非综合征型耳聋GJB2基因和mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变分析

目的:分析南京聋校散发性耳聋患者GJB2基因突变率和线粒体DNA(mtDNA)12SrRNA A1555G基因突变率。方法:收集聋校学生135名和健康对照人群162名外周血样本,PCR扩增GJB2和mtDNA 12SrRNA基因,通过限制性内切酶酶切鉴定突变热点,对PCR产物直接测序进行突变确定。结果:对GJB2检测结果显示:散发性耳聋患者样本中发现9种碱基改变(V27I、E114G、I203T V37I、176-191del16、235delC、299-300delAT、T123N和504insGCAA),其中235delC为主要突变方式,携带率为27.41%,其中纯合突变18例,杂合突变19例;162例正常对照中发现了15种碱基改变,其中4种为常见多态。散发聋135例和正常对照162例共计297例样本中未发现有mtDNA 12SrRNA A1555G位点突变存在;结论:GJB2基因突变是引起散发性非综合征耳聋患者听力损失发生的重要原因,不同人种GJB2基因的突变热点存在差异,235delC是GJB2基因在中国人中的主要致病突变位点;GJB2基因在人群中存在较多类型的突变和较多形式的多态性;在散发性耳聋中mtDNA 12SrRNA A1555G位点的突变率明显低于全国平均水平。

RBL生物技术开放实验的探索与实践

随着现代医学教育模式逐渐向以学生为主体转变,为了更好地运用整合式课程体系,培养南京医科大学医学与非医学专业学生的专业应用能力和科学研究技能,对探究式(research-based learning,RBL)开放实验课程进行了"一心四化"的改革与探索。该课程以学生为中心,利用省级医药生物技术实验教学实验平台、由专任教师引导学生对感兴趣的项目以科学的思路进行科研设计,由长期从事科研工作的课题组教师进行技术指导,延伸和补充了课堂知识。通过该开放实验教学激发了学生对专业课程的兴趣,锻炼了学生的创新思维和实践操作能力,起到了良好的教学效果。

非综合征耳聋患者线粒体DNA 12S rRNA及tRNA^(Ser(UCN))基因序列分析

目的 :探讨线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)12S rRNA基因及tRNASer(UCN)基因突变与非综合征耳聋的相关性,以及常见致聋突变携带频率。方法:收集非综合征耳聋患者135例和听力正常对照人群126例的外周血样本,常规方法提取基因组DNA,PCR扩增mtDNA 12S rRNA基因及tRNASer(UCN)基因,扩增产物经直接测序进行耳聋相关突变的鉴定。结果:135例非综合征耳聋患者中共检测到11种mtDNA 12S rRNA碱基变异,其中4种已知致病突变的携带率分别为:A827G,4.4%;T961C,1.5%;T1095C,0.7%;A1555G,1.5%。两组人群均未检测到12S rRNA C1494T突变以及tRNASer(UCN)基因任何形式的致聋突变。结论:mtDNA 12S rRNA是南京地区汉族非综合征耳聋人群的突变热点基因,其常见致聋突变总携带率约为8.1%。

ING4基因表达对乳腺癌细胞生长抑制作用的研究

目的:研究人ING4基因对乳腺癌细胞MCF-7的生长抑制作用。方法:通过实时荧光定量-PCR(real-time fluorogen-tic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测3种乳腺癌细胞株中ING4 mRNA的表达水平;ING4基因的表达质粒转染MCF-7细胞;MTT法和FCM法检测ING4基因对MCF-7细胞增殖的影响;Annexin-Ⅴ/PI双染法观察细胞凋亡情况;RT-PCR法分析转染ING4后p53、p21及bax基因的转录表达情况。结果:在3种乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-435和MDA-MB-231中ING4的表达均明显低于正常乳腺组织。转染ING4表达载体的MCF-7细胞较对照组细胞生长速度减慢(P<0.05);细胞周期中G1期比例增加,S期比例减少;细胞凋亡率升高。p53的表达未见明显变化,而p21和bax表达显著上调。结论:ING4与乳腺癌的发生发展具有一定相关性;高表达ING4基因能够抑制人乳腺癌细胞MCF-7的生长。

γ-聚谷氨酸胆甾醇基衍生物自组装纳米胶束的制备与表征

对水溶性的γ-聚谷氨酸(γ-PGA)进行接枝改性,合成了两亲性胆甾醇基γ-PGA衍生物;通过红外光谱(FT-IR)及核磁共振(1H-NMR)对其结构进行了表征和确证;并采用超声探头法制备得胆甾醇基γ-PGA自组装胶束。在中性介质条件下,形成的胶束在透射电镜下观察呈规则球状,平均粒径为(299.6±5.4)nm,粒径的多分散系数(PDI)为0.17。实验表明,两亲性胆甾醇基γ-PGA自组装体的形成是分子内分子间疏水作用力、分子带电情况和分子柔性变化等协同作用的结果,而介质pH是重要的影响因素,其形成的核壳结构可作为疏水药物和大分子药物的载体。

