人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体基因的克隆与表达1 刘士辉,王国力,黄君健 等.鼠抗人纤维蛋白抗体 Fv 片段的三维结构模建.军事医学科学院院刊,1997,21(2):1202 王 翔,俞炜源.多菌落分组 P C R 法从高背景中筛选重组子.军事医学科学院院刊,1996;20(4):2333 Kutem ri

目的：克隆和表达人源化小鼠抗人交联纤维蛋白单链抗体。方法：首先依照人源化单链抗体的蛋白序列设计并优化人源化单链抗体的核苷酸序列，然后在化学合成 １４ 条人源化单链抗体基因片段的基础上，利用二次 Ｐ Ｃ Ｒ 方法构建完整的人源化单链抗体基因，并把构建的全长人源化单链抗体基因直接克隆到表达载体上，利用表达筛选和测序验证相结合的方法挑选正确的基因，并在大肠杆菌中进行了人源化单链抗体基因的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达。结果：构建并挑选到序列正确的全长人源化单链抗体基因，而且在大肠杆菌中实现了目的基因的高表达。结论：基因的部分化学合成， Ｐ Ｃ Ｒ构建及表达筛选是克隆基因的一种有效方法。

人端粒酶催化亚基hTERT基因启动子的克隆

为了确定人端粒酶催化亚基 h TERT基因的启动子结构特征 ,采用 Panhandle PCR技术 ,从正常人外周血单核细胞基因组 DNA中扩增 h TERT基因 5′端上游旁侧序列 ,结果获得了 h TERT基因翻译起始位点上游 2 0 90 bp的基因组 DNA序列。序列分析表明 h TERT基因的启动子区域缺少典型真核启动子的核心元件 ( TATA box和 CAAT box) ,但含有多个已知转录因子蛋白结合的核心序列 ,如 E box及 Sp1核心序列。提示 h TERT基因的表达可能受特殊的转录因子调控 ,这些转录因子的激活可能与癌变细胞中 h

应用噬菌体抗体库技术制备特异抗人纤维蛋白鼠单链抗体

应用Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统,从经过人交联纤维蛋白特异抗原D二聚体(DD)免疫过的鼠脾细胞mRNA中构建出组合单链抗体(ScFv)cDNA文库。文库cDNA克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化大肠杆菌TG1,得到2.5×10~5个氨苄抗性菌落。通过噬菌体表面呈现,用DD对表达的重组噬菌体单链抗体文库进行三轮亲和富集获得一株特异抗DD的噬菌体单链抗体(ScFvA11)。经Phage-ELISA鉴定,呈现在噬菌体表面的ScFvA11与DD结合的ELISA阳性滴度小于10~7tfu/ml,而与人纤维蛋白原结合的ELISA滴度大于10^(10)tfu/ml,两者相差1000倍以上。表明ScFvA11具有较好的DD结合特异性。经序列分析,ScFvA11cDNA全长729bp,其中Vh基因354bp,编码118个氨基酸;Vl基因327bp,编码108个氨基酸;Vh与Vl之间为(Gly_4Ser)_315个氨基酸连接肽。

肿瘤细胞中端粒酶催化亚基hTERT基因启动子结合因子的检测

为了研究端粒酶催化亚基hTERT基因在癌变细胞中组成型表达的调控机制 ,采用凝胶阻滞电泳 (EMSA)实验方法检测人粒系白血病细胞HL 6 0、人红系白血病细胞K5 6 2、人肺癌细胞A5 4 9、人肝癌细胞HepG2及正常人肺成纤维细胞 2BS等体外传代的肿瘤和正常二倍体细胞核提取物中与hTERT启动子核心序列结合的核因子活性。结果在 4种实验肿瘤细胞中均可检测出与hTERT基因启动子结合的核因子活性 ,而正常二倍体细胞中则不存在这种活性的核因子。实验结果提示hTERT基因启动子结合因子可能是细胞癌变过程出现的特殊基因表达调控因子 ,与端粒酶在各种肿瘤细胞中广泛重新激活有关 ,有必要进一步分离鉴定这些肿瘤特异性的转录因子 。

细胞因子在类风湿关节炎发病机制中的作用

机体的免疫细胞和非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽类因子统称为细胞因子。随着对类风湿关节炎(RA)的病因及发病机制的深入研究,发现细胞因子在RA发病过程中起重要作用。简要综述了细胞因子在RA发病中的促炎、抗炎作用,及细胞因子间的相互作用。

