绵羊清道夫受体A基因启动子克隆及序列分析

为了分析绵羊清道夫受体A(scavenger receptor A,SRA)基因的启动子序列特征,试验根据UCSC数据库和NCBI数据库预测的绵羊SRA基因启动子序列设计特异性引物,以绵羊肺组织基因组DNA为模板进行SRA基因启动子序列PCR扩增、测序,然后对序列进行生物信息学分析,包括预测启动子活性区域、转录因子结合位点、TATA box及CpG岛。结果表明:利用根据UCSC数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物未扩增出目的片段,利用NCBI数据库预测的SRA基因启动子序列设计的引物扩增得到了绵羊SRA基因启动子序列,大小约为1200 bp,与NCBI预测序列的相似性为99%,其中第577位碱基发生了突变(G→A);含有1个潜在活性区域(aaaaatgagctcacattcattttttttttcttaactggc);存在干扰素调节因子(interferon regulatory factor,IRF)1、IRF2、c-Jun、CCAAT增强子结合蛋白(CCAAT enhancer binding protein,C/EBP)、活化蛋白1(activator protein 1,AP-1)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)转录因子结合位点,其中IRF1和c-Jun的结合位点出现频率较高;不存在TATA box和CpG岛,只存在3个CpG位点。说明SRA基因的表达可能受IRF1和c-Jun等相关转录因子的调控,不受甲基化的影响。

绵羊肺炎支原体不同分离株的致病性比较

为研究不同绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)的致病性差异,筛选出致病性强的Mo菌株。通过间接免疫荧光技术检测不同Mo分离株(XJ15、XJ13、XJ22、1412、XJN)、标准株(Y98)对山羊气管上皮细胞(goat tracheal epithelial cells,GTEC)的黏附力强弱,将不同Mo菌株以109 CCU/mL浓度,0.2 mL/只,接种到7日龄SPF鸡胚的卵黄囊中,设阴性对照组和空白对照组,检测并观察Mo感染鸡胚致死率以及死亡鸡胚病理变化,记录鸡胚死亡时间,取死亡鸡胚的尿囊液进行PCR鉴定,同时对各个感染组的卵黄囊液进行PCR检测。结果显示,6株Mo均能黏附GTEC细胞,其中XJ15黏附力最强,XJN黏附力最弱。在鸡胚感染试验中,6株Mo均能引起鸡胚死亡,且不同Mo感染组鸡胚死亡数差异显著(P<0.05)。其中,XJ15感染组致死率为90%,1412和XJN感染组致死率为20%。感染组死亡鸡胚表面有出血,充血症状,尿囊液PCR检测均为阳性。表明,筛选出XJ15为致病性较强的Mo分离株,为后期Mo人工感染模型的建立奠定基础。

金银花源miR2911基因靶向猪伪狂犬病毒基因区域分析与验证

金银花源miR2911是一种丰度较高、性质稳定的抗病毒分子,在抗流感病毒感染和SARS-CoV-2感染中发挥关键作用。然而,有关miR2911靶向猪伪狂犬病毒基因区域的研究鲜有报道。因此,本研究旨在分析miR2911靶向PRV的基因区域,进一步分析miR2911靶点在不同流行毒株中的保守性,以验证miR2911对靶向区域的结合作用。利用miRanda软件成功预测miR2911在猪伪狂犬病毒基因组中存在多个靶点,靶向猪伪狂犬病毒UL34基因区域保守性很高,利用报告基因系统证实miR2911可通过结合UL34靶向区域发挥抑制作用。这为后续深入研究miR2911在抗猪伪狂犬病的机理方面提供了重要支撑资料。

绵羊MSR1克隆及其序列分析

为了解绵羊巨噬细胞清道夫受体1(Macrophage Scavenger Receptor 1,MSR1)基因的生物学信息特征,本研究对绵羊MSR1进行了克隆鉴定,与其他物种的MSR1氨基酸序列进行比对、构建进化树,并进行生物信息分析,预测了MSR1的理化性质。结果显示:绵羊MSR1基因ORF区全长1362 bp,编码453个氨基酸,分子量约为50 kDa,构建了MSR1真核表达载体;绵羊MSR1与山羊、羚羊、马鹿、水牛、白鲸、猪、人、家兔、小鼠的同源性分别为98.90%、96.03%、93.16%、93.16%、81.28%、78.81%、74.17%、73.51%、63.77%,同属于牛科动物的序列同源性在90%以上,进化树上在同一分支;该蛋白分子式为C_(2188)H_(3473)N_(629)O_(680)S_(19),理论等电点为6.00,蛋白质性质为弱酸性,51~73号氨基酸为跨膜结构,有7个潜在的糖基化位点和多个磷酸化位点,存在2个棕榈酰化位点和5个乙酰化位点,169~180位氨基酸序列区域为优势抗原决定簇。研究结果为以后研究绵羊MSR1的功能奠定了基础。

