硒盐预防原发性肝癌前瞻观察六年

本文报道江苏省启东肝癌高发人群吃硒盐预防原发性肝癌前瞻研究。通过观察六年,吃硒盐的居民血硒明显升高。肝癌发病率逐年下降,1984年52.84/10万,1990年降为34.49/10万。对照组居民肝癌发病率仍维持较高水平,提示补硒可以预防肝癌。1987年启东病毒性肝炎暴发流行,但硒盐乡居民肝炎发病率明显较对照组低(P<0.01)。可见补硒既可防癌,又可防肝炎。硒盐生产工艺简单,经济方便,可在低硒或缺硒地区推广应用。

热休克蛋白70对突变型p53稳定性的影响

目的:探讨热休克蛋白70(heatshockprotein70HSP70)对突变型p53(mutanttypep53mtp53)稳定性的影响。方法将反义HSP70真核表达重组质粒pXAHSP70脂质体介导转染至MCF7/Adr人乳腺癌细胞,PCR确定转染细胞中外源DNA存在,Westernblot检测HSP70蛋白的抑制程度,p53稳定性实验分析反义HSP70RNA对mtp53半衰期的改变。结果:转染重组质粒的MCF7/Adr细胞中HSP70蛋白表达下降42%,其胞内mtp53含量下降,半衰期缩短了6h,稳定性下降。结论:反义HSP70RNA能够明显地降低mtp53稳定性,提示肿瘤细胞中HSP70高表达可增强mtp53的稳定性。

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶2α过表达通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制肝癌细胞株BEL7402增殖

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)家族参与调节生长因子和激素的信号转导.为了研究SGK家族成员SGK2α在细胞中的功能,构建了真核表达质粒pEGFP-N1-SGK2α并瞬时转染HEK293细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白SGK2α-GFP主要定位于细胞浆,免疫共沉淀实验发现SGK2α与糖原合成激酶3β(GSK3β)存在相互作用.利用PCDNA6-V5-HisB-SGK2α质粒转染肝癌BEL7402细胞,建立稳定表达SGK2α蛋白的细胞系,通过细胞增殖实验发现,SGK2α的过表达使BEL7402细胞生长速度减慢、细胞倍增时间延长.裸鼠成瘤实验发现,与对照组细胞相比表达SGK2α的BEL7402细胞在裸鼠中的成瘤能力明显降低.免疫印迹实验证实,SGK2α的过表达不影响GSK3β的表达,但却使β-catenin和Cyclin D1的表达下调.提示影响Wnt/β-catenin信号通路关键分子的表达可能是外源性SGK2α蛋白过表达抑制BEL7402细胞增殖的分子机制.

PI3K p55γ调节亚单位N末端24个氨基酸抑制胃癌细胞增殖

目的 p55γ是磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)的调节亚单位之一,在调节PI3K活性上具有重要的作用,本研究旨在观察p55γN末端24个氨基酸对胃癌细胞增殖的影响。方法 用脂质体介导将表达质粒pEGFPC1和pEGFPC24转染MGC 803细胞,通过荧光显微镜鉴定转染基因的蛋白表达;MTT法观察转染细胞的生长情况;软琼脂集落形成实验确定单个细胞的增殖力;最后用流式细胞仪分析细胞周期时相的变化。结果 (1)建立了稳定表达GFP和GFP N24的MGC 803细胞系,分别命名为C1/803和C24/803。(2)与对照组C1/803相比,C24/803细胞生长速度减慢,其在软琼脂中集落形成率下降了86.8%。(3)C1/803和C24/803细胞周期G0 /G1期百分率分别为52.5%和59.5%,两者相比差异有显著性(P<0.05)。结论 p55γN末端24个氨基酸能够抑制胃癌细胞的生长和增殖,引起细胞周期G1 /S期延长,提示N24p55γ可能成为治疗胃癌的潜在的分子药物。

