人二倍体细胞株HLF-02的建立及其生物学特性

目的 :建立HLF 0 2细胞株 ,为老年学 ,肿瘤学 ,病毒学 ,药物学和生物遗传学等研究提供新的实验材料。方法 :人二倍体细胞株HLF 0 2取于肺组织 ,用胰蛋白酶消化肺组织 ,可获 90 %以上具有正常代谢活性的肺细胞 ,对存活的肺成纤维细胞进行形态学观察、生长特性检查、核型分析、电镜观察和异种移植等。结果 :建成的HLF 0 2细胞株其形态表现、电镜观察、核型分析和异种移植等均符合二倍体细胞特征。经过 10个月的体外培养 ,共传 5 0代 ,细胞倍增时间 75 .5h ,染色体始终保持二倍体特性 ,异种移植成瘤试验阴性 ,无支原体污染。结论 :HLF 0 2是一株人二倍体细胞株 ,可用于对细胞老年学 ,肿瘤学 ,病毒学 ,药物学和生物遗传学等方面的研究。

人子宫平滑肌细胞体外培养

目的分离培养人子宫平滑肌细胞,为研究人子宫平滑肌细胞生理和病理等方面提供了一个十分有用的实验模型。方法采用胶原酶消化法培养人子宫平滑肌细胞,可获得95%以上具有正常代谢活性的平滑肌细胞,对存活的子宫平滑肌细胞经倒置显微镜观察和免疫组化染色对其进行鉴别。结果平滑肌细胞接种4h后开始贴壁,6～7d汇合成片,所培养的细胞在倒置显微镜下呈梭形和典型“峰-谷”样生长,α-Actin免疫组化染色强阳性。结论采用本法体外培养的人子宫平滑肌细胞生长良好,纯度高,可用于人子宫平滑肌细胞生理和病理等方面的研究。

人结肠癌耐药细胞系SW480/ADM的建立及其生物学特性

目的 建立人结肠癌SW4 8 0耐阿霉素细胞系 (SW4 8 0 /ADM) ,研究其耐药机制及逆转。方法 应用人结肠癌细胞系SW4 8 0,以递增阿霉素 (ADM)浓度的方法,体外连续培养建成一株SW4 8 0 /ADM。观察该细胞生长规律。用MTT比色法检测该耐药细胞系的多药耐药性;以流式细胞术检测该耐药细胞的细胞周期分布、细胞表面多药耐药基因 (MDR)的表达产物P-糖蛋白 (P gp) 、多药耐药相关蛋白 (MRP)及谷胱甘肽硫转移系统 (GSH/GST)的表达;用高效液相色谱仪检测耐药细胞内阿霉素含量。结果 SW4 8 0 /ADM细胞与SW4 8 0细胞相比,生长缓慢,倍增时间延长,细胞周期分布发生改变;SW4 8 0 /ADM细胞较SW4 8 0的阿霉素半数抑制浓度 (IC50 )增大 1 3. 2 2倍,并对多种抗癌药物产生耐药性。SW4 8 0 /ADM细胞表面MDR的表达产物P gp,MRP和GSH/GST的表达均较SW4 8 0细胞显著升高 (P< 0. 0 1 )。SW4 8 0 /ADM细胞内阿霉素含量明显低于SW4 8 0细胞。结论 SW4 8 0 /ADM细胞对阿霉素的耐药是获得性的,并呈多药耐药性特征,可用于对人结肠癌耐药、逆转和MDR机制等方面的研究。

人骨髓成骨细胞体外培养

目的 研究人骨髓基质干细胞体外培养及其成骨特性 ,为骨组织工程学研究提供成骨种子细胞。 方法 以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质干细胞培养 ,传代后改用含地塞米松、β -甘油磷酸纳和维生素C的条件培养基进行培养 ,用倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、四环素荧光标记等方法对所培养的细胞进行生物学特性研究。 结果 接种细胞 4d即可传代 ,在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现黑色结节 ,ALP染色阳性 ,结节四环素荧光标记、钙染色阳性 ,Ι型胶原免疫组化染色呈黄褐色。 结论 采用本法在体外培养的人成骨细胞生长良好 ,并具有成骨细胞形态特征和生物学特性 ,可做为临床所需的成骨种子细胞来源 ,为骨组织工程学研究奠定了实验基础。

