应用双色FISH技术检测肝癌中HER-2的定量扩增及其临床意义

为探讨原发性肝细胞癌（ＨＣＣ）中原癌基因ＨＥＲ－２的扩增激活情况及其与临床病理特征 和预后的关系，应用双色荧光原位杂交（ｄｕａｌ ＦＩＳＨ）技术检测４２例原发性肝癌间期细胞核中 ＨＥＲ－２的扩增和１７号染色体的数目及其比值，并用统计学分析 ＨＥＲ－２的扩增与临床病理特征 及预后的相关性。结果在４２例肝癌中有９例ＨＥＲ－２扩增（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ），占２１．４％，其中高拷 贝扩增（ＨＣ）有４例（９．５％），低拷贝扩增（ＬＣ）有５例（１１．９％），ＨＥＲ－２的扩增与性别、年龄、ＡＦＰ 水平、ＨＢＶ感染、术后复发及临床分期无关（Ｐ＞０．０５），而与术后２年生存期相关（Ｐ＝０．０４６） 且ＨＥＲ－２扩增病人的肿瘤有比无扩增病人的肿瘤增大的倾向（Ｐ＝０．０８５）；同时，在４２例肝癌 中有３１例为ＨＥＲ－２拷贝数增加（ｇａｉｎ），占７３．８％，其中９例（２１．４％）为扩增所致，２２例（５２．４％） 为１７号染色体多倍体或异倍体（ｐｏｌｙｓｏｍｙ １７／ａｎｅｕｓｏｍｙ １７）所致，ＨＥＲ－２拷贝数增加与性别、 临床分期、肿瘤大小、术后复发及术后２年生存期无关（Ｐ＞０．０５），但与年龄、ＡＦＰ水平和ＨＢＶ 感染有关（Ｐ＜０．

PVP和PKP治疗骨质疏松性胸腰椎体压缩骨折的疗效比较

目的对比经皮椎体成形术(PVP)和经皮椎体后凸成形术(PKP)治疗骨质疏松性椎体压缩性骨折(OVCF)的疗效。方法选取OVCF患者111例,根据手术的方式不同分为PVP组和PKP组,其中PVP组56例,PKP组55例,比较两组患者手术前后的VAS评分、楔形角改善情况以及不同椎体压缩程度。结果两组患者手术前的VAS评分及楔形角汇报比较差异均无统计学意义(P>0.05),术后VAS评分两组比较差异无统计学意义(P>0.05),但PKP组患者的楔形角明显低于PVP组,差异具有统计学意义(P<0.05);两组患者根据不同压缩程度分类后,A级和B级VAS评分以及楔形角的改善两组之间的差异均无统计学意义(P>0.05),两组C级患者间的VAS评分差异无统计学意义(P>0.05),C级患者的楔形角改善情况,PKP组明显优于PVP组,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 PVP和PKP两种手术方式均能改善患者的骨折疼痛感以及VAS评分等指标,但是对于改善重度的骨质疏松性胸椎体压缩骨折患者,PKP明显要优于PVP。

闭合复位髓内钉内固定与中药热敷结合治疗股骨干骨折疗效观察

目的:观察闭合复位髓内钉内固定与中药热敷结合对股骨干骨折的治疗疗效。方法:采用回顾性研究的方法分析本院采用闭合复位髓内钉固定治疗的56例股骨干骨折患者的资料,根据治疗方法不同分为单纯闭合复位髓内钉内固定组及闭合复位髓内钉内固定结合中药热敷组,比较分析两组的疗效、住院时间、骨折愈合情况及近期并发症等。结果:观察组骨折愈合时间显著对于对照组,有统计学差异(P<0.05)。观察组治疗优良率(85.7%)显著高于对照组(67.8%),有统计学差异(P<0.05)。结论:闭合复位髓内钉固定结合中药热敷能够显著促进骨折术后血液循环,促进骨折愈合,是一种治疗股骨干骨折较好的方法。