端粒酶逆转录酶基因hTERT突变表达载体在膀胱癌细胞T24中的表达

目的 构建端粒酶逆转录酶基因 (h TERT)缺失突变的真核表达载体 p EGFP- h TERT,并转入膀胱癌细胞株 T2 4中 ,观察其稳定表达 .探讨其对端粒酶活性调控机制及成为膀胱肿瘤基因治疗新靶点的可能性 .方法 将 PCR扩增的h TERT缺失突变体片段用 Eco RI与 Sal I酶切 ,并连接到真核表达载体 p EGFP- C1上 ,构建成 h TERT缺失突变的真核表达载体 p EGFP- h TERT;利用 DNA-磷酸钙共沉淀法将p EGFP- h TERT导入膀胱癌细胞株 T2 4中 ,应用荧光显微镜、与衰老相关的β-半乳糖苷酶染色等方法观察转染细胞中h TERT- GFP融合蛋白定位表达及对膀胱癌细胞生长的影响 .结果 酶切鉴定证实 h TERT缺失突变体已克隆到p EGFP- C1的 Eco RI与 Sal I位点之间 ,在转染细胞中观察到与其融合的绿色荧光蛋白的稳定表达 ,定位于细胞核内 ;转染细胞 2 wk后与衰老相关 β-半乳糖苷酶表达增加 ,细胞生长受抑制 .结论 构建的端粒酶逆转录酶基因 h TERT缺失突变真核表达载体 p EGFP- h TERT可在膀胱癌细胞 T2 4中稳定表达 .突变型 h TERT蛋白可入细胞核中竞争性影响端粒酶的功能 。

广州市远郊九佛农村5岁以下儿童产毒性大肠杆菌(ETEC)腹泻的定点研究

1988年3月—5月在广州远郊九佛农村两个自然对342名不足5岁儿童的ETEC腹泻作定点研究。发生腹泻186人次,估算发病率为1.26次/人/年。检出病原体6种71株,检出率38％(71/186),依次为ETEC45株:轮状病毒和志贺氏菌各11株,气单胞菌2株,沙门氏菌和致病性大肠杆菌(EPEC)各1株。ETEC的三种肠毒素基因探针(热敏肠毒素LT,热稳定肠毒素ST-H和ST-P)的检测结果依次为16.2％(30/186)、3.7％(7/186)、1.7％(3/186),另外,同时具有二种肠毒素(LT+ST)的ETEC有5株占2.6％(5/186)。ETEC的抗药性普遍存在,多抗性尤为严重,最少的抗9种,最多的竟抗20种。LT阴性(LT-)菌的多抗性强度显著大于LT^+菌(P<0.05)。两种菌对痢特灵,呋喃妥因、床大霉素、卡那霉素都高度敏感,对青霉素、万古霉素、杆菌肽、新生菌素、麦迪霉索具有较强抗性。ETEC中存在7种耐药模式,其中3种为ETEC模式,4种志贺氏模式,这在国内未见报道,对深入研究志贺氏菌的耐药机理有实际意义。

鼠抗人纤维蛋白抗体单链Fv片断的三维结构模建

用Biosym公司开发的计算机辅助分子设计系统模建了鼠抗人纤维蛋白抗体Fv片断的三维结构。Fv是由重链可变区(Vh)和轻链可变区(Vl)两个结构域组成的具有抗原结合能力的最小抗体片断。先分别模建了Vh和Vl两个结构域,然后搭建出Fv片断的整体三维结构,并对模建的结构进行了分子力学和动力学优化。对结构的合理性验证显示模建结构是合理的。本研究为鼠抗人纤维蛋白抗体Fv片断的人源化的分子设计打下了基础。

A组轮状病毒宫内感染的研究

目的：了解Ａ组轮状病毒（ＨＲＶ）宫内感染情况。方法：应用酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）技术检测１４８例新生儿脐血ＨＲＶ特异性ＩｇＭ抗体水平。结果：１４８例脐血中３例阳性，阳性率为２．０３％。结论：ＨＲＶ可能存在胎儿宫内感染。

