青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织PI3K/Akt信号通路的影响

目的 探讨青娥方对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的影响。方法 采用随机数字表法将72只3月龄SPF级雌性SD大鼠分为假手术组、模型组和青娥方组,每组24只。大鼠均按40 mg/kg腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉,于下腹部正中作切口,模型组和青娥方组均切除双侧卵巢,假手术组切除卵巢周围少量脂肪组织后立即关腹,缝合伤口。造模1周后,假手术组和模型组予2 mL0.9%氯化钠溶液灌胃,青娥方组按浸膏量0.42 g/(kg·d)予青娥方药液灌胃,每日1次,连续灌胃12周。3组分别于干预4、8、12周后各处死8只并取材。Masson染色法观察股骨颈形态;检测股骨骨密度和骨生物力学指标最大载荷;ELISA法检测血清PI3K、Akt含量;qPCR和Western blot检测腰椎PI3K、Akt和糖原合成酶激酶3β(GSK3β)mRNA相对表达水平和蛋白表达量。结果 与假手术组比较,模型组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平明显升高(P<0.05);第12周股骨最大载荷明显降低(P<0.05);第8、12周股骨骨密度明显降低(P<0.05),腰椎PI3K mRNA相对表达水平均明显升高(P<0.05),PI3K蛋白表达量明显升高(P<0.05);第4、8、12周血清PI3K、Akt含量均明显升高(P<0.05),腰椎Akt、GSK3β蛋白表达量均明显升高(P<0.05),GSK3β mRNA相对表达水平明显升高(P<0.05)。与模型组比较,青娥方组干预第4周腰椎Akt mRNA相对表达水平和蛋白表达量明显降低(P<0.05);第12周股骨最大载荷明显升高(P<0.05),血清Akt含量均明显降低(P<0.05),腰椎Akt蛋白表达量明显降低(P<0.05);第8、12周股骨骨密度明显升高(P<0.05),腰椎PI3K、GSK3β mRNA相对表达水平均明显降低(P<0.05),PI3K蛋白表达量明显降低(P<0.05);第4、8、12周血清PI3K含量明显降低(P<0.05)。结论青娥方可改善去卵巢骨质疏松模型大鼠骨密度及骨生物力学性能,其机制可能与抑制PI3K/Akt信号通路有关。

浅析高职院校辅导员队伍现状和提升路径

落实立德树人根本任务,培养德智体美劳全面发展的社会主义建设者和可靠接班人,离不开高校辅导员的发力。近几年,高校的辅导员队伍如雨后春笋般发展壮大起来,这一方面是为辅导员队伍专业化添砖加瓦,补充了人员不足的缺陷,但同时也面临着辅导员队伍年轻化,流动大,工作能力还有待提高的现状。本文旨在梳理现阶段高职院校辅导员队伍的现状,剖析原因,同时提出合理化的一点建议。