G蛋白偶联受体相关分选蛋白功能特征与相关疾病研究进展

G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)作为最大的一类膜蛋白受体家族,可被多种配体激活并发挥相应的信号转导功能,参与生物体内重要的生理过程。G蛋白偶联受体相关分选蛋白(G protein-coupled receptors associated sorting proteins,GASPs)则对内吞后的GPCRs分选过程发挥着重要的作用,并介导受体进入降解或再循环途径,进而调控细胞的信号转导等过程。研究发现GASPs的功能缺陷与多种疾病相关,包括神经系统疾病、肿瘤和耳聋等。本文重点介绍了G蛋白偶联受体相关分选蛋白的功能特征及其相关信号通路,描述了GASPs功能缺陷与疾病的关联性及家族蛋白与GPCRs的相互作用、GASPs分选途径的发现、参与的信号通路及对基因转录调控,以期为GASPs相关多种疾病的治疗提供新的思路和策略。

常染色体显性遗传性听神经病MPZ基因序列分析

目的:了解MPZ基因是否与1个常染色体显性遗传性听神经病中国家系的发病相关。方法:选择1个现存3代9人的常染色体显性遗传性听神经病家系为研究对象,用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。首先,对所有家系成员DNA进行MPZ基因第3外显子的PCR扩增,扩增产物经纯化后直接测序;然后,采用相同方法对1名家系听神经病患者进行MPZ基因全部6个外显子的PCR扩增和测序分析。测序结果与标准序列对照进行突变检测。结果:所有研究对象的基因区域均扩增成功,序列分析在MPZ基因第3外显子上未检测到Thr124Met和Tyr145Ser 2个已知的突变,整个MPZ基因编码区也未见新的致聋突变。结论:该家系成员MPZ基因上未发现有意义的突变位点,提示新基因参与家系耳聋的发生。

医学院校生物技术专业实践教学新模式的探索

文章论述了构建医学院校生物技术专业人才培养模式的思路,提出新形势下生物技术人才的培养必须顺应社会需求,合理定位,体现特色,强化实践。在教学实践中确立了"点、线、面至立体"的递进式实践教学新体系,并对该教学体系下的人才培养模式进行了深入探讨。

黏度法测定γ-聚谷氨酸含量

采用乌氏黏度计测定了不同浓度下γ-聚谷氨酸稀溶液的黏度,由哈金斯(Huggins)方程和克拉默(Kraemer)方程结合外推法求得室温下γ-聚谷氨酸在中性水溶液中的特性黏度[η]为7.830 L/g,并推导出由溶液的相对黏度ηr与增比黏度ηsp计算γ-聚谷氨酸溶液浓度的公式。依据溶液黏度与浓度的关系,可以简便、快速、准确地估算出γ-聚谷氨酸的浓度。

医学院校生物技术专业实验教学体系的改革与实践

论述了医学院校生物技术专业进行实验教学体系改革的思路,提出新形势下生物技术专业的实验教学必须顺应社会需求,合理定位,体现特色,强化实践。结合教学实践,确立了"点、线、面至立体"的递进式实验教学新体系,并对该教学体系的进一步实施和完善进行了深入探讨。

GPRASP2基因编辑猪胎儿成纤维细胞系的建立

目的:采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G蛋白偶联受体相关分选蛋白2(G protein-coupled receptor associated sorting protein 2,GPRASP2)基因敲除的猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFF),为构建GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型提供相应的供体细胞。方法:采用生物信息学方法对人与猪GPRASP2基因进行亲缘性和同源性分析,预测人与猪GPRASP2基因编码的氨基酸序列和蛋白二级结构;设计合成靶向巴马猪GPRASP2基因编码区上游和下游的单导向RNA(single guide RNA,sgRNA),以p X330质粒为载体,构建含有Cas9骨架的重组打靶质粒,并将此重组质粒转染至PFF中,G418药物筛选阳性单克隆细胞,测序分析其基因型。结果:生物信息学分析提示人/猪GPRASP2亲缘关系相近,同源性较高,且主要功能结构域Arm2的二维和三维结构相似。构建了靶向猪GPRASP2基因的重组打靶质粒并转染PFF,通过药物筛选、基因型分析和Western blot验证,成功获得GPRASP2基因敲除单克隆PFF。结论:人/猪GPRASP2基因亲缘关系相近且高度同源;采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术成功构建GPRASP2基因敲除的单克隆PFF,为建立GPRASP2基因敲除巴马小型猪模型奠定了前期基础。

