高表达基因工程α-乙酰乳酸脱羧酶的研制和应用

啤酒发酵分为两个阶段:主发酵和后熟发酵.主发酵阶段绝大部分酵母代谢产生的挥发性和非挥发性风味物质已经形成,后熟发酵主要是要达到以下三个目的:一是CO2饱和;二是不溶性物质的析出和胶体稳定性的改善;三是风味的改善.目前,对第一。

生物质能源开发战略的新思维

中国政府计划在21世纪前半叶，力争三个15年的时间．实现能源可持续发展的目标，具体而言，到2020年（第一个15年）实现能源消费翻一番，支撑经济增长翻两番的目标。一次能源需求争取控制在30亿吨标准煤左右（2010年在21亿吨标准煤左右），煤炭消费比例控制在60％以下。主要污染物的消减率为35％-40％。

纤维素酶产生菌的筛选及产酶条件

以褐色高温单孢菌 (Thermomonosporafusca)为出发菌株 ,通过 6 0s和 80s的紫外线交替诱变孢子悬液 ,采用透明圈法初筛和摇瓶培养复筛的方法 ,获得了一株高产纤维素酶的突变株PE_2 11.与原始菌株相比 ,该突变株的产酶活力提高了 1倍多 .文中还对PE_2 11的产酶条件进行了研究 .

广西银杉林主要树种种群生态位分析

以广西银杉林不同生境的样地作为不同资源的综合体(资源位),以各物种的重要值作为资源位上的状态指标,定量分析银杉林各主要树种种群的生态位宽度、生态位相似性比例和生态位重叠。结果表明:1)银杉、变色杜鹃、华南五针松、五列木、绣球茜草具有较大的重要值和较宽的生态位宽度值,占据群落中的重要资源,在所调查的生境中具有更强适应能力,在银杉林中具有重要的地位。而含笑、大头茶、小花桤叶树等种群数量相对较少,分布范围较窄,生态位宽度较小,对资源的利用能力比较弱。2)银杉林中各种物种之间的相似性比例值多数较大,多数物种间的生态学特性较相似或他们利用资源的相似性程度较大。生态位宽度大的物种和其他物种间的生态位相似性比例值大,生态位宽度小的物种与其他物种间的生态位相似性比例值较小。3)银杉林中各主要树种间的生态位重叠值较低,各主要树种之间的相互竞争不高。生态位宽度大的物种具有较大生态位重叠值,与其他物种利用或占有同一资源的概率大;生态位宽度小的物种具有的生态位重叠值较小,与其他物种的占有或利用同一资源的概率小。4)银杉在各个样方中都占据较大重要值,具有较大的生态位宽度值,是银杉林的优势种和群落的建群种。

用RAPD标记研究蚱属五个种间的亲缘关系

用RAPD技术对蚱属 5种蚱基因组DNA的多态性进行研究。在事先优化的反应条件下用 12个随机引物扩增 ,共得到84条清晰稳定的多态性片段 ,片段长度为 2 0 0～ 2 0 0 0bp。统计这些片段 ,根据扩增片段的共享度计算出相对遗传距离指数 ,然后用UPGMA和NJ聚类方法对其进行分析 ,构建系统树 。

单宁酶基因在黑曲霉ST31中的克隆与表达

利用PCR扩增得到米曲霉(Aspergillus oryzae)单宁酶(tannase)基因的编码序列,经DNA测序证实单宁酶基因已成功克隆,然后将其连接到黑曲霉的表达载体ANED2-SP2上构建单宁酶基因表达载体.将构建好的单宁酶基因表达载体通过原生质转化法导入黑曲霉菌株ST31中进行表达研究.结果表明重组菌株的单宁酶活力最高为104.02 U/ml发酵液,比原始出发菌株米曲霉提高2～3倍.研究构建了黑曲霉的高效转化体系,提高了黑曲霉表达系统的应用水平,为其它新酶的研究提供有价值的参考.

乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

与其它微生物相比,用大肠杆菌进行发酵生产乳酸有许多优势,但大肠杆菌没有L乳酸脱氢酶基因,不能利用糖发酵生产L乳酸.本文采用PCR技术,以乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)基因组DNA为模板,克隆得到L乳酸脱氢酶(Llactatedehydrogenase)基因,将该基因的ORF连接到表达质粒pET22b(+),获得重组质粒pETldhL.将pETldhL质粒转化大肠杆菌BL21株,实现了ldhL基因的表达;对含有ldhL基因的重组菌株进行表达研究,在30℃以IPTG诱导8h后,SDSPAGE分析可见明显特异性条带,酶活力达到6.49u/mL,是野生菌酶活力(2.82u/mL)的2.3倍.对重组表达的L乳酸脱氢酶生物学特性研究显示,它们的最适反应温度为27～30℃,最适反应pH为5.0～5.3.

合成耐高温α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

PFA是来源于Pyrococcus furious的一种耐高温α-淀粉酶,为了使PFA能够在巴斯德毕赤酵母中高效表达,根据巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性对PFA的基因序列进行密码子优化,人工合成耐高温淀粉酶PFA基因pfa,并连接到巴斯德毕赤酵母中表达载体pPIC9K上,得到重组质粒pPIC9K-pfa。重组质粒线性化后转化到巴斯德毕赤酵母菌株GS115中,重组菌株在摇瓶中用甲醇诱导表达,分泌表达酶活最高为220 U／L。

高糖土壤微生物宏基因组文库的构建及β-葡萄糖苷酶基因鉴定

采用宏基因组技术构建了高糖土壤微生物的DNA文库，该文库约含9万个克隆，文库外源DNA总容量为3．1×10%^9bp。利用活性筛选策略，对文库进行筛选，获得11个β-葡萄糖苷酶的阳性克隆，并对其中2个表达β-葡萄糖苷酶的克隆进行亚克隆和序列分析，获得两个编码新型B一葡萄糖苷酶的基因分别命名为：Mn6印引和Mn6印3日。生物信息学分析表明：“unbgl3A基因由2241个碱基对组成，unbgl3B基因由2292个碱基对组成。在核苷酸水平上，unbgt3A、unbgl3B与已知数据库中的β-葡萄糖苷酶基因没有任何相似性。在氨基酸水平上，与GenBank数据库中已知β-葡萄糖苷酶的相似性分别为73％~1169％。

木薯淀粉发酵生产L-乳酸的培养条件优化

通过单因素实验方法和Plackett-Burman实验方法,对木薯淀粉发酵生产L-乳酸的培养条件及培养基主要因子进行了优化和筛选。实验结果表明:鼠李糖乳杆菌发酵木薯淀粉生产L-乳酸的种龄为12h,培养基氮源为酵母粉,MgSO4·7H2O含量为0.4%,MnSO4含量为0.01%,CaCO3含量为7%,接种量为6%;木薯淀粉发酵乳酸的最适温度为37℃,最适pH值为6.3;通过Plackett-Burman实验,从酵母粉、MgSO4·7H2O、MnSO4、CaCO3、接种量、Tween-80、K2HPO4、乙酸钠、柠檬酸二铵等9个因素中筛选出了对L-乳酸产量具有明显影响的因素为:酵母粉、K2HPO4和MgSO·47H2O,并得到了L-乳酸产量为响应值的线性回归方程。

高产生物丁醇新菌株的筛选、鉴定及发酵研究

丁醇是具有巨大应用潜力的可再生能源。为了获得高效生产丁醇的菌株,通过玉米培养基富集、丁醇耐受筛选的方法,从自然环境(牛粪、沼气池和土壤)来源的60份样品中分离获得1株丁醇发酵比率高的新菌株,菌株命名为gxzp-13-2。经梯度浓度葡萄糖发酵试验表明,5%葡萄糖发酵丁醇产量较高,最高可达10.05 g/L,总溶剂达到13.95 g/L,丁醇比约为72.1%,转化率为31.8%。对此菌株进行了分子鉴定,经16S rDNA基因序列同源性分析表明,gxzp-13-2与拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的同源性最高,相似性高达98%。gxzp-13-2在厌氧固体培养基上生长,菌落呈紫色。该菌株为下一步的菌种基因改造工作提供了研究基础,也为丁醇发酵提供了宝贵的菌种资源。