基于PERK/eIF2α/ATF4/CHOP通路探讨健骨颗粒对UMR-106细胞内质网应激凋亡的影响

目的探讨健骨颗粒含药血清对UMR-106成骨样细胞内质网应激ERS凋亡的影响和作用机制。方法选用UMR-106成骨样细胞,采用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L不同浓度的GSK2606414(PERK抑制剂)对细胞进行干预,采用CCK8法筛选GSK2606414最佳干预浓度。将生长状态较好的UMR-106细胞随机分为阴性对照组(NC组)、模型组(H_(2)O_(2)组)、健骨颗粒组(H_(2)O_(2)+JG组)和阳性对照组(H_(2)O_(2)+GSK2606414组)4组。NC组和H_(2)O_(2)组采用10%生理盐水血清干预12 h,H_(2)O_(2)+JG组采用10%健骨颗粒含药血清干预12 h,H_(2)O_(2)+GSK2606414组采用0.03μmol/L的GSK2606414和10%生理盐水血清干预12 h,除NC组外,其余各组在不更换新培养基的情况下,再分别加入10μmol/L H_(2)O_(2)干预12 h。采用激光共聚焦显微镜观察细胞内NC组和H_(2)O_(2)组GRP78和Caspase-12荧光表达情况,DCFH-DA检测活性氧(ROS)含量,激光共聚焦显微镜观察细胞内钙离子实时动态变化判断ROS/ERS模型是否成立。再采用An⁃nexin V-FITC/PI检测4组细胞晚期凋亡率,qPCR和Western blot检测4组ERS相关标志指标GRP78、PERK、eIf2α、ATF4和CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量。结果与0μmol/L组比较,0.03μmol/L的GSK2606414是干预UMR-106细胞12 h后对细胞活力没有影响的最大浓度,故使用该浓度作为后续H_(2)O_(2)+GSK2606414组的实验干预条件。与NC组相比,H_(2)O_(2)组ROS含量显著增高(P<0.01),GRP78和Caspase-12的蛋白荧光表达量明显增加,细胞内钙离子流动速度加快并持续增高,表明H_(2)O_(2)诱导UMR-106细胞ROS/ERS模型的成功建立。与NC组相比,H_(2)O_(2)组凋亡率显著增高(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平和蛋白相对表达量均显著增高(P<0.01)。与H_(2)O_(2)组相比,H_(2)O_(2)+JG组和H_(2)O_(2)+GSK2606414组ROS含量显著降低(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.05),GRP78、PERK、eIf2α、ATF4、CHOP mRNA转录水平(P<0.05)和蛋白相对表达量(P<0.01)均显著降低。结论健骨颗粒可通过PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信号通路缓解内质网过度应激,降低成骨细胞凋亡率,发挥防治绝经后骨质疏松症的作用。

莲子心总生物碱及总生物碱高氯酸盐对MG63细胞迁移和迁移体生成的影响

目的 研究莲子心总生物碱(TAL)和总生物碱高氯酸盐(TALP)对MG63细胞迁移及迁移体生成的影响,探讨其治疗骨肉瘤的作用机制。方法 将对数生长期的MG63细胞,分为空白组、TAL组和TALP组,空白组不加药物,TAL组和TALP组以10、20、40、60、80、100μg/mL TAL和TALP培养液分别干预24、48 h后采用CCK8法检测各组细胞增殖率;根据CCK8实验结果,取24 h IC_(50)的一半剂量约为50.0μg/mL稀释成不同浓度的含药培养基来干预细胞,即2组实验组分别加入50.0、25.0、12.5、6.25μg/mL TAL和TALP干预24 h后采用划痕实验检测各组细胞迁移率,并计算迁移抑制率为50%的药物浓度;MG63细胞传代培养15~20 h后采用激光共聚焦显微镜、透射电镜观察细胞迁移体的生成和形态结构;将细胞分成空白组、TAL组和TALP组,后2组根据划痕实验结果,取细胞迁移抑制率约为50%时的药物浓度进行干预15~20 h,计算并比较各组迁移体生成的数量变化。结果 与空白组比较,20、40、60、80、100μg/mL TAL和40、60、80、100μg/mL TALP干预后细胞增殖率均显著下降(P<0.05);TAL和TALP的12.5、25.0、50.0μg/mL组细胞迁移率显著下降(P<0.05),迁移抑制率为50%的药物浓度分别为TAL 15.05μg/mL,TALP 20.16μg/mL;激光共聚焦显微镜观察显示MG63细胞迁移过程中尾部可见膨大的囊泡,透射电镜下观察到囊泡为迁移体石榴样结构;与空白组比较,TAL 15μg/mL组和TALP20μg/mL组迁移体生成的数量显著减少(P<0.05)。结论 TAL和TALP对骨肉瘤细胞迁移有抑制作用,其机制可能与影响细胞迁移体的生成有关。