温热化疗对胃、结肠癌细胞的体外作用研究

背景与目的:术中腹腔内温热灌注化疗尚缺乏有力的基础研究依据,所设参数不统一,使研究缺乏可比性。本研究探讨温热化疗对胃、结肠癌细胞的体外作用,系统探讨温热化疗的影响因素。方法:MTS-PMS比色法检测不同药物、处理温度和时间对人胃癌细胞MGC-803和结肠癌细胞HCT-116增殖抑制作用;显微镜观察温热化疗对细胞形态的影响。结果:氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)、丝裂霉素(mitomycin,MMC)、顺铂(cisplatin,DDP)和吡柔比星(pirarubicin,THP)对MGC-803和HCT-116细胞的杀伤作用,均具有较强的温度依赖关系,其作用在41℃～45℃温度区间内随温度升高而加强,45℃时,对MGC-803细胞的抑制率分别达到61.7%、79.2%、88.7%、94.7%,对HCT-116细胞的抑制率分别达到76.4%、78.7%、77.8%、91.7%,与不加药组相比,差异具有显著性(P<0.01)。THP在各个温度点的杀伤作用均高于其它3种常用温热化疗药物(P<0.01)。药物对HCT-116细胞的杀伤作用具有时间依赖关系,随处理时间的延长,药物杀伤作用增强;其中,43℃时药物作用在90min后逐渐进入平台期,此时4种药物的抑制率分别达到58.2%、72.8%、76.2%、92.3%。5-FU、MMC、DDP45℃作用45min强于43℃作用90min。THP在确定温度的各个时点的杀伤作用均强于其它受试药物(P<0.01)。显微镜观察表明,单纯温热和温热化疗协同均有一定的细胞杀伤作用,而热化疗组出现大量的死亡细胞。结论:DDP、MMC在43℃～45℃条件下具有较好的肿瘤杀伤效果,考虑到临床的实际条件,处理时间以60min为宜。与5-FU、DDP、MMC相比,THP对胃、结肠癌细胞具有更好的温热协同效应和肿瘤杀伤效果,具有进一步临床研究的价值。

反义HSP70对人乳腺癌细胞的抑瘤效应

目的：观察反义热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）RNA对人乳腺癌细胞的生物学特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法：将逆转录病毒真核表达载体介导的反义HSP70重组质粒pX-AHSP70和空载体pLXSN-neo转染至MCF7/Adr人乳腺癌细胞，通过细胞生长曲线和软琼脂集落实验以及裸鼠移植瘤实验观察转染反义HSP70重组质粒细胞的体内外抑瘤作用。结果：建立了稳定表达反义HSP70 RNA的MAp70细胞，与空载体细胞相比，HSP70蛋白的表达下降了48％。细胞群体生长速度明显减慢，软琼脂集落形成率和抑制率分别为6.08％和62.14％，裸鼠皮下接种的平均出瘤时间为15天，最终平均瘤重为108 mg，以上参数与空载体细胞相比，均有显著差异。结论：反义HSP70 RNA能够有效地抑制HSP70表达，进而抑制乳腺癌细胞的体外增殖和体内移植瘤的形成与发展。

PI3K-Akt信号通路与肿瘤

磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)信号参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节．近年来发现,IA型PI3K和其下游分子蛋白激酶B(PKB或Akt)所组成的信号通路与人类肿瘤的发生发展密切相关．该通路调节肿瘤细胞的增殖和存活,其活性异常不仅能导致细胞恶性转化,而且与肿瘤细胞的迁移、黏附、肿瘤血管生成以及细胞外基质的降解等相关,目前以PI3K-Akt信号通路关键分子为靶点的肿瘤治疗策略正在发展中．