MTT法体外测定脑胶质细胞瘤对化疗药物的敏感性

目的 探讨运用MTT法测定脑胶质细胞瘤体外对化疗药物的敏感性。 方法 采用改良的MTT法测定5 0例胶质细胞瘤标本对 8种化疗药物的体外敏感性。 结果 5 0例胶质细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性从高到低依次为威猛、二氯乙基亚硝脲、顺铂、长春新碱、环磷酰氨、甲氨喋呤、5 -氟脲嘧啶、阿霉素。 结论 MTT法检测脑胶质细胞瘤细胞对化疗药物的敏感性有助于指导临床选择肿瘤敏感性的化疗药物 ,提高化疗效果 ,具有重要的临床应用价值。

兔骨髓基质细胞培养及其体外成骨能力

目的观察兔骨髓基质细胞在体外的培养条件及其成骨过程,为研制骨组织工程材料选择种子细胞奠定一定实验基础。方法取兔长管骨骨髓为材料进行体外培养,传代后改用条件培养基进行培养,通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色等方法进行检测。结果传代细胞培养3、4d后融合成单层,培养12d细胞形成多层结构,并聚集成多个散在的黑色结节,细胞富含碱性磷酸酶活性,Ⅰ型胶原染色阳性,这与典型成骨细胞的生物学特性相似。结论体外培养的兔骨髓基质细胞具有成骨能力,可作为骨组织工程学研究的种子细胞。

人胚肝细胞分离培养研究

目的 探讨体外优化培养人胚肝细胞的方法。方法 采用胰蛋白酶和聚乙烯吡咯烷酮(pvp) ,胶原酶,胶原酶和pvp消化法分离人胚肝细胞,并比较3种方法对分离人胚肝细胞的效果。结果 运用这三种方法均能成功地培养出原代肝细胞,并能够传代;但胶原酶和pvp消化法分离细胞效果最好,细胞贴壁生长能力强。三种消化方法其细胞存活率从高到低依次为胶原酶和pvp消化法、胶原酶消化法、胰蛋白酶和pvp消化法。结论 人胚肝细胞的分离首选胶原酶和pvp消化法,使用该法在体外培养的人胚肝细胞生长良好,可用于肝细胞移植和生物人工肝等方面的研究。

人骨髓基质细胞冻存技术的初步研究

目的 探索适合于人骨髓基质细胞 - 196℃冷冻保存条件和方法。方法 以人髂骨区骨髓为材料进行体外人骨髓基质细胞培养 ,传代后以不同浓度二甲亚砜 (DMSO)的冻存液及不同的细胞浓度在液氮中保存 ,2个月后复苏接种培养 ,对其存活率、贴壁率和体外成骨能力进行检测。结果 不同DMSO浓度保存细胞复苏后细胞的存活率从高到低依次为 10 %DMSO组、5 %DMSO组、15 %DMSO组、2 0 %DMSO组 ;在条件培养液中 2周形成多层结构 ,并出现细胞结节 ,碱性磷酸酶染色阳性 ;冻存时细胞浓度为每毫升 (5 .0～ 8.0 )× 10 6个细胞组复苏后细胞存活率高于每毫升 (1.0～2 .5 )× 10 6个细胞组。结论 5 % - 10 %DMSO浓度适合于骨髓基质细胞的长期保存 ,高浓度组骨髓基质细胞的冻存效果优于低浓度组。

黄芪-壳聚糖/聚乳酸多孔支架对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:观察黄芪壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸多孔支架复合材料对犬骨髓基质细胞(BMSCs)的黏附、生长及分化的影响,寻找较合适的牙周骨组织工程复合物支架材料。方法:将诱导分化的犬BMSCs分别与黄芪壳聚糖/聚乳酸、壳聚糖/聚乳酸支架体外培养。第5天取材,测定2种材料的吸附率,用扫描电镜观察超微结构,以免疫组织化学检测I型胶原,放射免疫法检测骨钙素的分泌情况。结果:BMSCs与2组材料均能形成良好贴附,黄芪壳聚糖/聚乳酸复合材料上贴附的细胞吸附率、Ⅰ型胶原及骨钙素的分泌量高于壳聚糖/聚乳酸组。结论:黄芪壳聚糖/聚乳酸能促进BMSCs生长、分化及基质分泌,是一应用前景良好的组织工程骨构建复合材料。

体外细胞培养支原体的检测与清除

目的检测及清除细胞培养中支原体的污染。方法应用DNA荧光法及两步PCR法检测支原体,采用BM-Cycline与裸鼠皮下过继联合法去除支原体;结果DNA荧光法、两步PCR法支原体检测率分别为25.0%,40.0%;BM-cycline与裸鼠过继法对支原体的清除率为100.0%;结论上述方法能有效检测和清除细胞培养中支原体的污染。