基于Nrf2/HO-1通路探讨健骨颗粒含药血清对氧化应激状态成骨细胞骨形成的调控机制

目的 基于Nrf2/HO-1通路探讨健骨颗粒含药血清对氧化应激状态成骨细胞骨形成的调控机制。方法 取6周龄SPF级雄性SD大鼠40只,随机分为健骨颗粒组和生理盐水组各20只。健骨颗粒组每天灌服含生药量7.8 g/kg健骨颗粒浸膏稀释液2 mL,生理盐水组每天灌服生理盐水2 mL,2组每日灌胃1次,灌胃7 d后取大鼠腹主动脉血制备健骨颗粒含药血清和生理盐水血清。将课题组前期选用UMR-106细胞构建的Nrf2敲减稳定株细胞和Nrf2阴性对照细胞,分别分为Nrf2-KD+JG组、Nrf2-KD+NS组和NC+JG组、NC+NS组。Nrf2-KD+JG组和NC+JG组分别采用10%健骨颗粒含药血清加高糖DMEM培养12 h;Nrf2-KD+NS组和NC+NS组分别采用10%生理盐水血清加高糖DMEM培养12 h,再用10μmol/L过氧化氢干预12 h;采用超氧化物阴离子荧光探针(DHE)检测4组超氧化物阴离子含量,茜素红染色实验观察4组矿化结节数量,Western blot检测4组Nrf2、核Nrf2、HO-1、RUNX2蛋白相对表达量。结果 与NC+JG组比较,Nrf2-KD+JG组超氧化物阴离子含量增多(P<0.05),显微镜下可见矿化结节数量减少,Nrf2、核Nrf2、HO-1和RUNX2蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05)。与NC+NS组比较,Nrf2-KD+NS组超氧化物阴离子含量增多,显微镜下可见矿化结节数量减少,4个指标蛋白相对表达量均明显降低(P<0.05),NC+JG组超氧化物阴离子含量显著降低(P<0.05),显微镜下可见矿化结节数量增多,4个指标蛋白相对表达量均明显升高(P<0.05)。结论 健骨颗粒可以激活成骨细胞内Nrf2/HO-1信号通路,降低细胞内氧化应激水平,增强细胞矿化能力,促进成骨细胞骨形成。

基于SDF-1/CXCR4轴探讨补肾壮筋汤促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的机制研究

目的探讨补肾壮筋汤调控SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢和保护关节软骨的作用机制,为膝骨关节炎(KOA)的康复治疗提供实验依据。方法①动物实验中,选用8周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠30只,采用随机数字表法分为假手术组、模型组、补肾壮筋汤组,每组10只,干预12周。采用micro-CT、HE染色观察各组软骨形态变化;激光共聚焦显微镜观察骨组织SDF-1荧光强度;qPCR、Western blot检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量。②细胞实验中,选用4周龄SPF级C57BL/6雄性小鼠,采用全骨髓贴壁法提取原代BMSCs,流式细胞术对所提取的细胞进行鉴定后,筛选最佳慢病毒MOI值;随机将细胞分为空白组、空载组、补肾壮筋汤组、sh-SDF-1组、sh-SDF-1+补肾壮筋汤组5组,采用划痕实验观察各组BMSCs迁移情况;阿利新蓝、CollagenⅡ免疫细胞学染色观察各组细胞成软骨分化能力;激光共聚焦显微镜观察各组SDF-1、CXCR4的荧光强度;qPCR检测各组归巢相关调控因子mRNA转录水平。结果①动物实验中,关节组织形态学结果(micro-CT、HE染色)显示:与假手术组比较,模型组股骨髁间可见一圆形缺损,骨皮质失连,软骨细胞缺失;与模型组比较,补肾壮筋汤组股骨髁间环形缺损好转,软骨细胞排列稍紊乱。关节组织免疫荧光显示:与假手术组比较,模型组SDF-1蛋白相对表达量升高;与模型组比较,补肾壮筋汤组SDF-1的蛋白相对表达量升高(P<0.05)。qPCR与Western blot结果显示:与假手术组比较,模型组归巢关键调控因子(SDF-1、CXCR4、MIP-1α、MCP-1、MIP-1β、RANTES、VEGF、G-CSF、NCAM-1、MMP-2)的mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05);与模型组比较,补肾壮筋汤组归巢关键调控因子mRNA转录水平和蛋白相对表达量升高(P<0.05)。②细胞实验中,BMSCs经细胞流式术鉴定:CD44、CD105呈阳性表达,CD34呈阴性表达。当病毒MOI值为100时,SDF-1基因感染率最高。BMSCs迁移和成软骨分化能力检测结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞向划痕区域迁移的细胞数量、酸性黏多糖及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著减少(P<0.05);补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组迁移的细胞数量、阿利新蓝染色及CollagenⅡ蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。细胞免疫荧光显示:与空白组比较,sh-SDF-1组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著减少;补肾壮筋汤组和sh-SDF-1+补肾壮筋汤组细胞SDF-1、CXCR4蛋白相对表达量显著增多(P<0.05)。qPCR结果显示:与空白组比较,sh-SDF-1组归巢关键调控因子的mRNA转录水平降低(P<0.05),补肾壮筋汤组归巢关键调控因子的mRNA转录水平升高(P<0.05)。结论补肾壮筋汤可通过上调SDF-1/CXCR4轴促进小鼠BMSCs归巢保护关节软骨。

