05)。10mg·L-1脂多糖(LPS)刺激大鼠PIMs,可明提高细胞内cAMP含量和PKA活性,分别为(5.15±0.12)nmol·g-1和(188.6±13.5)nmol·min-1·g-1。不同浓度的CCK-8与LPS共同孵育PIMs,细胞内cAMP含量和PKA活性的变化趋势与CCK-8作用于静息状态下大鼠PIMs的变化趋势完全相同。CCK受体拮抗剂丙谷胺、CR-1409、CR-2945可呈剂量依赖性地抑制CCK导致的cAMP含量的升高,它们的IC50值分别为(0.5×10-6、4.1×10-6、7.2×10-4)mol·L-1。丙谷胺、CR-1409、CR-2945也可明显减弱CCK-8所导致的PKA活性的升高;其中,丙谷胺的抑制作用最强,CR-1409次之,CR-2945的抑制作用最小。结论CCK-8可剂量依赖性地激活静息状态和LPS诱导的大鼠PIMscAMP-PKA信号转导途径,这可能是CCK抗炎作用的分子机制之一。CCK激活cAMP-PKA通路是通过CCK受体来实现的,且CCK-AR的作用比CCK-BR的作用更为明显。

高脂血症小鼠脑缺血再灌注诱导智能障碍模型研究

目的探讨高脂血症小鼠脑缺血再灌注与智能障碍的关系。方法在造成小鼠高脂血症的基础上，进行脑缺血再灌注，并用水迷宫法、跳台法、避暗法进行学习记忆功能检测。结果显示模型组小鼠出现明显的学习记忆障碍，与单纯脑缺血再灌组相比有统计学意义。

CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响

目的探讨CCK-8抗炎作用中DAG-PKC信号通路对cAMP-PKA信号通路的影响。方法分离纯化大鼠PIMs,分别用LPS、CCK、LPS+CCK、PMA、SC-3088、LPS+PMA、LPS+SC-3088、CCK+PMA、CCK+SC-3088、LPS+CCK+PMA、LPS+CCK+SC-3088孵育一定时间,采用125I-cAMP放射免疫分析法测定细胞内cAMP含量,用放射激酶法测定PKA活性。结果单独应用PMA和SC-3088孵育大鼠PIMs,细胞内cAMP含量和PKA活性与正常对照组相比无明显变化(P>0.05)。PMA可升高LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性(P<0.01),SC-3088则可使LPS作用下的细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。分别应用PMA、SC-3088与CCK共同孵育,则CCK+PMA组细胞内cAMP含量和PKA活性高于单独应用CCK组(P<0.01),CCK+SC-3088组则降低(P<0.01)。与LPS+CCK组相比,PMA+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性升高(P<0.01),而SC-3088+LPS+CCK组细胞内cAMP含量和PKA活性降低(P<0.01)。结论在LPS诱导的大鼠PIMs,CCK-8可通过激活cAMP-PKA信号通路发挥抗炎作用;DAG-PKC信号通路的活化对cAMP-PKA信号通路有正性调节作用。

大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区Caspase-3的表达及细胞凋亡的动态变化

目的观察大鼠脑缺血再灌注后海马CA1区神经元Caspase-3的表达及细胞凋亡指数的动态变化。方法将大鼠随机分为假手术组、模型组。模型组又分为脑缺血再灌注后0,0.5,2,6,24,72,120 h 7个亚组。采用4-VO阻断法制备大鼠脑缺血再灌注模型,用免疫组织化学染色法及原位细胞凋亡检测法(TUNEL染色)分别观察大脑海马CA1区神经元Caspase-3的表达及细胞凋亡指数。结果假手术组海马CA1区神经元Caspase-3蛋白有少量表达。和假手术组相比,模型组大鼠在脑缺血再灌注后0 h、0.5 h海马CA1区神经元Caspase-3表达无明显变化(P>0.05),再灌注后2 h开始升高(P<0.05)、24 h达高峰(P<0.05),之后逐渐下降,再灌注后120 h仍高于假手术组(P<0.05)。细胞凋亡指数的变化趋势与Caspase-3的表达变化相一致。结论脑缺血再灌注可诱导凋亡相关蛋白Caspase-3的表达,进而导致细胞凋亡。细胞凋亡在脑缺血再灌流损伤中呈动态过程,是神经细胞死亡的重要形式。

