企鹅珍珠贝热休克蛋白70基因的克隆与序列比较分析

采用同源克隆和锚定PCR技术,从企鹅珍珠贝Pteria penguin中克隆到热休克蛋白hsp70基因的cDNA全序列。cDNA全长2 308 bp,3’非编码区域(UTR)为234 bp,5’UTR为118 bp,开放阅读框(ORF)为1 956 bp,编码651个氨基酸,分子量为70.97 kd,理论等电点为5.24,有2个糖基化位点:NKSI和NVSA,并含有HSP70家族的3个签名序列:IDLGTTYS,DLGGGTFD和IVLVGGSTRIPKIQK,以及C末端的保守序列EE-VD。结合BLAST分析的结果,可以确认获得的cDNA序列为企鹅珍珠贝HSP70的编码序列。与合浦珠母贝Pinctada fucata hsp70的氨基酸序列相比,企鹅珍珠贝多1个糖基化位点NVSA,少1个氨基酸,包括1个氨基酸插入和2个缺失。两者的氨基酸序列一致性高达92%,突变位点52个;两者的核苷酸序列一致性高达79%,突变位点416个。系统发育分析表明两者的亲缘关系最近,与传统分类相符,然后与太平洋牡蛎等聚合在一起。该基因的克隆和比较分析为进一步深入研究珍珠贝类的抗逆机理、抗性育种及其进化具有重要意义。

合浦珠母贝热休克蛋白hsp70基因的克隆与表达分析

采用同源克隆和RT-PCR技术对合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白hsp70基因进行了克隆和表达分析。获得cDNA全长序列2 365 bp,其中3’非编码区域(UTR)为318 bp,5’UTR为88 bp,开放阅读框(ORF)为1 959 bp,编码652个氨基酸,分子量约为71.39 kD,理论等电点为5.22,并含有3个HSP70家族的签名序列IDLGTTYS、DLGGGTFD和EEVD。同源性分析表明,合浦珠母贝HSP70的氨基酸序列与太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)等双壳贝类的相似性高达86%以上,基于氨基酸序列的聚类分析表明,合浦珠母贝与牡蛎属种类亲缘关系最近。高温、高盐刺激后,半定量RT-PCR检测发现hsp70基因的表达明显增加,高温刺激的表达量高于高盐刺激,高温刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、消化腺、外套膜、肌肉、性腺,高盐刺激组不同组织的表达量由大到小依次为鳃、外套膜、肌肉、消化腺、性腺,表明HSP70参与了机体对刺激的应答过程。该基因的克隆为进一步深入研究合浦珠母贝的抗逆机理及其遗传改良奠定了重要基础。

合浦珠母贝3个养殖群体双列杂交F1代的生长和遗传分析

为开展合浦珠母贝（Pinctada fucata）遗传改良和培育优质新品种,作者利用合浦珠母贝北海养殖群体（B）、徐闻养殖群体（X）和三亚养殖群体（S）进行双列杂交,获得3个种群内自繁群体及6个种群间杂交群体。对8月龄F1代的壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状进行了测定,计算了各组合的一般配合力、特殊配合力及杂种优势。结果表明,杂交组合的各性状值普遍高于自繁群体,其中S（♀）×B（♂）和S（♀）×X（♂）杂交组合的各性状值极显著高于其他组合。三亚群体各性状的一般配合力最大,S（♀）×X（♂）组合各性状特殊配合力最大,其次是S（♀）×B（♂）组合。杂交子一代4个生长指标均表现出一定程度的杂种优势（0.24%~52.62%）。不同杂交组合间和不同性状间的杂种优势存在差异,其中,S（♀）×B（♂）杂交组合杂种优势明显,其反交组合B（♀）×S（♂）杂交优势程度不高,且在壳宽上表现出较低的杂种优势率（0.24%）;S（♀）×X（♂）杂交组合杂种优势率比反交组合X（♀）×S（♂）高。体质量的平均杂种优势率均高于其他3个性状。该研究的结果表明杂交群体性状的改进为进一步选育奠定了基础。

斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因shRNA干扰载体的构建及效果评价

利用Invitrogen公司的在线生物学软件分析斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因,设计针对CP基因不同位置的小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)干扰序列[其结构特征为正链(19 nt)-环(4 nt)-负链(19 nt)]。化学合成这些序列,并退火连接为双链干扰片段,将双链干扰片段定向克隆到干扰载体pENTRTM/U6中,构建shRNA干扰载体pshRNA-124、pshRNA-896和pshRNA-NNV。然后,用脂质体转染法分别将3种shRNA干扰载体和pEGFP-CP基因共转染导入黑头呆鱼(FHM)肌肉细胞,荧光显微镜观察细胞荧光强度,分析荧光抑制效率,Real-time RT-PCR检测CP基因mRNA的表达水平变化。结果表明,在pEGFP-CP与shRNA干扰载体共转染组,pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV的荧光抑制效率分别为47%、68%、51%。3种shRNA干扰载体都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中pshRNA-896干扰效率最好。Real-time RT-PCR检测表明,干扰质粒pshRNA-124、pshRNA-896、pshRNA-NNV对pEGFP-CP基因的沉默效率分别约为60%、96%和55%,与对照组相比差异显著(P<0.05)。研究表明,靶向斜带石斑鱼神经坏死病毒CP基因的shRNA干扰载体构建成功,为进一步运用RNA干扰技术进行CP基因的功能研究奠定了基础。

石斑鱼神经坏死病毒RNA干扰的转染条件优化与效果分析

克隆了石斑鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virus,NNV）的衣壳蛋白（Major capsid protein,MCP）基因序列并构建了绿色荧光蛋白（EGFP）基因与MCP基因的融合真核表达载体pEGFP-MCP,设计了3对针对MCP基因序列的小片段干扰性RNA（Small interfering RNA,siRNA）序列（NNV-001、NNV-002、NNV-003）,开展了转染方法、转染剂量与转染效果的研究,用脂质体转染法将pEGFP-MCP和不同剂量的siRNA共转染导入黑头呆鱼肌肉（FHM）细胞.结果表明,用无血清培养基转染、4-6 h后换液的转染方法,比不换液、只将转染混合物代替同体积培养基的转染方法效率高;当质粒的转染量为50、70、100和150 ng时,100 ng的转染量为最合适;在pEGFP-MCP与siRNA共转染组,3对siRNA序列都有干扰效果,均能干扰绿色荧光蛋白的表达,其中NNV-002效果最好.当siRNA终浓度为200 nmol/L时,显示出了较好的沉默效果.

大豆异黄酮对鱼类免疫增强作用的初步研究

研究副溶血弧菌对斑马鱼的感染模式。试验以注射、创伤、浸泡等3种不同的感染方式分2次进行,每组10尾斑马鱼,结果显示注射感染只在高浓度菌液时有死亡,48h的LC50是5.63×107CFU·mL-1,而创伤感染偶有死亡,浸泡感染则未见死亡,表明注射感染是斑马鱼副溶血弧菌的重要感染模式。同时注射感染结果也显示低水温的死亡率远远低于高水温的死亡率,表明适宜的温度和弧菌的浓度是其致病的关键。并初步探讨了大豆异黄酮作为饲料添加剂的免疫增强作用,各组试验鱼分别投喂黄酮含量为0.5%、1%、2%的饲料,喂养两周后开始注射3.6×109CFU·mL-1的副溶血弧菌悬液,以投喂1%的试验组的抗感染效果较好,表明其对减少养殖病害的发生有一定的好处,为养殖生产提供一种新的免疫增强剂。

口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达

用RT-PCR方法扩增口蹄疫病毒VP1基因,并克隆到pgem-t easy 载体中,通过酶切、PCR和测序验证克隆正确,再亚克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)上,得到重组质粒pcDNA-VP1.根据获得的口蹄疫病毒VP1基因的序列,结合相关的文献资料,设计合成免疫串联片段F,F含有VP1基因的主要抗原位点141位～160位及200位～213位的氨基酸序列,将F片段克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,得到重组质粒pcDNA-F.在脂质体介导下,重组质粒pcDNA-VP1和pcDNA-F转染Vero细胞.间接免疫荧光分析表明VP1基因和F基因均在Vero细胞中成功进行了瞬时表达,为进一步研制FMD基因疫苗奠定了基础.