脊髓损伤炎症微环境形成机制和补阳还五汤治疗脊髓损伤作用机制的研究进展

脊髓损伤是一种严重的中枢神经创伤性疾病。脊髓损伤会引起一系列的免疫应答,进而在损伤部位形成炎症微环境,阻碍损伤神经的修复。补阳还五汤是临床上治疗脊髓损伤的常用方剂。许多学者针对脊髓损伤炎症微环境的形成机制及补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制进行了研究,但目前这些机制均尚未完全明确。本文从脊髓损伤炎症微环境的形成机制及补阳还五汤治疗脊髓损伤的作用机制两个方面对相关研究进行了综述,以期为补阳还五汤治疗脊髓损伤的深入研究提供参考。

解毒消癥饮诱导胃癌细胞凋亡相关基因表达的研究

目的:探讨中药复方解毒消癥饮对人胃癌细胞凋亡相关基因表达的影响。方法:将人胃癌细胞株BGC-823分成空白对照组及药物干预低、中、高剂量组,分别加入空白对照血清和相应剂量的解毒消癥饮大鼠含药血清,培养24h、48h和72h;免疫荧光染色法检测细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Fas及Fas-L的表达,应用激光共聚焦显微镜观察并做半定量分析;另行电镜制样、观察。结果:胃癌细胞经解毒消癥饮含药血清干预后,Bax、Fas表达明显增加(P<0.05),且随药物浓度增加该趋势更加明显,Fas-L则随药物浓度的增加表达明显减弱(P<0.05);Bcl-2表达量无明显变化。电镜见胃癌细胞出现早期凋亡现象,主要为细胞核异染色质边聚;线粒体嵴消失、基质深染。结论:解毒消癥饮可能通过调控胃癌细胞Bax、Fas及Fas-L等基因,从而促进细胞凋亡,并降低细胞免疫逃逸的功能。

透骨消痛胶囊促进成骨细胞的增殖和分化

背景:透骨消痛胶囊是福建中医药大学治疗骨关节炎的临床验方,以往的研究多集中于其对软骨的作用。目的:观察透骨消痛胶囊对成骨细胞增殖、分化及骨重塑相关因子表达的影响。方法:以透骨消痛胶囊干预大鼠成骨细胞 ROS17/2.8,分空白对照组和各浓度透骨消痛胶囊组,MTT 法测定细胞增殖,比色法检测成骨细胞分化的生物标志物碱性磷酸酶活性,ELISA 法检测骨钙素,茜素红染色观察骨矿化结节,实时定量 PCR 和 ELISA 法检测骨重塑相关因子骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的表达。结果与结论:与对照组相比,质量浓度为 0.25-2 g/L 透骨消痛胶囊能显著促进 ROS17/2.8 细胞增殖(P < 0.05),上调碱性磷酸酶活性(P < 0.05)、骨钙素的表达水平(P < 0.05)和矿化结节面积(P < 0.05),增加骨保护素/核因子κB受体活化因子配体的比例(P < 0.05)。提示透骨消痛胶囊防治骨关节炎的作用机制可能与其促进成骨细胞的增殖、分化以及调节骨重塑平衡的作用有关。