鼻咽癌相关基因BRD7对鼻咽癌细胞CNE1的影响

为了研究BRD7基因对鼻咽癌细胞CNE1的影响,通过脂质体转染方法,将BRD7基因导入NPC细胞株CNE1细胞中.通过细胞生长曲线发现该基因能够抑制CNE1细胞的生长.为了探讨可能的作用机制,进而采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响,从而研究该基因在CNE1中的地位和作用.通过对过表达BRD7基因后鼻咽癌细胞系CNE1的蛋白质表达谱改变的研究,鉴定出19个差异表达蛋白,这些蛋白质包括:BCCIP(BRCA2andCDKN1A(p21(Waf1/Cip1)),FHL2(fourandahalfLIMdomains2),Chloridechannelregulatoryprotein;Hin-1(high-in-normal-1),WISP-1(connectivetissuegrowthfactorrelatedprotein),SREC-4(scav-engerreceptorexpressedbyendothelialcells-2),folatereceptor.这些差异蛋白涉及到基因表达调控、细胞黏附等众多的事件.从另一个侧面研究了BRD7基因与鼻咽癌的关系,扩展了BRD7基因的研究范围,并进一步充实了该基因做为鼻咽癌候选抑瘤基因的证据.

人DC与黑色素瘤细胞融合疫苗体外诱导特异性抗肿瘤CTL

目的:探讨HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2+的树突状细胞(DC)融合后体外诱导Me-lan-A特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的作用及交叉抗原递呈的能力。方法:用PEG法将黑色素瘤细胞与DC融合,在含GM-CSF的RPMI1640完全培养基条件下继续培养24～48h,然后将融合细胞与Me-lan-A特异性T细胞共同培养,用细胞内细胞素染色法检测其诱导CTL的活性,流式细胞术分析T细胞的活化率。结果:从异体外周血分离的单核细胞在GM-CSF及IL-4条件下培养6d后,未成熟的DC能表达一定的CD80,CD83,CD86,HLA-DR和HLA-ABC等共刺激分子,而经TNF-浕,PGE-2及CD40L诱导成熟的DC,则这些分子的表达进一步上调。融合细胞体外活化Melan-A特异性T细胞的效率为16.72%±4.26%,阴性对照为0.21%±1.84%,阳性对照为28.60%±5.67%。融合细胞活化的CTL能有效地溶解HLA-A2的黑色素瘤细胞。结论:HLA-A2-的黑色素瘤细胞与HLA-A2+阳性的DC融合肿瘤疫苗,能在体外有效地交叉递呈MHC-I限制性肿瘤抗原,并诱导Melan-A特异性的CTL和有效地杀伤黑色素肿瘤细胞。

8株人黑色素瘤细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 :从人黑色素瘤组织建立一系列黑色素瘤细胞系 ,命名为黑色素瘤细胞系 1- 8号 (HME1- 8) ,并研究鉴定其体外细胞生物学与免疫学特性。方法 :取黑色素瘤组织进行组织块培养法 ,待长满 90 %汇合面后消化传代培养 ,并进行形态学、生长动力学、免疫学及致瘤性等生物学特性研究。结果 :该系列黑色素瘤细胞系已在体外培养生存 1- 2年 ,传 6 0 - 10 0余代 ,其生物学特性显示 :①这些细胞系体外生长的倍增时间为 34. 2 - 5 9. 5h ;②软琼脂集落形成率平均值在 8. 6 % - 2 6 . 2 %之间 ;③接种至裸鼠后具有较高的致瘤性 ;④染色体核型分析为非整倍体 ,众数为 6 4 - 117条 ;⑤透射电镜下可观察到细胞含丰富的核糖体及黑色素颗粒 ;⑥免疫组化分析显示细胞浆内含大量阳性棕色黑色素颗粒 ;⑦肿瘤抗原检测显示 8株黑色素瘤细胞系的Melan -A抗原阳性率为 75 % ,MAGE - 1阳性率为5 0 % ,MAGE - 2阳性率为 37 .5 % ,MAGE - 3阳性率为 6 2 .5 %。结论 :8株黑色素瘤细胞系经体外长期培养后已永生化 ,形成了连续传代细胞系 ,具有明显的黑色素瘤细胞恶性表型特征。