大鼠耳蜗前体细胞的体外培养与分化鉴定

目的 :分离、培养大鼠的耳蜗前体细胞,鉴定其增殖和分化能力,分析内耳发育相关基因在其分化中的表达。方法 :从新生大鼠的耳蜗组织中分离获得前体细胞,进行体外培养,并加入血清诱导分化,通过免疫细胞化学的方法鉴定其增殖和分化为毛细胞的能力,利用荧光定量PCR的方法分析不同分化阶段的耳蜗前体细胞中内耳发育相关基因的表达。结果:原代培养的耳蜗前体细胞经免疫细胞化学鉴定呈nestin、Brd U阳性,经血清诱导分化后呈myosinⅦA阳性。荧光定量PCR的结果表明Sox2、Cyclin A2在耳蜗前体细胞分化的过程中表达逐渐下降,而Jagged1在分化过程中表达不断升高。结论 :分离的耳蜗前体细胞具有增殖能力和分化为毛细胞的潜能,在其分化过程中Sox2、Cyclin A2和Jagged1可能参与调控大鼠前体细胞的分化和耳蜗组织的发育。

siRNA沉默DNMT1对人乳腺癌细胞MCF-7生长的影响

目的靶向人DNMT1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)构建RNA干扰载体,研究其对乳腺癌细胞周期、增殖及凋亡的影响。方法靶向DNMT1基因设计三条短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)的寡核苷酸片段,构建重组体pGCsi-DNMT1,转染至乳腺癌细胞株MCF-7,定量PCR法检测DNMT1mRNA表达水平;流式细胞技术分析细胞周期的变化;MTT法检测细胞生长情况;Annexin V/PI双染法观察细胞凋亡情况;定量PCR法分析沉默DNMT1基因后对RASSF1A、p16、p21、p27及ERβ基因表达的影响。结果在构建的靶向DNMT1的shRNA重组质粒pGCsi-DNMT1中,成功筛选到pGCsi-T3能显著下调DNMT1的表达。实时定量PCR检测结果证实重组质粒pGCsi-DNMT1对乳腺癌MCF-7细胞中DNMT1基因的转录有明显的抑制作用。MCF-7细胞转染后,pGCsi-DNMT1可明显抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖;大量细胞发生凋亡;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加;定量PCR检测到乳腺癌细胞中RASSF1A、p16、p21及ERβ基因mRNA表达水平明显升高,而p27基因表达水平未见明显变化。结论重组质粒pGCsi-DNMT1能特异有效地抑制MCF-7细胞内DNMT1的表达、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,并可通过抑制DNMT1的活性来解除相关基因启动子区的高度甲基化状态,从而促进肿瘤相关基因的表达,提示DNMT1可作为乳腺癌基因治疗的新靶标。

特大常染色体显性遗传聋家系听力学特征及候选致病基因突变筛查

目的探讨一中国常染色体显性遗传聋大家系的听力学特征,进行已知致聋基因已知突变位点的筛查。方法经知情同意,对家系成员进行全身检查及听力学检测,获得血样标本;整理分析家系资料并绘制系谱图;用基因组DNA抽提试剂盒提取外周血DNA。对2例家系患者DNA进行GJB2和GJB3基因全部编码区突变检测,对其余23个已知常染色体显性遗传性耳聋(DFNA)基因的74个已知突变位点所涉及的50个外显子进行PCR扩增和直接测序分析。结果该家系共7代199人,现存4代176人,耳聋患者54人。系谱分析显示,耳聋表型代代相传,男女患病人数分别为24和30,符合常染色体显性遗传特征。听力学表现为:迟发性、进行性、双侧对称性、感音神经性听力损失,首先是高频区受损,并快速向中、低频扩展。GJB2、GJB3基因全部编码区及其余23个DFNA基因已知突变位点的序列分析均无阳性发现。结论该家系是一个非综合征型常染色体显性遗传聋大家系,耳聋表型为迟发性、进行性、双耳对称性感音神经性听力损失;初步分子遗传学分析提示可能由新基因或已知基因的新突变致病。

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响。方法应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMT1反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染入人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化。结果成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒。转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加。结论反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标。

耳聋分子病因学检测与临床应用研究

目的:探讨基因检测在耳聋病因学诊断中的应用前景。方法:收集原因不明的门诊非综合征型耳聋患者200例,采用耳聋基因芯片结合DNA序列测定方法,对中国人中4个常见耳聋相关基因的9个热点突变进行分子检测。9个突变位点分别是:GJB2基因的35delG、176del16bp、235delC和299delAT,GJB3基因的C538T,SLC26A4基因的IVS7-2A>G和A2168G,以及线粒体DNA 12S rRNA基因的A1555G和C1494T。结果:芯片筛查发现携带上述耳聋基因突变者78例(39.0%),其中GJB2突变37例(18.5%),SLC26A4突变28例(14.0%),GJB3突变2例(1.0%),mtDNA 12S rRNA突变11例(5.5%)。59例(29.5%)患者可确诊为遗传性耳聋。结论:约30%的原因不明的门诊非综合征型耳聋患者与遗传因素有关,耳聋基因诊断具有广阔的应用前景。