大鼠肺间质巨噬细胞CCK受体的结合特性

目的:观察大鼠肺间质巨噬细胞(PIMs)胆囊收缩素(CCK)受体的表达亚型和结合特性。方法:用酶消化法结合肺泡耗竭灌洗和肺循环灌洗技术分离纯化大鼠PIMs,超速离心法提取细胞膜,与[~3H]标记的硫酸化CCK-8([~3H]-CCK-8S)进行放射配基结合实验,用非标记的CCK-8S、CCK-A受体(CCK-AR)特异性拮抗剂CR1409及CCK-B受体(CCK-BR)特异性拮抗剂CR2945进行竞争抑制实验,观察配体受体结合的特异性及CCK受体表达亚型,观察孵育时间和温度对特异性结合的影响。结果:正常大鼠PIMs未能检出特异性结合,静脉注射脂多糖(LPS)48h出现特异性结合,且对孵育时间与温度有依赖性。经Scatchard分析,平衡解离常数(Kd)值为:(0.68±0.28)nmol·L^(-1),最大结合容量(Bmax)值为(32.50±2.70)pmol·g^(-1)蛋白。通过竞争抑制实验,[~3H]-CCK-8S与膜的结合可被CCK-8S、CR1409、CR2945所抑制,其IC_(50)值分别为:(3.20±1.13)nmol·L^(-1),(0.19±0.06)μmol·L^(-1)和(2.30±0.80)nmol·L^(-1)。结论:大鼠PIMs存在CCK-A和CCK-B两种受体亚型,为CCK对生理及病理条件下巨噬细胞发挥效应提供了直接的结构依据。

益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马NE、5-HT含量的影响

目的 观察益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马NE、5 HT含量的影响。方法 阻断大鼠双侧颈总动脉进行缺血再灌注 ,于术后d 1、d 7、d 15用高压液相色谱电化学检测法测定海马NE、5 HT的含量。结果 模型大鼠在术后d 1、d 7、d 15海马NE含量分别是 :36 4 2 5± 6 6 4 7,349 76± 5 9 38,(344 5 9± 70 31) μg·g-1,5 HT含量分别是 :6 4 6 72± 83 33,6 2 9 11± 90 6 4 ,(5 96 6 8± 99 4 7) μg·g-1,均较正常组明显降低 (P <0 0 1) ,且随着时间的延长逐渐下降。而中药组大鼠在相同日期海马NE含量分别是 4 17 91± 6 8 2 2 ,4 16 37± 4 8 6 5 ,(42 0 2 9± 5 1 4 5 ) μg·g-1,5 HT含量分别是 :731 31± 5 7 2 6 ,74 6 4 5± 77 77,(770 2 4±5 8 4 1) μg·g-1,均明显高于模型组 (P <0 0 5 )。结论 NE和 5 HT参与了脑缺血再灌注后的神经元损伤 ,益肾降浊汤可升高脑缺血再灌注后的海马NE、5 HT含量 ,保护神经元。

大鼠脑缺血再灌注后海马组织AchE活力的动态观察

目的观察大鼠脑缺血再灌注后海马组织AchE活力的动态变化.方法阻断大鼠双侧颈总动脉进行脑缺血再灌注,于术后第1,7,15 d用比色法测海马组织AchE活力.结果第1,7 d模型大鼠AchE活力分别是(170.95±10.44)mmol·L-1,(168.34±12.02)mmol·L-1,较正常组明显降低(P＜0.01),且7 d组AchE活力低于1 d组,随着缺血再灌注损伤的修复,15 d组AchE活力明显回升.结论 AchE活力降低在缺血再灌注脑损伤中起重要作用.

益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马组织超微结构的影响

目的 :观察益肾降浊汤对大鼠脑缺血再灌注后海马组织超微结构的影响。方法 :对大鼠进行双侧颈总动脉缺血再灌注 ,于术后第 1、7、15d取海马电镜制样、观察。结果 :模型大鼠术后 1d神经细胞内线粒体肿胀、嵴断裂 ,空泡样变 ;7d神经元变性、核碎裂或皱缩 ;15d有胶质细胞增生。治疗组脑组织的损伤性变化明显轻于模型组。结论 :益肾降浊汤可明显减轻脑缺血再灌注后的神经元损伤 ,对神经元有保护作用。

益肾降浊汤对小鼠脑缺血再灌后细胞能荷的影响

目的观察益肾降浊汤对高脂血症小鼠脑缺血再灌后神经细胞能荷的改善作用.方法用高效液相色谱法测定小鼠脑海马区神经细胞能荷值,以琥珀酸为氧化底物,检测线粒体的ATP生成速率.结果第1、7、15、30天模型小鼠神经细胞能荷值分别为0.28±0.02、0.24±0.01、0.23±0.02、0.22±0.02,较正常对照组0.35±0.02显著降低(P<0.01);而模型小鼠神经细胞线粒体内ATP生成速率分别为:(0.95±0.07)、(0.86±0.06)、(0.83±0.08)和(0.81±0.10)μmol*mg-1*min-1,显著低于正常对照组(1.49±0.09)μmol*mg-1*min-1(P<0.01).治疗组在第1、7、15、30天神经细胞能荷值分别为:0.31±0.03、0.32±0.03、0.34±0.02、0.34±0.03,明显高于同日期模型组(P<0.05～0.01);神经细胞线粒体内ATP生成速率分别为:(1.28±0.08)、(1.34±0.10)、(1.37±0.05)和(1.40±0.11)μmol*mg-1*min-1,较同日期模型组明显增加(P<0.05～0.01).结论益肾降浊汤能抑制高脂血症小鼠脑缺血再灌后神经细胞能荷值的下降,提高线粒体内ATP生成速率,改善神经细胞能量代谢的低水平状态,对缺血再灌后的神经元有保护作用.