多种特殊染色法在骨关节炎组织形态学研究中的应用比较

目的探讨多种特殊染色法在骨关节组织中的染色规律及其在骨关节炎形态学研究中的应用价值。方法 6月龄健康新西兰大白兔20只,随机分为正常组和造模组各10只,根据改良Hulth法造模,6周后膝关节取材。对标本固定、脱钙后进行石蜡包埋和切片。分别采用HE、番红-固绿、AB-PAS、甲苯胺蓝、Van Gieson染色和Mallory染色,观察骨关节组织的形态学变化,并对几种染色方法进行比较。结果 HE染色显示关节一般组织形态结构,可见模型组关节软骨和软骨下骨发生骨性关节炎病理变化;番红-固绿染色法中软骨和软骨下骨的界限(黏合线)以及潮线显示清晰,软骨基质中糖胺聚糖含量减少,纤维成分增多;AB-PAS染色显示骨关节炎软骨基质糖胺聚糖尤其是酸性糖胺聚糖含量减少;甲苯胺蓝染色显示骨关节炎软骨的酸性糖胺聚糖减少;Van Gieson染色和Mallory染色可显示骨关节组织中的胶原纤维,但组织结构界限不够清晰。结论在骨性关节炎的组织形态学研究中,通过常规HE染色,结合番红-固绿染色法和AB-PAS染色法,能较客观全面地获得关节组织形态学相关信息。

松果体摘除及褪黑素对大鼠胸腺上皮细胞白细胞介素-7表达的影响

目的探讨松果体摘除及褪黑素对大鼠胸腺上皮细胞白细胞介素7(IL-7)表达的影响及其意义。方法1.培养大鼠胸腺上皮细胞,应用广谱角蛋白抗体进行免疫细胞化学显色鉴定;MTT法观察褪黑素(1×10-3～10-9mol/L)干预对细胞生长的影响;细胞分空白对照组、褪黑素10-8mol/L处理组和褪黑素10-6mol/L处理组,RT-PCR法观察细胞IL-7mRNA的表达;2.选用清洁级雄性SD大鼠110只,分为正常对照组、假手术对照组、松果体摘除组、松果体摘除+褪黑素7.5mg/(kg.d)腹腔注射组和松果体摘除+褪黑素15mg/(kg.d)腹腔注射组。术后4周和8周取材,运用免疫组织化学和RT-PCR方法观察胸腺上皮细胞IL-7表达的变化。结果褪黑素干预对大鼠胸腺上皮细胞的生长无显著影响,但能使IL-7mRNA的表达水平呈剂量依赖性升高;松果体摘除对大鼠胸腺上皮细胞表达IL-7无显著影响,补充褪黑素15mg/(kg.d)4周后IL-7表达显著增高,8周后均下降至正常水平。结论松果体及褪黑素可能通过影响大鼠胸腺上皮细胞IL-7的表达,从而调节胸腺细胞的分化发育。

健骨颗粒促进成骨细胞增殖的分子机制

背景:ERK是依赖于Ras途径激活的一个蛋白激酶,在成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用。而PD98059是MEK特异性抑制剂,它可通过抑制MEK的活性来抑制ERK的磷酸化,从而起到阻断ERK信号通路的作用。目前有关ERK在大鼠成骨细胞增殖和分化过程中的作用研究甚少。ERK在健骨颗粒促进大鼠成骨细胞增殖和分化过程中调控的作用更未被阐明。目的:观察ERK信号转导通路在健骨颗粒促成骨细胞增殖和分化过程中的作用。方法:取第3代SD大鼠头盖骨成骨细胞,空白组加入生理盐水血清;中药组加入最佳浓度的健骨颗粒含药血清;阻滞剂组添加PD98059阻断剂,中药加阻断剂组添加PD98059阻断剂与健骨颗粒含药血清。用MTT法测定细胞的增殖能力,比色法测碱性磷酸酶、羟脯氨酸水平。收集细胞实时荧光定量PCR-SYBRGREEN法检测Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSXmRNA的表达,Westrenblot法检测成骨细胞ERK的表达情况。结果与结论:添加PD98059阻断剂后,阻滞剂组和中药加阻滞剂组中ERK的表达显著低于空白组和中药组。阻断剂组的成骨细胞内碱性磷酸酶、羟脯氨酸的表达以及Cbfa1、Ⅰ型胶原、OSXmRNA表达显著低于空白组和中药组。ERK在健骨颗粒促进大鼠成骨细胞增殖和分化过程中发挥重要作用,ERK信号通路可能是健骨颗粒促进成骨细胞增殖和分化的主要途径。