地高辛标记法检测人源细胞系端粒长度

目的:建立一种灵敏的、非同位素标记的端粒长度检测方法,并用于人源细胞系的肿瘤研究。方法:以地高辛标记寡核苷酸(TTAGGG)3为探针,对基因组DNA进行Southern印迹检测,经CDP-Star显色后与DNA标准分子量比较,利用图像分析系统计算端粒长度。结果:通过严格控制探针的工作浓度(1∶3000稀释)、DNA上样量(1.5～2.5μg)、杂交温度(42±1℃)等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带。结论:建立了一种稳定、可靠、低背景的地高辛标记检测端粒长度的方法;对正常细胞、永生化细胞和肿瘤细胞进行了端粒长度的检测和对比分析。

端粒维持研究进展

端粒是现代生物学的研究热点 ,与肿瘤发生、基因表达调控、衰老有着密切的关系。本综述介绍当前对端粒维持机理研究的进展。在端粒维持过程中有两类重要的蛋白 :端粒相关蛋白和端粒酶。端粒相关蛋白是直接或间接与端粒结合的蛋白 ,在维持端粒稳定性方面有重要作用。端粒酶 ,特别是其催化亚基hTERT ,在端粒延长过程中起着不可替代的作用 ,与细胞永生化和癌变密切相关。此外还介绍了在某些细胞中存在的不依赖端粒酶的端粒延长机制 。

人端粒保护蛋白hPot1的一种新选择性剪接体的克隆及鉴定

hPot1是端粒单链结合蛋白,在维持染色体末端的稳定性中发挥着重要作用。从前列腺癌细胞C4-2中提取总RNA,以反转录得到的cDNA为模板,扩增全长的hPot1cDNA,发现hPot1基因的一种新的剪接形式。这种新的剪接形式缺失了野生型hPot1基因的第2个外显子,并且造成了读码框架的改变,使翻译提前终止,表达出一段有45个氨基酸残基的短肽。进一步检测表明,这一hPot1mRNA新剪接体广泛存在于多种组织来源的细胞中,提示这一剪接形式可能是细胞调控hPot1功能的一种调节机制。

穿膜肽-LacI HPM载体的构建及其DNA结合活性测定

目的:借助穿膜肽TAT高效跨膜的特性和LacI前头肽突变体(LacI HPM)高亲和力结合DNA的特性,构建新型基因转导载体。方法:PCR扩增LacI、LacI基因前头肽序列、前头肽序列突变体、TAT序列的编码基因,构建前头肽序列突变体和TAT的原核表达载体,可溶性表达TAT-LacI HPM融合蛋白并纯化,在缓冲液中氧化获得TATLacI HPM二聚体并浓缩,PCR检测二聚体融合蛋白与质粒的体外结合能力。结果:获得了pET-28a(+)-LacI HPM及pET-28a(+)-TAT-LacI HPM表达质粒,表达纯化并获得二聚化融合蛋白,体外结合实验确定TAT-LacI HPM二聚体融合蛋白与检测质粒DNA具有特异的高亲和力结合活性。结论:构建了穿膜肽TAT-LacI HPM,为进一步研究其作为新型DNA转运载体的可行性奠定了基础。

端粒及端粒酶的研究进展

端粒是真核细胞染色体末端的特有结构,是由端粒结合蛋白和一段重复序列的端粒DNA组成的一个高度精密的复合体,在维持染色体末端稳定性,避免染色体被核酸酶降解等方面起着重要的作用。端粒的长度、结构及组织形式受多种端粒结合因子的调控。由于端粒的重要性,在哺乳动物细胞里,端粒的长度或端粒结构变化与癌症发生及细胞衰老有密切的关系。由于末端复制问题的存在,随着细胞分裂次数的增加,端粒不断缩短,细胞不可避免的走向衰老或凋亡。由于在细胞分裂过程中端粒长度的不断缩短与细胞分裂代数增加具有相关性,即端粒长度反应了细胞的分裂次数,因此有人将端粒形象的比喻为生物时钟。在90%的癌细胞中,端粒酶被重新激活,以此来维持端粒的长度,使细胞走向永生化。简要综述了端粒、端粒酶及端粒酶结合蛋白的最新研究进展。