Caspase-9在氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡中的作用

目的 检测氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase 9的活化及caspase 9活性变化 ,以确定caspase 9在氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡中的作用。方法 用氟尿嘧啶处理HepG 2细胞 ,分别作用 2 ,4,8,16,2 4h ,用荧光检测试剂盒检测HepG2细胞凋亡过程中caspase 9的活性变化 ;Western blot分析caspase 9的活化 ;流式细胞仪检测加入caspase 9抑制剂后细胞凋亡百分率的变化。结果 氟尿嘧啶处理肝癌细胞 4h后caspase 9活性开始升高 ,于 16h达到高峰 ,与对照组比较差异有显著性 (P<0 .0 1)。Western blot分析发现caspase 9被蛋白酶水解切断后形成的 10kD片段 ;使用caspase 9抑制剂后 ,肝癌细胞凋亡百分率明显下降 ,抑制剂组与氟尿嘧啶组比较 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 )结论 在氟尿嘧啶诱导肝癌细胞凋亡过程中caspase 9被活化 ,活性明显增强 ,caspase 9抑制剂可阻断这一过程。结果表明caspase 9参与了氟尿嘧啶诱导的肝癌细胞凋亡。

^(99)Tc^m-MIBI在癌组织中的摄取与跨膜电位或肺耐药蛋白相关性

目的探讨99TcmMIBI检测肺腺癌A549DDP细胞的耐药性的机制。方法用MTT法检测顺铂对敏感A549细胞的IC50及有或无顺铂再处理后的A549DDP细胞的IC50。将上述细胞注入裸鼠皮下建立模型后,用99TcmMIBI进行SPECT显像,以免疫组化方法检测移植瘤细胞的LRP蛋白表达,流式细胞仪检测癌细胞的跨膜电位。结果顺铂对A549细胞、A549DDP细胞的IC50分别为24、325、182μM。A549裸鼠99TcmMIBI显像可见瘤块放射性浓聚影,A549DDP裸鼠亦可见瘤块的放射性浓聚影,其放射性浓度较前者明显减淡(P<0.05)。A549移植瘤细胞LRP蛋白呈阴性,无顺铂再处理的A549DDP移植瘤细胞LRP蛋白表达呈阳性,顺铂再处理的A549DDP移植瘤细胞LRP蛋白表达呈强阳性,三者间有显著性差异(P<0.01)。各组细胞的LRP蛋白的表达与99TcmMIBI摄取值呈弱的负相关(r=-0.59,P<0.05)。三种细胞跨膜电位有显著性差异,跨膜电位与99TcmMIBI摄取值呈较强的负相关(r=-0.71,P=0.005)。结论99TcmMIBI检测肺腺癌耐药的A549DDP细胞的耐药性与细胞的跨膜电位关系密切,能在某种程度上反映肺癌LRP蛋白的表达。

HPLC法测定肝炎灵注射液中苦参碱的含量

目的 建立肝炎灵注射液中苦参碱含量的HPLC测定方法。方法 采用μBondapak^(TM)NH_2柱(4.6 mm×300mm,5μm),甲醇-水(15:85)为流动相,流速为1.0 mL·min^(-1),检测波长219 nm,柱温为30℃,进样量20μL。结果 在1.0 μg～500.0μg·mL^(-1)范围内苦参碱浓度与峰面积呈良好的线性关系(r=0.9999),平均回收率为98.3～100.9％,RSD<2％。结论 该方法简单,快速,重复性好。

黑色素瘤细胞系HME1的建立及其生物学特性分析

目的 :建立一株黑色素瘤细胞系 ,并分析其体外生物学特性。方法 :取黑色素瘤活检组织进行组织块法原代培养 ,待长满 90 %后 ,消化传代培养并进行生长动力学、形态学及致瘤性等生物学特性鉴定。结果 :该细胞系已在体外培养生存 1 8个多月 ,传 90余代。其生物学特性如下 :该细胞系接种至裸鼠后可致瘤 ,其移植瘤细胞形态与原实体瘤相似 ;检测第 2 0代细胞生长曲线 ,其倍增时间为 5 6 .9h ;第 2 0代细胞软琼脂集落形成率平均为 1 9.1 % ;染色体核型分析为非整倍体 ,众数为 92条 ;透射电镜下可观察到细胞表面有丰富的微绒毛、核糖体及黑色素颗粒 ;SP免疫组化分析显示 ,细胞有HMB 4 5表达。结论 :该黑色素瘤细胞经体外培养后已永生化 ,形成了连续传代细胞系 。

不孕症药物诱导排卵的B超监测（附215例分析）

女性不孕症在排除了其它因素确认为排卵障碍性不孕时，常用药物诱导排卵进行治疗。我院在１９８８～１９９４应用此法治疗Ｂ超监测的２１５例中排卵成功者１８９例，占８７．９％；卵泡发育不良或闭锁者２６例，占１２．１％；卵泡过激综合征１１例，占６％；成功受孕者３７例，１７．２％；其中多胎妊娠６例，占成功受孕者的１６％。结果表明，Ｂ超监测排卵是一种可靠，安全，准确性高的方法。