松果体及其褪黑素影响胸腺T细胞发育周期

目的 探讨松果体对胸腺分化发育时细胞周期的影响。 方法 选用清洁级SD大鼠 ,分为正常对照组、假手术对照组、松果体摘除、松果体摘除 +褪黑素腹腔注射 7 5mg kg组和松果体摘除 +褪黑素腹腔注射15mg kg组。术后 4、8周取材。用ABC法染胸腺cyclinA、cyclinE阳性细胞 ,计算机图像分析仪测量各阳性细胞面积及其染色强度。以碘化丙啶 (PI)一步插入性DNA定量荧光染色法 ,流式细胞术测定胸腺T淋巴细胞不同细胞周期的分布状况。以RT PCR法检测褪黑素对胸腺细胞周期依赖性激酶 1β表达的影响。 结果 松果体摘除对胸腺cyclinE表达的影响甚于对cyclinA的影响 ,促进cyclinE的合成 ,松果体摘除后胸腺细胞周期的变化表现为G1 期减少 ,S期和G2 +M期百分比增多。补充褪黑素后上述改变有所恢复 ,但与剂量不成线性关系 ,且对皮髓质影响有所不同。褪黑素能促进胸腺细胞表达细胞周期依赖性激酶 1β。 结论 松果体摘除能显著影响胸腺细胞分化发育 ,补充褪黑素能缓解相关影响。

松果体及褪黑素对大鼠胸腺CD4^+/CD8^+T细胞分化发育的影响

目的:探讨松果体和褪黑素对胸腺T细胞分化发育的影响。方法:实验组为松果体摘除组和松果体摘除+褪黑素组。ABC法染胸腺CD4+、CD8+细胞。流式细胞术测定胸腺和血液T淋巴细胞CD4+、CD8+T亚类。结果:松果体摘除后胸腺明显萎缩,并随时间延长而加剧,补充褪黑素后胸腺重量逐渐恢复。松果体摘除后胸腺和血液中CD4+T细胞百分比无明显波动;胸腺CD8+T细胞比例上升,但血液CD8+T细胞比例则下降;补充褪黑素后胸腺CD4+T细胞在低剂量组略有下降,而高剂量组则显著升高,胸腺和血液CD8+T呈下降趋势,双阳性细胞比例恢复正常,双阴性细胞比例则上升。结论:松果体能显著影响CD8+T细胞的分化发育和释放,降低血液CD8+T细胞的比例。补充褪黑素能缓解相关影响。

比较3种形态学方法观察成骨细胞矿化结节的应用价值

背景:矿化结节是成骨细胞分化成熟的标志,以往观察方法多采用茜素红等特殊染色法。目的:比较茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜3种形态学观察成骨细胞矿化结节的方法,分析各自的特点及在骨病研究中的应用价值。方法:将大鼠成骨细胞株UMR-106正常培养、每天换液,连续培养14 d,分别采用茜素红染色-光镜、四环素荧光标记-激光扫描共聚焦显微镜、扫描电镜观察矿化结节的形态结构,并利用扫描电镜结合能谱仪原位定量分析钙元素;此外,在培养中加入可抑制成骨细胞增殖、分化的肿瘤坏死因子α作为对照实验。结果与结论:3种观察方法均可观察到正常成骨细胞矿化结节的形态结构。对于肿瘤坏死因子α抑制成骨细胞产生矿化结节的情况,经茜素红染色-光镜观察法,未见明显的矿化结节;而四环素荧光染色-激光扫描共聚焦显微镜观察法,可见清晰、稀少的矿化结节;扫描电镜观察法明显可见较少而细小的矿化结节,提示后二种方法灵敏度较高。此外,扫描电镜可将观察成骨细胞分泌钙质、形成矿化结节的亚细胞结构,与能谱元素分析结合,可实现矿化结节的定位与定量,在骨病研究中值得推广应用。