γ-聚谷氨酸合成菌株的筛选与优化培养

从土壤筛中筛选分离获得1株γ-聚谷氨酸合成菌Bacillus subtilis PGS-1,在富含谷氨酸和葡萄糖的培养基中可大量合成γ-聚谷氨酸,与大多文献报道的微生物合成的γ-聚谷氨酸相比,具有较低的分子量(300ku～400ku)和较窄的分子量分布,可适用于低分子量要求的医药、化妆品和水处理等应用领域,值得深入开发研究。为提高γ-聚谷氨酸的发酵产量,对Bacillus subtilis PGS-1的摇瓶培养基条件进行了响应面优化,确定了影响γ-PGA合成的显著因素依次为谷氨酸、葡萄糖和(NH4)2SO4;在优化条件下,γ-聚谷氨酸产量达26g/L,较优化前提高了44%。

22例非综合征型耳聋患者的致病基因突变位点分析

目的:对遗传性非综合征型耳聋患者进行中国人常见的耳聋相关基因的突变分析,以明确其分子病因。方法:门诊收集非综合征耳聋患者22名的外周血样本,常规方法提取基因组DNA,PCR扩增GJB2基因和线粒体12SrRNA基因全序列,以及SLC26A4基因7+8外显子和19外显子序列。所有PCR扩增产物经DNA测序分析,测序结果提交NCBIGenBank数据库进行比对,从而对耳聋相关基因的突变进行分析。结果:22名非综合征耳聋患者中共检测到3种GJB2基因的突变:235delC纯合突变2例;235delC杂合突变3例及176del16bp和299delAT复合突变1例;mtDNA12SrRNA基因检出有2种已知致病突变:A1555G2例和C1494T2例;SLC26A4基因有IVS7-2A>G杂合突变2例,纯合突变1例。结论:PCR扩增结合DNA测序是耳聋基因诊断的经典和有效的方法,能确诊非综合征型耳聋患者的分子病因,为临床诊断和治疗提供依据。但该方法存在不能定性、耗时费力、所需成本昂贵且不能同时对不同基因的多个突变位点进行检测等缺点。因此,临床的耳聋基因诊断,需要操作简便、结果准确、通量高、价格低廉的新手段。

SLC26A4基因频发致聋突变的种族差异及其分子结构分析

目的 ：SLC26A4基因是导致遗传性耳聋的第二个常见致病基因,在已知耳聋患者中SLC26A4基因突变至少有170种。然而不同地区的耳聋人群突变热点各异,更无SLC26A4致聋性频发突变频率的相关报道,因此本研究对致聋基因SLC26A4频发突变的种族差异及其分子结构进行了深入探讨。方法：依据公共数据库,系统收集1997-2014年全球SLC26A4与耳聋相关的文献报道662篇,基于NEWCASTLE OTTAWA（NOS）标准筛选出31篇文献纳入研究,采用STATA11.2和Rev Man 5.1软件进行了Meta分析,并结合Swiss Model软件对SLC26A4频发致聋突变而导致的蛋白分子结构变异进行比较分析。结果：1发现SLC26A4突变增加耳聋发病风险（OR=39.73,95%CI：21.36-73.90,P〈0.001）;2 SLC26A4突变在亚洲人群中有显著异质性,而欧美地区则无异质性;3鉴定出SLC26A4基因6种高频致聋突变（p.V138F、p.G209V、c.IVS7-2A〉G、c.IVS8＋1G〉A、p.T416P和p.H723R）,并通过蛋白质分子结构模拟发现突变后有意义的结构改变。结论 ：本研究为SCL26A4致聋突变在不同地区耳聋人群中的遗传学效应研究奠定了基础。

基于CRISPR/Cas9技术建立敲除OSBPL2基因的HeLa细胞株

目的 :利用CRISPR/Cas9技术构建OSBPL2基因敲除的稳定HeLa细胞株。方法 :设计3个单导向RNA(singleguide RNA,sg RNA),分别靶向OSBPL2基因的第2、3和5外显子,以PGK1.1为载体,构建出3个重组真核表达载体。分别转染HeLa细胞后,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,Cruiser TM敲除检测实验和测序共同检验载体靶向效率。选出靶向效率最高的质粒转染HeLa细胞,进行单克隆细胞培养,最后用Western blot鉴定敲除效果。结果:sg RNA正确插入到PGK1.1载体,靶向第2外显子的重组载体转染HeLa细胞并筛选单克隆后,细胞未检测出OSBPL2蛋白的表达。结论:敲除OSBPL2基因的稳定HeLa细胞株构建成功。