核糖核酸酶A在端粒免疫荧光原位杂交实验中的应用

目的:在端粒免疫荧光原位杂交实验中,降低核仁着色对端粒图像清晰度的影响。方法:分别将0.1、0.2、0.4 mg/m L的核糖核酸酶(RNase)A与待检标本于37℃消化过夜,然后进行端粒原位杂交实验。结果:0.4 mg/m L RNase A可以消除Hep G2细胞端粒原位杂交时的非特异结合,使用He La、293T和U2OS细胞也有同样效果。结论:在进行端粒原位杂交实验时,用0.4 mg/m L RNase A消化核仁可减少探针的非特异结合,提高端粒图像的清晰度。

端粒酶调控机制的研究进展

端粒酶在细胞中的主要生物学功能是通过其逆转录酶活性复制和延长端粒DNA来稳定染色体端粒DNA的长度。近年有关端粒酶与肿瘤关系的研究进展表明,在肿瘤细胞中端粒酶还参与了对肿瘤细胞的凋亡和基因组稳定的调控过程。与端粒酶的多重生物学活性相对应,肿瘤细胞中也存在复杂的端粒酶调控网络。通过蛋白质-蛋白质相互作用在翻译后水平对端粒酶活性及功能进行调控,则是目前研究端粒酶调控机制的热点之一。

不同型Gsα基因缺失体在大肠杆菌中的克隆与表达

在人类的一些肿瘤中已发现存在Gsα基因突变。本研究室在白血病细胞系的研究中发现了Gsα基因的 3个缺失突变体以及野生型的Gsα(分别命名为GsαL 1,5 0 0bp ;GsαL 2 ,30 0bp ;GsαL 3,2 0 0bp和Gsα 4 ,12 0 0bp) ,并已在一些急性白血病患者中检测到。为进一步研究这些缺失体的结构、功能和生物学意义 ,作者将克隆了GsαL 1,GsαL 2和Gsα 4基因的质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中 ,提取DNA ,采用特异引物进行PCR扩增 ,获得相应的目的基因 ,分别将其克隆到 pET2 2b(+ )表达载体上 ,再转化大肠杆菌进行表达。经培养 ,取菌体行SDS PAGE电泳分析。研究结果 :3个基因都有相应分子量的蛋白表达 ,且均以包涵体形式存在。这表明构建的这 3个基因确具完整的基因结构 ,及相应的蛋白表达。

轮状病毒围产期传播防制研究

众所周知,妇女在怀孕期间,容易遭受病毒感染如风疹、巨细胞病毒等。近年来发现轮状病毒(Human rota rirus简称HRV)是引起婴幼儿腹泻的重要病原,为进一步观察孕妇是否引起宫内感染,以及孕妇HRV感染与产道污染及新生儿感染和周围环境污染的关系。藉以探索其传播途径。

利用酵母双杂交技术筛选与hPOT1相互作用的新蛋白

目的:利用酵母双杂交系统筛选与人POT1(human protection of telomeres 1,hPOT1)相互作用的蛋白。方法:以hPOT1的300～634氨基酸片段为诱饵,在人乳腺cDNA文库中筛选能与hPOT1相互作用的蛋白质;运用营养缺陷型培养基和X-α-Gal实验排除假阳性,并对阳性克隆进行序列测定和比对。结果:经过酵母双杂交筛选,发现7个与hPOT1相互作用的蛋白;选取NM23B与hPOT1通过GST-pull down和免疫共沉淀进行进一步的验证,结果证明它们确实存在相互作用。结论:hPOT1能与NM23B发生相互作用,在此实验基础上可以进一步研究NM23B与hPOT1相互作用的生物学意义。

t-PA K1区的同源模建及Kringle区与赖氨酸相互作用的研究

利用同源模建方法预测了t-PAK1区的三维结构。通过结构叠合确定了t-PAK1、K2区,纤溶酶原K1、K4区及UKK区的赖氨酸结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明,在t-PAK2区以及纤溶酶原K1、K4区与纤维蛋白裸露的赖氨酸之间存在明显的静电势互补和疏水面契合。确定了影响Kringle区结合口袋与赖氨酸亲和的重要氨基酸,分析了t-PAK1区、UKK区不能结合赖氨酸的原因,由此设计了具有赖氨酸亲和力的新型t-PAK1区及UKK区突变体。利用模拟残基突变技术预测了突变体的结构变化,分析了突变后t-PAK1区及UKK区与赖氨酸亲和力的变化,初步在理论上肯定了设计方案的合理性。