绵羊TNF-α基因启动子克隆、活性分析及转录因子预测

绵羊肺炎支原体感染诱导绵羊TNF-α上调表达的机制不明;据报道,TNF-α上调表达与其启动子激活密切相关。然而,绵羊TNF-α启动子尚未克隆,以及其启动子活性水平也不清楚。因此,通过对绵羊TNF-α启动子预测分析,以绵羊肺组织DNA为模板克隆TNF-α启动子,构建荧光素酶报告载体;进一步,利用双荧光素酶报告系统检测TNF-α启动子活性;最后,利用AliBaba 2.1软件预测TNF-α启动子上潜在的转录因子结合区域。结果显示,克隆的绵羊TNF-α启动子区域含有TATA-box元件,启动子具有很强的活性;绵羊TNF-α启动子中预测到9个潜在的转录因子结合区域,分别是6个Sp1、2个C/EBPalp和1个c-Jun。通过克隆绵羊TNF-α启动子、预测潜在的转录因子结合区域等,为进一步研究病原菌诱导绵羊TNF-α高水平表达的机理奠定了基础。

绵羊干扰素调节因子1基因克隆、序列分析及真核表达

绵羊干扰素调节因子1(interferon regulatory factor 1,IRF1)在病原微生物感染中发挥重要作用。为研究绵羊IRF1功能,以绵羊肺组织cDNA为模板,扩增IRF1基因ORF,并对其序列进行生物信息学分析,构建p3×Flag-CMV-14-IRF1重组质粒。将重组质粒转染HEK293T细胞,运用Western blot进行蛋白质鉴定。结果表明,绵羊IRF1 ORF大小为969 bp,编码325个氨基酸;绵羊IRF1氨基酸序列与山羊、猪、人、马相似性分别为100%、91.61%、87.73%和89.44%;进化树显示,绵羊IRF1与山羊、牛、猪、白鳍豚、马等哺乳动物聚类在一起;绵羊IRF1蛋白分子式为C_(1596)H_(2497)N_(435)O_(497)S_(17),理论等电点为5.58,具有1个潜在的N-糖基化位点和多个磷酸化位点,无信号肽和跨膜结构域;该重组蛋白高效表达,分子质量约为50 ku。研究结果为绵羊的IRF1功能研究提供了基础材料。

猪源microRNAs靶向非洲猪瘟病毒基因区域分析

为了探讨宿主microRNAs(miRNAs)是否靶向非洲猪瘟病毒(ASFV)基因,以及初步确定miRNAs靶向病毒基因的区域,试验以ASFV感染猪差异表达的miRNAs为研究对象,利用miRanda软件分析miRNAs靶向ASFV基因的具体区域和结合能力,再利用MEGA 7.0软件分析miRNAs所靶向的ASFV基因序列的保守性。结果表明:ssc-miR-122和ssc-miR-125b可同时靶向ASFV CP2475L基因,其中ssc-miR-122靶向该基因4个区域;ssc-miR-181a和ssc-miR-125b可同时靶向ASFV MGF_300-4L基因,其中ssc-miR-181a靶向该基因2个区域;此外,ssc-miR-181a可靶向ASFV NP1450L、E111R基因,ssc-miR-125b靶向ASFV P1192R基因,ssc-miR-145-5p靶向ASFV NP868R、C717R、MGF_505-1R等8个基因,ssc-miR-126-3p靶向ASFV G1211R、EP296R、MGF_110-5L-6L基因,ssc-miR-92a靶向ASFVI329L和EP424R基因;选择多个miRNAs所靶向的ASFV CP2475L和MGF_300-4L基因序列构建进化树,CP2475L和MGF_300-4L基因序列同源性均为100%。说明猪源miRNAs具有潜在的靶向抑制ASFV复制的能力,初步明确了ssc-miR-122、ssc-miR-181a、ssc-miR-125b等miRNAs靶向ASFV CP2475L、MGF_300-4L等基因的具体区域。

重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A的体外生物学活性检测

旨在研究重组绵羊肺表面活性物质结合蛋白A(rSP-A)对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性及淋巴细胞体外增殖的影响,初步分析rSP-A的抑菌活性。使用绵羊肺炎支原体(Mo)感染体外培养的绵羊外周血中性粒细胞以刺激其释放NE,然后应用底物显色法对比分析不同浓度rSP-A对NE活性的影响;使用MTT比色法测定rSP-A对体外培养的绵羊外周血淋巴细胞增殖活性的影响;使用酸化法和平板菌落计数法测定rSP-A对Mo代谢与增殖的影响;应用平板菌落计数法对rSP-A的抑菌活性进行初步分析。NE活性检测结果表明,rSP-A可显著增强Mo刺激绵羊外周血中性粒细胞释放的NE活性(P<0.05),且呈剂量效应关系;淋巴细胞增殖试验显示,rSP-A能够显著抑制淋巴细胞的增殖(P<0.05);代谢试验证实rSP-A对体外培养的Mo的代谢具有明显的抑制作用(P<0.01);抑菌试验显示,rSP-A对致病性肺炎链球菌和巴氏杆菌的增殖具有明显的抑制作用(P<0.05)。研究结果说明,真核表达的rSP-A具有明显的生物学活性,这为进一步研究绵羊体内肺表面活性物质结合蛋白A(SP-A)的生物学特性奠定了基础。