一种基于人miR-30结构高效干扰LMP1基因表达的慢病毒载体的构建

目的:构建慢病毒载体并利用miRNA原理进行LMP1病毒癌基因干扰的可行性及有效性研究。方法:基于人miR-30a结构,利用靶点分析软件设计4个LMP1的候选干扰靶点,报告基因EGFP与miRLMP1靶点形成共顺反子表达,靶点载体质粒与LMP1高表达质粒用脂质体共转染工具细胞293FT,用Western blot方法筛选最有效的干扰靶点并用三质粒系统在293FT细胞中包装慢病毒,进行滴度鉴定。结果:在293FT工具细胞中成功筛选到一个高效干扰LMP1基因的靶点序列,在Western blot水平的蛋白干扰率高达95%;在20ml培养上清中可获得具有活性慢病毒颗粒7.2×108个,经纯化浓缩获得重组慢病毒颗粒,滴度高达6×109TU/ml,经流式细胞仪检测在80MOI时其感染EBV阳性的鼻咽癌细胞株C666-1的感染率高达80%以上。结论:基于人miR-30a结构的miR-LMP1能高效干扰LMP1基因的蛋白表达,利用慢病毒载体来建立稳定基因干扰肿瘤细胞株可能是一个良好的方法。

肿瘤中1号染色体短臂的分子细胞遗传学

肿瘤的发生有其分子细胞遗传学基础 ,染色体结构异常的区域往往是肿瘤相关基因所在位点。 1号染色体的短臂末端 (1p36 )集中了高密度的与细胞生长、增殖、分化相关的基因 ,同时目前发现在许多肿瘤中其 1p36发生缺失 ,因而成为目前肿瘤分子细胞遗传学研究的热点。本文就有关 1p36上的肿瘤相关基因和研究方法以及近几年在神经母细胞瘤、结肠癌。

鼻咽癌染色体16q22-24遗传不稳定性的研究

目的：研究鼻咽癌染色体１６ｑ２２－２４的遗传稳定性。方法：用染色体１６ｑ２２－２４上的８对微卫星多态性标记分析 ５０例鼻咽癌的杂合性缺失（ｌｏｓｓ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙ， ＬＯＨ）与微卫星不稳定性 （ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ＭＳＩ）。结果：至少一个位点发生ＬＯＨ的肿瘤占４８％（２４／５０），ＭＳＩ的发生率为１８％（９／５０）。但这些变化均散在分布，未见高频共同缺失区和微卫星不稳定区；其变化在早期（Ⅰ／Ⅱ期）和晚期（Ⅲ／Ⅳ期）病人之间有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。结论：染色体１６ｑ２２－２４区的遗传不稳定性的变化可能与鼻咽癌的发病有关，该区是否存在鼻咽癌相关基因有待进一步探讨。

和解汤对慢性乙型肝炎T细胞受体Vβ7基因表达的影响

目的:探讨和解汤对慢性乙型肝炎（简称慢乙肝）临床疗效与T细胞受体Vβ7（TCRVβ7）基因表达特征的相关性。方法:将慢乙肝患者45例随机分为两组,治疗组（30例）采用和解汤治疗,对照组（15例）采用常规西药治疗,观察治疗后TCRVβ7,基因表达变化。结果:经过6个月治疗,两组ALT水平均显著下降（P<0.01）,治疗组5例测出TCRVβ7,基因表达,并均出现HBV-DNA、HBeAg阴转;对照组无一例测出TCRVβ7基因表达,无一例出现HBV-DNA、HBeAg阴转。HBV-DNA、HBeAg未阴转的患者,虽肝功能恢复正常,但无一例测出TCRVβ7基因表达。两组总有效率比较差异无显著性,但两组显效率比较差异有显著性（P<0.01）。结论:和解汤对TCRVβ7基因表达有调节作用,可能是抑制病毒复制、清除病毒的重要途径。

原发性肝癌p53基因高频缺失的双色荧光原位杂交证据

目的 :探讨原发性肝癌 (HCC)中p5 3基因的缺失频率、方式、特点及其临床意义。方法 :以p5 3基因及 17号染色体着丝粒DNA为探针 ,应用间期双色荧光原位杂交 (interphasedual,FISH)技术。结果 :肝癌中p5 3基因的缺失频率为 68 0 % (68/ 10 0 ) ,而配对正常肝组织中则未见有p5 3缺失 ;p5 3缺失方式多样且往往伴随 17号染色体多倍体 (r=0 5 94,P <0 0 1) ;p5 3缺失与肝癌病人的性别、年龄、HBV感染及临床分期无显著相关 (P >0 0 5 ) ,但与血清甲胎蛋白 (AFP)水平、肿瘤大小则显著相关 (P <0 0 5 ) ;有无p5 3缺失病人之间 2年存活率差异非常显著 (χ2 =11 463 ,P <0 0 1)。结论 :p5 3基因在原发性肝癌中存在高频缺失并往往伴随 17号染色体的多倍体 ;双色FISH技术为评估基因的缺失提供了特异、敏感、直观的分子细胞遗传学证据。