三株甘蔗糖蜜酒精发酵高产酵母菌株的筛选

从甘蔗糖厂的废弃物中筛选到3株甘蔗糖蜜酒精发酵高产菌株MF1001、MF1002和MF1003,经rDNAITS序列同源比对鉴定为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的不同菌株。3个菌株均可以完全利用葡萄糖和蔗糖,部分利用棉子糖和半乳糖,均不能利用乳糖和木糖。MF1001发酵甘蔗糖蜜的残糖含量明显低于目前使用的生产菌株,略低于标准测定菌株CICC31149和CICC31279,MF1002和MF1003的残糖含量略低于目前使用的生产菌株。与生产菌株相比,3个菌株在甘蔗糖蜜的生长速率略低,但是维持高菌数的时间较长。按目前甘蔗糖蜜酒精生产的发酵工艺,3个菌株30℃发酵72h的醪液酒精含量分别为14.26%（V/V）、14.48%（V/V）和13.50%（V/V）,比目前生产使用的菌株高19.5%-28.6%;37℃发酵40h的醪液酒精含量分别为12.03%（V/V）、12.06%（V/V）和12.14%（V/V）,比目前生产使用的菌株高10.0%~11.7%。这3个菌株具有提高甘蔗糖蜜发酵醪液酒精含量的潜在工业价值。

运动发酵单胞菌丙酮酸脱羧酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

以总DNA为模板,采用PCR技术克隆得到运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase)基因pdc,将该基因连接到表达载体pSE380上,得到重组质粒pSE-pdc.将此重组质粒转化到受体菌E.coliDH5α中,挑取重组菌株.经IPTG诱导后,在乙醛指示平板检测到丙酮酸脱羧酶活性.SDS-PAGE电泳结果显示出明显的特异性蛋白质条带:其分子量约为60KD.

利用葡萄糖、木糖生产燃料酒精的基因工程菌构建

以运动发酵单胞菌的总DNA为模板,PCR扩增Zym om onas m obilis中的乙醇脱氢酶基因(adhB)和丙酮酸脱羧酶基因(p d c)。首先进行单个基因表达,基因表达产物经SDS-PAGE电泳分析和乙醛指示平板检测,确认有酶活性后,将这2个基因串联构建多顺反子表达质粒pSE-p d c-adhB,转入大肠杆菌DH 5α内,得重组工程菌株。工程菌株经IPTG诱导,分别在含10%葡萄糖和10%木糖培养基中于37℃培养72 h,有乙醇产生,酒精产率分别为对照菌株21倍和5倍。

微生物发酵L-乳酸的研究进展

介绍了发酵法生产L-乳酸的天然微生物,对经典和理性育种方法进行了阐述,并探讨了其发展前景。

高密度培养基因工程大肠杆菌生产α-乙酰乳酸脱羧酶

在 30 0 0 L 发酵罐中 ,利用分批补料培养技术高密度培养含分泌型重组质粒 p ETGAU- 10的大肠杆菌TG1,生产α-乙酰乳酸脱羧酶。通过控制发酵条件 ,发酵液的细胞密度 (OD60 0 )可达 30 .5 ,且胞外α-乙酰乳酸脱羧酶活力最高达 890 U .ml- 1 ,达到较为理想的工业化生产的要求。

克雷伯氏菌甘油脱水酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达

利用PCR技术从克雷伯氏菌 (KlebsiellapneumoniaeATCC4 9790 )总DNA中扩增得到甘油脱水酶 (glyceroldehydratase ,DHAB)基因的DNA片段 ,并将其连接到表达质粒 pSE380 ,携带有重组质粒 pSE dhaB的大肠杆菌JM 1 0 9实现了dhaB基因的表达 ;对含有dhaB工程菌进行表达研究 ,表明工程菌在 37℃ ,以 1 .0mmol LIPTG诱导 5h酶活力即达到 1 1 6 4.1 4U L ,比野生菌酶活力 (1 6 8.6 9U L)提高了 6 .9倍。

海洋细菌Bacillus pumilus PLM4产抗肿瘤多糖的发酵条件优化研究

从广西北部湾红树林海洋淤泥中筛选到的海洋细菌Bacillus pumilus PLM4具有产生抗肿瘤多糖的能力。通过单因素试验找到了该海洋细菌产生抗肿瘤多糖的最佳发酵碳源、氮源，分别为可溶性淀粉和牛肉膏，最佳发酵pH和海盐用量分别为pH7．0和6％～10％。通过正交试验XCB．pumilus PLM4产生抗肿瘤多糖的发酵条件进行了优化，其最佳发酵条件为：可溶性淀粉3．0％，牛肉膏1．5％，海盐6．0％，pH7．0，30℃下发酵5d。