绵羊清道夫受体MARCO基因启动子克隆及生物信息学分析

为了分析绵羊清道夫受体MARCO基因的启动子序列特点,初步研究其功能及转录调控机理,以绵羊肺组织DNA为模板,通过PCR扩增绵羊MARCO基因启动子序列,对其序列进行生物信息学分析,并构建双荧光素酶报告基因载体。结果显示,成功克隆绵羊MARCO基因启动子,大小为1002 bp;预测了其核心活性区域,发现有1个潜在的活性区域位于5′端-790~-741,同时发现了1个TATA-box元件和多个转录因子结合位点,未发现CpG岛。结果表明,位于绵羊MARCO基因启动子区域的TATA-box元件和Sp1、NF-1、NF-κB、C/EBPalp、c-Jun等转录因子,可能影响绵羊MARCO基因启动子的激活,为后续研究MARCO基因的转录调控机理提供了参考依据。

SPLUNC1基因在2种绵羊不同组织器官中差异表达分析

SPLUNC1是抗病原微生物感染的关键蛋白。为研究SPLUNC1基因在2种绵羊不同组织器官中的差异表达情况,试验选取健康新疆阿勒泰羊5只,多胎萨福克羊5只,放血处死后分别采集气管、支气管、肺脏、胃、食管、结肠、心脏、脾脏、皮肤,提取RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板,扩增SPLUNC1基因748 bp特征片段,克隆至pMD19-T载体中,提取质粒。以梯度稀释的质粒为模板,建立SPLUNC1基因转录本拷贝数的绝对定量标准曲线,对2种绵羊各组织器官中SPLUNC1的mRNA初始拷贝数进行定量分析。结果表明:阿勒泰羊标准曲线扩增效率(E)为97%,回归系数(R^(2))为0.9990,SPLUNC1 mRNA初始拷贝数从高至低依次为气管、支气管、肺脏、脾脏、食管、心脏、胃、结肠、皮肤。萨福克羊标准曲线扩增效率(E)为99%,回归系数(R^(2))为0.9989,SPLUNC1 mRNA初始拷贝数从高至低依次为气管、支气管、肺脏、脾脏、心脏、食管、胃、结肠、皮肤。2种绵羊的气管SPLUNC1 mRNA表达量均显著高于其他各组织(P<0.05),皮肤表达量最低。新疆阿勒泰羊的9种组织器官该基因表达量均显著高于多胎萨福克羊(P<0.05)。上述结果说明绵羊的SPLUNC1基因的分布具有组织器官特异性,为揭示绵羊抗感染的分子调控机制提供一定参考。

猪繁殖与呼吸综合征病毒感染对TRIF启动子甲基化的影响

为研究猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)后肺组织TRIF基因的甲基化水平和mRNA表达水平,分别采集相同月龄健康仔猪肺组织和临床PRRSV感染仔猪肺组织,使用实时荧光定量PCR对采集的样品进行PRRSV orf7和TRIF基因mRNA表达水平检测,并通过亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测TRIF基因启动子的甲基化模式。结果显示,PRRSV感染组肺组织中TRIF基因的mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.05),PRRSV感染组肺组织中TRIF基因启动子甲基化率为90.5%,对照组为95.2%,其中在第7甲基化位点,PRRSV感染组甲基化水平显著低于对照组(P<0.05)。本研究为进一步探讨TRIF基因在PRRSV感染中的差异表达奠定了基础。

绵羊microRNAs靶向TNF 3'UTR基因区域分析

为了探讨绵羊microRNAs(miRNAs)是否靶向TNF 3’UTR区域,以及初步确定miRNAs靶向其基因的区域,笔者以绵羊miRNAs为研究对象,利用PCR方法克隆TNF 3’UTR(3’非翻译区),应用miRanda软件分析miRNAs靶向TNF 3’UTR基因的具体区域和结合能力。结果表明,成功克隆TNF 3’UTR,大小为500 bp;miR-125b、let-7b和let-7c同时靶向TNF 3’UTR基因,表明宿主miRNAs具有潜在的靶向抑制TNF 3’UTR基因表达的能力,初步明确miRNAs靶向TNF 3’UTR基因的具体区域,为进一步探讨miRNAs调节TNF 3’UTR表达提供了基础资料。