化湿中药对慢性乙型肝炎湿证患者激活和功能T淋巴细胞亚群水平的影响

目的探讨化湿中药对慢性乙型肝炎(chronichepatitisB,CHB)湿证患者临床疗效与激活和功能T淋巴细胞亚群水平变化的关系。方法将CHB湿证患者75例非随机分为两组,治疗组(45例)采用化湿中药治疗,对照组(30例)采用核苷类似物治疗,观察治疗1年后两组临床疗效及激活和功能T淋巴细胞亚群水平变化。结果CHB患者外周血CD8+CD2+8、CD4+CD2+8T细胞水平与健康人比较均明显下降(P<0.01);CD8+CD3+8T细胞水平与健康人比较均明显升高(P<0.05);经治疗后,治疗组CD4+CD2+8、CD8+CD2+8T细胞水平较治疗前明显升高(P<0.05),CD8+CD3+8T细胞水平较治疗前明显下降(P<0.05),对照组CD8+CD3+8T细胞水平较治疗前明显下降(P<0.05)。两组总有效率及显效率相比较,差异无显著性(P>0.05)。CHB显效患者治疗后CD8+CD2+8、CD4+CD2+8T细胞水平明显升高(P<0.05),CD8+CD3+8T细胞水平较治疗前明显下降(P<0.05);非显效患者治疗前后CD8+CD2+8、CD4+CD2+8、CD8+CD3+8、CD4+CD2+5T细胞水平无明显变化(P>0.05)。结论化湿中药对CHB湿证患者激活和功能T淋巴细胞亚群水平有一定的调节作用,这可能是抑制病毒复制、清除病毒的重要途径。

用高密度cDNA微阵列技术检测鼻咽癌差异表达基因

背景与目的:鼻咽癌的发生与发展涉及多个步骤、多个因素的参与,对此目前尚缺乏了解。本研究试图通过大规模检测鼻咽癌的基因差异表达来揭示鼻咽癌的差异表达基因谱,以发现与鼻咽癌发生、发展相关的新的候选基因。方法:用由18000个基因构建的高密度cDNA微阵列对21例鼻咽癌分3个样本池分别检测并与鼻咽非癌组织作对比分析,随机选2个基因用半定量RT-PCR验证检测结果。结果:3个样本池鼻咽癌差异表达基因分别为186个、95个和36个,总数达317个,表达上调的277个,表达下调的40个;差异表达基因中2个样本池以上有共同差异表达的基因有23个,表达上调的16个,表达下调的7个;其中3个样本池表达均有差异者6个,5个上调、1个下调,5个上调的基因中2个是已知基因,3个是未知基因,1个下调的是未知基因。结论:本研究揭示了鼻咽癌的基因表达谱,为了解鼻咽癌发生、发展的分子机理提供了大量信息,为寻找鼻咽癌相关基因提供了重要线索。

化湿中药对慢性乙型肝炎(湿证)患者TCRVβ7基因表达的影响

目的:探讨化湿中药对慢性乙型肝炎(湿证)患者T细胞受体(TCR)Vβ7基因表达的影响。方法:随机选取慢性乙型肝类患者30例为治疗组,观察化湿中药治疗后TCRVβ7基因表达变化,另以健康人10例为对照组。结果:经6个月治疗,治疗组丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血清总胆红素(TBIL)水平显著下降(P<0.01),5例测出TCRVβ7基因表达,这5例患者均出现HBV—DNA、HBeAg阴转,肝功能恢复正常。结论:化湿中药对慢性乙型肝炎(湿证)患者TCRVβ7基因表达有调节作用,可能是清除病毒的重要途径。

小鼠T-bet基因重组腺病毒载体的构建

【目的】构建小鼠T-bet基因重组腺病毒载体,为T-bet基因在支气管哮喘治疗中的作用研究提供有效的T-bet生物表达系统。【方法】采用内切酶从质粒T-bet/GFP-RV中切获约1.7kb的小鼠T-betcDNA片段,与穿梭质粒pShuttle连接,再通过稀有酶切位点将含T-betcDNA的表达盒与Adeno-X腺病毒载体骨架连接,构建重组载体pAdeno-T-bet,测序鉴定无错配及插入移位等DNA顺序改变,并转染HEK293细胞,出现CPE后取含病毒上清的细胞培养液抽提病毒DNA行PCR鉴定。【结果】PCR及酶切证实:T-betcDNA正确克隆到穿梭质粒pShuttle中,带T-betcDNA的表达盒成功重组到腺病毒载体基因组E1A缺失区,并在HEK293细胞中成功包装出具有感染活性的重组腺病毒pAdeno-T-bet。【结论】本实验成功构建了小鼠T-bet基因重组腺病毒载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒。