成骨细胞与破骨细胞共培养及其应用研究进展

成骨细胞与破骨细胞并非孤立存在,两种细胞存在直接接触、分泌旁分泌因子、细胞与骨基质3种相互作用。成骨细胞与破骨细胞共培养技术有直接接触式、间接接触式2类方式,它能最大程度地模拟体内微环境,有利于研究两细胞间的相互作用,探讨两者失衡在骨质疏松症等骨代谢疾病形成中的作用;细胞共培养应根据病理状态下两细胞的比例选用种属来源一致的细胞。目前该技术主要用于探讨药物防治骨质疏松症的作用机制,已有淫羊藿、三七、补骨脂、雷奈酸锶等既促进成骨细胞骨形成,又抑制破骨细胞骨吸收活性的双重药理作用研究等报道。成骨细胞与破骨细胞共培养的一个新的应用方向,将是应用于软骨下骨重建功能活动的探讨以及中西药干预骨性关节炎的研究。

健骨颗粒含药血清培养成骨细胞整合素/黏着斑激酶信号通路相关因子的表达

背景:目前有关成骨细胞整合素的功能状态及整合素信号转导调控的研究较少。健骨颗粒对成骨细胞整合素表达水平及信号转导通路调控的作用未被阐明。目的:观察健骨颗粒含药血清对成骨细胞黏附的影响,揭示健骨颗粒对成骨细胞整合素表达水平及信号转导通路的调控作用。方法:健康雄性3月龄SD大鼠用于制备健骨颗粒含药血清,选取最佳剂量的含药血清干预第3代大鼠成骨细胞,ELISA法检测培养液中纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白的水平,Western blot法检测成骨细胞黏着斑激酶的磷酸化情况,实时荧光定量PCR法检测成骨细胞纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶mRNA的表达。结果与结论:浓度为20%的健骨颗粒含药血清能明显增强体外培养成骨细胞的增殖活力。随着含药血清干预时间的延长,成骨细胞表达及分泌的纤连蛋白、Ⅰ型胶原、玻连蛋白、黏着斑激酶mRNA及蛋白水平逐渐上升,黏着斑激酶的磷酸化水平也逐渐增高(P<0.05);均明显高于同期的生理盐水血清干预水平(P<0.05或P<0.01)。说明健骨颗粒能作用于成骨细胞整合素激活的粘着斑激酶转导通路各相关因子,使成骨细胞进入"分泌增加→黏附增加→功能增强、分裂增殖→分泌增加"的良性循环,对成骨细胞的成骨效应起正性调节作用。