PI3K p55PIK调节亚单位N末端抑制胃癌细胞株MGC803生长及其机制

背景与目的:p55PIK是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)的调节亚单位之一。p55PIK依赖于其N末端独特的24个氨基酸结合Rb,这24个氨基酸的表达能抑制细胞周期的进程。本研究目的在于观察p55PIKN末端24个氨基酸的表达对胃癌细胞增殖和生长的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:通过Lipofectamine介导,用pEGFP-N24表达质粒转染MGC803细胞,用Westernblot鉴定融合蛋白GFP-N24在MGC803细胞中的瞬时表达;MTT法检测转染细胞的生长情况;克隆形成实验观察N24p55PIK过表达对细胞克隆形成能力的影响;动物实验观察表达N24p55PIK的细胞在裸鼠体内的成瘤能力;Westernblot法分析N24p55PIK表达对细胞周期蛋白CyclinD1表达的影响。结果:N24p55PIK在MGC803细胞中能够有效表达,但其表达量明显低于对照组。与对照组细胞相比,N24p55PIK的表达使细胞生长速度减慢,细胞倍增时间明显延长;表达N24p55PIK的细胞在克隆形成的数量上与对照组相比差异无显著性,但在克隆体积上明显小于对照组。表达N24p55PIK的MGC803细胞在裸鼠中的成瘤能力有所下降,其所形成肿瘤的重量和体积分别为(0.398±0.244)g和(408±268)mm3,而空载体对照组分别为(0.763±0.193)g和(829±271)mm3,两组相比差异有显著性(P<0.05)。N24p55PIK在MGC803细胞中的表达抑制CyclinD1的表达。结论:p55PIK调节亚单位N末端24个氨基酸的表达在体外和体内均能抑制肿瘤细胞的生长;减少CyclinD1的表达可能是其发挥作用的主要机制;来源于PI3K调节亚单位p55PIK的N24肽在肿瘤的治疗上可能具有潜在的应用前景。

热休克蛋白在喉癌中的表达

目的探讨热休克蛋白（ｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＨＳＰｓ）在喉癌组织及其正常喉粘膜中的表达。方法采用狭缝杂交（Ｓｌｏｔｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ）技术对２１例喉癌组织及其正常喉粘膜的ＨＳＰ９０、ＨＳＰ７０和ＨＳＰ２７ｍＲＮＡ表达水平进行检测。结果①ＨＳＰ９０α和ＨＳＰ７０在喉癌组织中呈过度表达，表达量是自身正常喉粘膜的５倍以上。②ＨＳＰ２７和ＨＳＰ９０β在喉癌组织及正常喉粘膜中呈低水平表达，其表达量在两种组织中差异无显著性。结论ＨＳＰ７０和ＨＳＰ９０α在喉癌的致病过程中起着重要的作用。弄清它们的作用机理，将为ＨＳＰｓ用于喉癌的生物治疗提供理论依据。

热休克蛋白gp96抗肿瘤免疫的研究进展

热休克蛋白 (HSP) gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质。它具有分子伴侣功能 ,能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响。gp96 肽复合物也可在体外形成 ,并具有与体内相似的免疫活性。gp96参与MHCⅠ类抗原的提呈。用肿瘤源gp96 肽复合物免疫小鼠可诱发抗相应肿瘤细胞的MHCⅠ类限制性CD8+ 细胞毒性T细胞免疫应答 ,并能产生记忆性T细胞应答 ,具备了作为疫苗的一个关键要素 ,为肿瘤免疫治疗开辟了一个新的途径。

ILK、Hsp90相互作用及在胃癌中表达的研究

目的:探讨ILK与H sp90在胃癌组织中的相互作用,了解它们及相关因子E-cadherin与胃癌临床病理的关系,以及胃癌患者血清中手术前后ILK与H sp90含量的变化。方法:用免疫共沉淀,蛋白杂交的方法研究ILK与H sp90的直接相互作用,用免疫组织化学方法测定ILK,H sp90,E-cadherin和M M P2在胃癌及癌旁组织表达,比较它们与胃癌临床病理的关系,使用Elisa方法,测定ILK与H sp90在胃癌患者血清中手术前后含量的变化。结果:用ILK抗体免疫沉淀下来的蛋白中检测有H sp90蛋白存在。ILK在40例胃癌组织中有28例表达阳性,阳性率为70%,而H sp90则在37例有高表达,阳性率为92.5%。其中28例ILK阳性者中有27位H sp90表达阳性。高分化胃癌分别有50%和75%表达,而低分化者为75%和100%。E-cadherin在正常胃粘膜上皮细胞均为阳性表达,而只有40%的胃癌组织呈阳性。其中高分化者有75%阳性表达,而低分化者仅为32.1%,没有转移的为90%,有转移的仅是23.3%。M M P2在癌组织中的表达阳性率为75%,高于癌旁正常组织,高分化者有50%阳性表达,而低分化者为78.6%,没有转移的为50%,有转移的是83.3%。用Elisa方法测定血清中ILK,H sp90抗体的含量。结果表明,手术前ILK、H sp90的含量分别为171.0ng/m l和199.0ng/m l,而手术后分别下降为142.6ng/m l和161.