95例SARS患者细胞免疫功能抑制的特点及其原因

用ELISA方法测定95例SARS患者急性期、恢复期血清细胞因子水平,用流式细胞仪检测该组患者急性期、恢复期淋巴细胞亚群,并分析细胞因子水平和淋巴细胞亚群变化的关系。结果发现,IL-10和TGF-β在观察期(急性期和恢复期)持续升高,急性期CD4+和CD8+T细胞显著减少,恢复期患者外周血CD8+记忆T细胞减少36.78%。IL-10和TGF-β升高与淋巴细胞变化具有统计学相关。结果提示,SARS病毒感染抑制宿主的细胞免疫功能,引起急性期CD4+和CD8+T细胞显著降低和恢复期的免疫记忆细胞减少。而IL-10和TGF-β过表达可能在SARS免疫病理中起重要作用。

MSC-CNTF靶向性治疗变态反应性脑脊髓炎动物对病情和炎症的影响

目的探讨重组腺病毒转导的骨髓间充质细胞(MSC)导向的睫状神经营养因子(CNTF)基因靶向性治疗C57小鼠实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE),对动物病情和和炎症的影响。方法用成功构建的Ad-CNTF-IRES-GFP载体,体外观察Ad-CNTF-IRES-GFP转染MSC(MSC-CNTF)对MSC表达CNTF的影响,再用MOG35-55建立C57BL/6小鼠的EAE模型,将MSC-CNTF移植治疗EAE小鼠,观察EAE动物病情评分;ELISA法观察外周血的促炎症因子TNF-α、IFN-γ,IL-12p35和抗炎症因子IL-10的水平,HE染色观察脑和脊髓炎症细胞浸润,用免疫荧光和免疫组化观察病变部位CD3(+)T细胞、炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ的表达水平。结果(1)MSC-CNTF在MOI等于100的情况下,分泌的CNTF较DIL染色的MSC(MSC-DIL)、或Ad-eGFP转染的MSC(MSC-GFP)增高20倍(P<0.01)。(2)MSC-CNTF治疗的EAE小鼠病情显著减轻。不仅平均发病时间缩短,发病率下降,病情减轻,而且病情严重程度也明显减轻。(2)MSC-CNTF治疗明显减低EAE小鼠外周血TNF-α和IFN-γ水平,明显升高外周血IL-10水平。(3)MSC-CNTF治疗EAE小鼠可明显降低病变部位的炎症细胞数量和炎性细胞因子TNF-α水平,而对IFN-γ表达几乎影响不大。结论MSC-CNTF移植治疗的EAE动物病情明显减轻,其机制是:减低外周血TNF-α和IFN-γ水平,降低病变部位CD3(+)细胞数量和炎性细胞因子TNF-α水平。

EBV-BHRF1基因阳性与阴性细胞株对3种诱导凋亡因素抵抗性差异的研究

目的观察ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因阳性（ＳＵＮＥ┐１、Ｒａｊｉ和Ｂ９５┐８）与阴性（Ｋ５６２、ＹＡＣ）细胞株对３种诱导细胞凋亡（ａｐｏｐ┐ｔｏｓｉｓ）因素（无血清培养４８小时，４３℃作用１０分钟或２×１０－６ｍｏｌ／Ｌ地塞米松作用２４小时）的抵抗力差异。方法ＰＣＲ扩增ＥＢＶ┐ＢＨＲＦ１基因片段诱导后经电镜及电泳ＤＮＡ检测细胞凋亡。结果分别从Ｂ９５┐８、Ｒａｊｉ及人低分化鼻咽癌细胞株（ＳＵＮＥ┐１）ＤＮＡ中扩增出ＥＢ病毒的ＢＨＲＦ１全基因片段，而Ｋ５６２、ＹＡＣ细胞株则不含该基因片段。分别经上述３种方法处理后，前３种细胞株的形态及ＤＮＡ电泳行为未发生明显改变，而后２种细胞株则出现典型的细胞凋亡特征，即细胞核凝缩，细胞膜及细胞器基本保持完整；ＤＮＡ电泳出现梯形（Ｌａｄｄｅｒ）条带。