去卵巢骨质疏松大鼠成骨细胞G_1期调节蛋白的改变

背景:G1期调节蛋白对调控增殖细胞的增殖周期具有重要作用,目前关于成骨细胞G1期调节蛋白的研究甚少,绝经后骨质疏松与成骨细胞G1期调节蛋白的关系更未被阐明。目的:观察去卵巢大鼠骨质疏松发病过程中成骨细胞G1期调节蛋白的改变,探讨绝经后骨质疏松症的发病机制。方法:100只6月龄SD雌性大鼠,随机分成假手术组和模型组各50只,模型组进行双侧卵巢结扎切除术,假手术组除未行卵巢结扎切除外,其余步骤与手术组相同。所有大鼠于术后4,8,12,18,24周分批取材,每批每组各处死10只,取大鼠腰椎。运用免疫组织化学方法检测骨组织中成骨细胞G1期调节蛋白CyclinD1、CDK4、p21蛋白表达。结果与结论:CyclinD1、CDK4蛋白阳性表达主要定位于骨小梁表面的成骨细胞。假手术组有CyclinD1、CDK4蛋白阳性表达,模型组表达强于假手术组。p21蛋白阳性表达部位与CyclinD1相似,假手术组和模型组均有明显阳性表达,但模型组的表达维持在较高水平,在各时期均明显高于同期假手术组(P<0.01)。结果证实,去卵巢骨质疏松模型大鼠发病过程中,成骨细胞CyclinD1、CDK4、p21蛋白出现明显高表达。提示成骨细胞增殖加快,同时成骨细胞周期受阻滞亦增多,成骨细胞数量相对不足,骨形成低于骨吸收,导致骨质疏松的发生。

健骨颗粒含药血清对体外破骨细胞CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达的影响

目的通过观察补肾健脾中药健骨颗粒含药血清对体外破骨细胞CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达的影响,进一步揭示健骨颗粒有效防治绝经后骨质疏松症的作用机制。方法用M-CSF和RANKL诱导破骨前体细胞RAW264.7分化为成熟破骨细胞,alamar Blue法检测破骨细胞血清干预的最佳浓度,于破骨细胞培养第7天开始干预,分别用25%浓度的健骨颗粒含药血清和25%浓度的生理盐水血清干预,培养48小时后抽提总RNA,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时荧光定量SYBR GREEN法检测CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达,并取骨片行甲苯胺蓝染色,计算分析骨陷窝数和骨吸收面积,同时运用氧化显色法检测破骨细胞培养液中TRAP含量,ELISA法检测骨磨片培养液中CTx含量。结果健骨颗粒含药血清组破骨细胞CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达水平明显低于生理盐水血清组(P<0.05),含药血清组骨磨片的骨陷窝数和骨吸收面积以及TRAP和CTx含量均低于生理盐水血清组(P<0.05)。结论健骨颗粒能有效抑制破骨细胞CAⅡ、CK、MMP-9mRNA表达,降低破骨细胞功能活性,抑制破骨细胞对骨基质的分解,从而抑制骨吸收。

松果体褪黑素对大鼠胸腺CD4^+ CD25^+调节性T细胞发育及其相关基因Foxp3的影响

目的研究松果体摘除及补充褪黑素对大鼠胸腺CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg细胞)产生、输出及其相关基因叉状头/翅膀状螺旋转录子(Foxp3)表达的影响。方法选用雄性清洁级SD大鼠120只,分为正常组、假手术组、松果体摘除组、松果体摘除+褪黑素低剂量组[腹腔注射7.5mg/(kg·d)]和松果体摘除+褪黑素高剂量组[腹腔注射15mg/(kg·d)],术后4、8周取材。应用流式细胞检测技术、RT-PCR法及免疫组织化学染色法观察并分析松果体摘除及补充外源性褪黑素后胸腺及外周血CD4、CD25双阳性细胞数量及胸腺Foxp3表达的变化。结果松果体摘除术后无论4周或者8周胸腺CD4+ CD25+ Treg细胞数量均无明显变化,补充褪黑素后双阳性细胞数量呈时间、剂量依赖性明显增加;松果体摘除术后4周外周血CD4+ CD25+ Treg细胞数量明显增加,但补充褪黑素后恢复正常,而术后8周各组之间无显著性差异;半定量RT-PCR及免疫组织化学结果显示,松果体摘除后4周大鼠胸腺Foxp3表达水平明显升高,补充高低两种剂量褪黑素后均有所下降并达到正常水平,而松果体摘除后8周各组之间Foxp3的表达无明显差异。结论松果体摘除对胸腺CD4+ CD25+ Treg细胞的产生无明显影响,但导致大鼠胸腺Foxp3的转录和翻译明显增加,胸腺CD4+ CD25+ Treg细胞的输出增加,而补充外源性褪黑素后能逆转上述异常,长时间作用则其影响逐渐消失。