热休克蛋白90α(HSP90α)在大肠杆菌中的表达

目的 :探讨热休克蛋白 90α的生物学功能 ,获得高质量及充足的HSP90α蛋白。方法 :采用PCR的方法扩增HSP90αcDNA5’端 42 4bp片段 ,在起始密码子位置制造一个NcoI酶切位点 ,将PCR产物克隆到中间载体 ,再通过合适的酶切位点将其余片段连接到此载体 ,形成一个带有NcoI突变位点的HSP90αcDNA全长克隆。最终将HSP90α全部编码cDNA插入到pET 16b表达载体中。结果 :经诱导表达 ,SDS PAGE凝胶电泳分离显示在分子量大约 83kD处有一诱导蛋白带。WesternBlot证明表达产物与抗HSP90α抗血清有特异的免疫反应。结论 :构建成了T7启动子控制下的HSP90α表达质粒。

热休克蛋白70与肿瘤

热休克蛋白 70 (HSP70 )是一组重要应激蛋白。在肿瘤细胞中表达异常 ,能与癌基因、抑癌基因产物结合 ,并与肿瘤细胞的细胞周期调控、增殖、凋亡、分化、多药耐药、肿瘤免疫以及肿瘤细胞的发生发展密切相关。

反义HSC70与mtP53和肿瘤耐药关系的探讨

目的 观察反义HSC 70RNA对MCF7/Adr人乳腺癌细胞耐药性影响 ,探讨其与突变型p5 3稳定性和肿瘤耐药间的关系。方法 利用DNA重组技术将人HSC70cDNA片段反向克隆至真核表达载体pLXSN中 ,构建反义人HSC70真核表达质粒pX AHSC70。用脂质体方法将重组质粒转染至MCF7/Adr人乳腺癌细胞内 ,以PCR确定转染细胞中外源DNA存在后 ,Westernblot检测HSC70蛋白的抑制程度。MTT法检测细胞耐药性的影响。p5 3稳定性实验分析反义HSC70RNA对突变型p5 3半衰期的改变。结果 经G418筛选获得稳定表达反义HSC70RNA的细胞株MAc70 ,与空载体MAX细胞相比 ,HSC70蛋白表达下降 42 % ,细胞耐药性显著下降。p5 3稳定性实验表明 ,其胞内突变型p5 3含量下降 ,半衰期缩短 ,稳定性明显下降。结论 反义HSC70RNA能够明显降低HSC70蛋白表达 ,导致乳腺癌细胞的耐药性下降 ,提示HSC70可能通过增强突变型p5 3稳定性的途径而参与MCF7/Adr乳腺癌细胞的耐药。

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的该研究通过SGK2α基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础。方法利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性。结果构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性。结论利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究。

硒预防病毒性肝炎的实验研究

1.硒盐对人群肝炎的预防试验:供应硒盐乡与周围乡居民对比观察肝炎发病率的变化,试验结果1986、1987、1988年硒盐乡居民肝炎发病率明显低于周围对照乡(p0.001)且对乙型肝炎发生亦有抑制作用。45万人群扩大预防试验,进一步验证吃硒盐乡居民甲型乙型肝炎发病率明显较对照乡低。硒盐预防肝炎,即使停吃硒盐,预防肝炎的作用尚可维持一年。 2.硒盐可行性试验证明无毒,对肝肾功能均无影响。资料表明,百万人群吃硒盐10年亦无毒副作用。剂量易于控制,可在低硒或缺硒地区大规模推广应用。