益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马EAA含量的影响

目的 :观察益肾降浊汤对脑缺血再灌注大鼠海马组织EAA含量的影响。方法 :用氨基酸自动分析仪测定游离氨基酸浓度。结果 :第 1天模型大鼠海马Glu、Asp含量分别是 ( 8.2 6± 2 .13 ) μmol/g、( 2 .10± 0 .93 ) μmol/g ,第 7天含量分别是 ( 7.2 7± 2 .2 0 ) μmol/g、( 1.87± 2 .0 1) μmol/g ,第 15天含量分别是 ( 9.3 6± 2 .2 4) μmol/g、( 1.42± 1.2 1) μmol/g ,均较正常对照组显著降低 (P <0 .0 5～ 0 .0 1)。而中药组大鼠第 1天脑海马Glu、Asp含量分别是 ( 9.90± 3 .2 0 )μmol/g、( 2 .95± 1.73 ) μmol/g ,第 7天含量分别是 ( 10 .49± 2 .3 4)μmol/g、( 3 .0 3± 1.0 9) μmol/g ,第15天含量分别是 ( 11.0 5± 2 .5 4)μmol/g、( 3 .0 5± 1.41) μmol/g ,均高于同期模型组 (P <0 .0 5 )。结论 :益肾降浊汤可提高缺血再灌注后脑组织细胞内的EAA含量 ,调节突出间隙EAA浓度 ,对缺血神经元有保护作用。

Ca^(2+)超载在缺血性神经元损伤中的作用机制

Ｃａ２＋是神经系统中神经兴奋和传导所必需的离子，神经兴奋时Ｃａ２＋作为第二信使和调节剂在神经细胞代射中起着重要作用。研究表明，细胞内Ｃａ２＋浓度的异常增高是脑缺血后神经元损伤的主要机制之一。１正常胞浆中Ｃａ２＋浓度的维持细胞内Ｃａ２＋浓度仅为１０－８...

大鼠脑缺血再灌注损伤对海马组织中学习记忆相关的胆碱乙酰基转移酶活力变化的影响(英文)

背景:海马组织中乙酰胆碱的代谢情况可在一定程度上反映与学习记忆相关的胆碱能系统的功能状况,并影响智能程度。目的:观察大鼠脑缺血再灌注后海马组织胆碱乙酰基转移酶活力的动态变化。设计:以实验动物为观察对象的随机对照实验研究。单位:承德医学院科研处。材料:实验于2002年在承德医学院中心实验室完成。W istar大鼠24只,体质量260～280g,雌雄各半,清洁级。方法:24只大鼠随机分为3组:①模型组。高脂血症大鼠,阻断大鼠双侧颈总动脉进行脑缺血再灌注。②假手术组。高脂血症大鼠仅做双侧颈总动脉分离术,不进行缺血再灌注。③正常对照组。不加任何处理。各组大鼠分别于术后第1,7,15d 断头取脑,用比色法测海马组织胆碱乙酰基转移酶活力。主要观察指标:大鼠脑海马组织胆碱乙酰基转移酶活力的测定。结果:24只大鼠进入结果分析,无脱失。①模型组大鼠第1天、第7天胆碱乙酰基转移酶活力较正常对照组明显降低犤模型组:(0.037±0.006)μm ol/g·s,(0.017±0.006)μm ol/g·s;正常组对照组:(0.054±0.003) μm ol/g·s,(0.058±0.006)μm ol/g·s,P <0.01犦。②模型组大鼠第7天胆碱乙酰基转移酶活力明显低于第1天,随着缺血再灌注损伤的修复,第15天胆碱乙酰基转移酶活力有所回升(0.039±0.007)μnm ol/g·s。③假手术组胆碱乙酰基转移酶活力与正常组无明显差异(P >0.05)。结论:单纯手术不会导致脑组织胆碱乙酰基转移酶的变化,脑缺血再灌注后可使海马胆碱乙酰基转移酶活力降低,使中枢胆碱能系统功能紊乱,可能是导致大鼠智能障碍的原因。

黄芪注射液临床应用研究进展

黄芪，始载于《神农本草经》，是豆科草本植物蒙古黄芪、膜荚黄芪的干燥根，为国内应用广泛的一味中药材，其药用史迄今已有2000多年，黄芪味甘、性微温，归肝、脾、肺、肾经，具有补气固表、利水退肿、托毒排脓、抗疮生肌等功效。随着现代药学工艺的进展，传统中药在剂型上多有发展，黄芪注射液即是其中的一种。