清热祛湿通络法治疗酒精性脂肪肝疗效观察

目的:探讨清热祛湿通络法治疗酒精性脂肪肝的疗效及机理。方法:53例酒精性脂肪肝随机分为两组,治疗组30例采用清热祛湿通络法治疗,对照组23例采用消炎利胆片治疗,观察临床疗效与IL-8、SOD、MDA及血脂水平变化的关系。结果:经治疗后,治疗组患者外周血IL-8、MDA、TG、CHOL水平均明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05),SOD活性明显上升(P<0.05),对照组患者外周血IL-8、MDA、TG、CHOL水平均明显下降(P<0.05,P<0.01,P<0.05,P<0.05),两组患者肝功能不同程度得到恢复,两组总有效率相比较有显著性差异(P<0.05)。结论:提示清热祛湿通络法是治疗酒精性脂肪肝的有效方法,其机理可能与下调炎症细胞因子IL-8水平、减轻肝脏脂质过氧化反应、改善微循环等有关。

携带SARS-CoV刺突蛋白N端片段重组腺病毒的构建

【目的】构建携带 SARS 冠状病毒刺突蛋白 N 端基因片段的重组腺病毒。【方法】从 SARS 病毒 cDNA 扩增刺突蛋白 N 端基因片段(-45～1469nt,截短的 S1区,S_N),插入腺病毒穿梭质粒 pShuttle,通过体外连接法构建重组腺病毒Ad-S_N。用 Ad-S_N 感染 Vero-E6细胞,通过 RT-PCR 和 Western blot 法检测 S_N 的表达。【结果】克隆的 S_N 基因序列与文献报道基本一致;Ad-S_N 基因组结构与预期一致。在 Ad-S_N 感染的 Vero-E6细胞中存在 S_N 基因的转录和分泌型 S_N 蛋白的表达。【结论】体外连接法是一种简便易行的重组腺病毒载体构建方法;重组腺病毒 Ad-S_N 能正确表达分泌型 S_N 蛋白,可用于诱导抗 SARS 免疫的动物实验研究。

肝癌组织中P73蛋白表达的意义

【目的】检测肝癌组织中P73蛋白表达 ,了解P73在肝癌中的意义。【方法】采用LSAB免疫组织化学方法检测 5 8例原发性肝癌组织中P73α、β蛋白表达 ,并与相应的癌旁肝组织、远癌正常肝组织进行比较。同时用LSAB法检测P5 3和PCNA ,探讨P73蛋白与这两者间的关系。【结果】①P73蛋白在正常肝组织、癌旁肝组织和肝癌组织中的表达比例分别为 97% ,88%和 2 6 % ;②缺失P73蛋白的肝癌细胞PC NA高增殖指数的比例高于P73蛋白表达阳性组 ,前者 79% ,后者 2 7% ;③缺失P73蛋白的肝癌病例在P5 3蛋白阳性组和阴性组中的比例分别为 79%和 6 8% ,二者间无统计学差异。但是在P5 3阳性的病例中 ,伴有P73蛋白缺失时PCNA高增殖指数的比例高于P73蛋白无缺失组 ,前者 80 % ,后者 2 9%。【结论】P73蛋白在正常肝细胞、癌旁肝细胞和肝癌细胞中的表达呈递减趋势 ,缺失P73蛋白的肝癌细胞生长快 ,P73在肝癌中可能起着抑癌基因的作用。P73的缺失与P5 3的异常表达无关系 ,但是在P5 3异常表达的情况下 ,如果存在P73蛋白时可能对细胞有一定的调控作用 ,抑制细胞增殖 ,起补偿作用。

和解汤对慢性乙型肝炎TCRVβ_7基因表达的影响

目的:探讨和解汤对慢乙肝临床疗效与TCRVβ_7基因表达特征的相关性。方法:将慢乙肝患者45例随机分为两组,治疗组(30例)采用和解汤治疗,对照组(15例)采用常规西药治疗,观察治疗后TCRVβ_7基因表达变化。结果:经过6个月治疗,两组ALT水平均显著下降(P<O.01),治疗组5例测出TCRVβ_7基因表达,并均出现HBV-DNA、HBeAg阴转;对照组无一例测出TCRVβ_7基因表达,无一例出现HBV-DNA、HBeAg阴转。HBV-DNA、HBeAg未阴转的患者,虽肝功能恢复正常,无一例测出TCRVβ_7基因表达。两组总有效率相比较无显著性差异(P>0.05),但两组显效率相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:和解汤对TCRVβ_7基因表达有调节作用,可能是抑制病毒复制、清除病毒的重要途径。