硒预防病毒性肝炎的流行病学研究

病毒性肝炎是世界上危害人类生命健康较为严重的常见传染病。我国是肝炎发病率较高的国家,仅乙型肝炎患者就有2700万人,乙型肝炎表面抗原携带者约有一亿人。江苏省启东县是肝炎流行地区,甲型肝炎每隔4～5年暴发流行一次,乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带者为15％左右。严重地影响人们的工作、学习和生命。启东的流行病学调查结果表明,肝癌及乙型肝炎与硒关系较为密切。1980年我们对启东县永阳乡与西宁乡进行流行病学调查,发现永阳乡居民主粮硒含量较西宁乡低,而居民中乙型肝炎表面抗原阳性率及肝癌发生率均比西宁乡高,提示硒摄取量和肝炎、肝癌发生有一定关系。

铜绿假单胞菌制剂胃癌细胞抑制作用研究

目的探讨铜绿假单胞菌制剂对胃腺癌高转移MKN45细胞的作用及作用机制。方法用流式细胞仪、软琼脂集落形成实验、细胞侵袭实验分别检测铜绿假单胞菌制剂对胃腺癌MKN45细胞的作用,并分析其作用机制。结论铜绿假单胞菌制剂可抑制MKN45细胞的增殖,阻滞其G1期到S期的演进;并且可明显抑制该细胞的侵袭转移能力;降低其恶性程度,是腹腔免疫化疗胃癌腹水、腹腔脱落癌细胞及腹腔种植转移的较好选择。

以双质粒逆病毒载体系统快速建立梯度过表达hMTA1稳转单克隆细胞系的方法

目的利用逆病毒表达载体快速构建梯度过表达人MTA1稳转单克隆细胞系。方法利用噬菌斑原位杂交筛选人肺噬菌体文库,以阳性克隆为模板,RT-PCR获得人MTA1完整CDS序列。以逆病毒表达载体pMX为基础,经过多次酶切连接,构建逆病毒表达载体pMX-MTA1-flag-IRES-EGFP。将构建好的逆病毒载体系统,转染293-gag/pol细胞,包装出含该表达载体的逆病毒颗粒。以含病毒上清多次感染HCT116细胞,获得稳定转染MTA1的HCT116多克隆细胞系。将该多克隆细胞系按合适比例稀释后接种至10cm大皿,获得大量单克隆细胞系,以GFP为筛选标志,筛选不同荧光强度的单细胞克隆进行扩增并分析MTA1与GFP表达水平的线性关系。结果测序结果显示成功克隆出人MTA1表达序列。免疫荧光、Western Blot结果证实成功构建出梯度过表达MTA1的稳转细胞系。相关性验证结果显示构建的非融合载体MTA1与GFP的表达呈明显的线性相关,相关系数r=0.932,P<0.01。结论利用逆病毒表达系统,快速成功构建并筛选出MTA1与GFP非融合梯度过表达稳转单克隆细胞系,为MTA1基因功能研究提供了良好模型。该逆转录病毒平台可用于快速建立其他基因的稳转单克隆细胞系。

整合蛋白连接激酶:抗肿瘤药物作用的新靶点

整合蛋白连接激酶 (integrin linkedkinase ,ILK)是一个Ser/Thr蛋白激酶。它能介导细胞与胞外基质的相互作用 ,并通过下游底物蛋白激酶B和糖原合成酶激酶 3将胞外信号向下游传递。从而增强细胞的侵袭能力、促进细胞周期循环的进行并抑制细胞凋亡。一些蛋白磷酸酶如PTEN和ILKAP能够对ILK的活性或其信号传导途径进行抑制 ,一些小分子的ILK拮抗剂也能抑制ILK的活性。抑制ILK可使细胞恶性度和成瘤能力下降 ,导致细胞凋亡和G1到S期细胞周期循环的停滞。这些结果显示 ,抑制ILK的活性将对某些肿瘤的治疗有着非常重要的意义。近来一些研究显示 ,某些非甾体类抗炎药。