猪口蹄疫病毒DNA疫苗与常规灭活苗的比较

以含有FMDV VPI基因和VPI基因主要抗原位点141—160及200—213位的氨基酸的真核表达质粒pcDNA-VPI和pcDNA-F与常规O型FMD灭活疫苗分别免疫6—8周龄的BALB／c小鼠和豚鼠，同时设生理盐水为阴性对照，以肌肉注射，间隔2周3次免疫的方式进行．通过脾脏T淋巴细胞增殖（MTT）、T淋巴细胞亚群、中和抗体、抗病毒能力的检测和病理组织学观察等方面比较DNA疫苗与常规灭活苗的免疫效果．结果发现pcDNA-VPI和pcDNA-F能够诱导细胞免疫和体液免疫反应，pcDNA-F可使小鼠和豚鼠产生一定程度的抗FMDV感染的保护性免疫，但与常规灭活苗比较还存在差异．

水产动物转基因研究进展

转基因技术为水产养殖遗传育种开辟了一条新的途径。转基因技术已迅速应用到培育高产、优质和抗逆的水产养殖新品种的研究中,并在解决发育生物学、分子生物学和生理学等方面的难题中发挥了重要作用。目前,水产动物转基因的方法主要是显微注射和精子介导-电脉冲法。涉及对象包括各种鱼类和贝类等。但转基因的定位整合、稳定表达和稳定遗传以及转基因动物的生态安全和食品安全等问题仍是转基因研究有待攻克的重点、难点和热点问题。

RNA干扰机制及其在水产生物中的应用

对RNA i作用机制、siRNA(小片段干扰RNA分子)制备及应用进行了综述。RNA干扰(RNA interference,RNA i)是一种转录后基因沉默(post transcriptional gene silencing,PTGS)现象。内源性或外源性的双链RNA(Double-stranded RNA,dsRNA)导入细胞后引起与其序列同源的特异基因mRNA降解,从而导致转录后基因沉默。因具有特异、高效等优点,RNA i已被广泛用于阻断各种基因的表达,具有广阔的应用前景。

合浦珠母贝遗传连锁图谱的构建

用AFLP标记构建了印度合浦珠母贝(Pinctada fucata)全同胞家系的遗传图谱。用经过筛选的36对引物组合对父母本和62个子代个体进行遗传分析,共得到1 547个标记,包括581个1∶1分离标记。母本分离标记294个,其中178个符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记287个,其中182个符合1∶1孟德尔分离规律。雌性框架图包括33个遗传标记,分布在14个连锁群中,标记间平均间隔24.3 cM,有2个3联体,11个连锁对,图谱总长度为488.5 cM。雄性框架图包括53个遗传标记,分布在19个连锁群中,标记间平均间隔30.5 cM,有4个3联体,10个连锁对,图谱总长度为1 035.5 cM。雌雄两个框架图中AFLP标记的分布都较均匀。雌雄基因组估算长度分别为1 168.4 cM和2 037.1 cM,图谱覆盖率分别为41.8%和50.8%。本研究为进一步构建高密度遗传连锁图谱及QTL定位分析奠定了基础。

合浦珠母贝双列杂交家系的建立与遗传分析

以采自广西北海(B)、广东徐闻(X)、海南三亚(S)的3个不同养殖群体的合浦珠母贝为亲贝,按照完全双列杂交的方式,建立了9个交配组合,每个组合10个家系,共90个家系。出苗经60d养殖后,比较各家系的育种值,并对家系进行综合评价。结果表明:壳长的Kung育种值大于20的家系有8个,分别为BX2(表示北海♂×徐闻♀的2号家系,余依此类推)、BX9、BB4、BB5、BB8、BS9、XS3、SB8,其中XS3的壳长及壳宽的Kung育种值和综合评定值均最大,XX3最小。BB4和XS3的综合评定值大于1。壳长的一般配合力为三亚群体17.40,徐闻17.45,北海18.27;壳高为三亚14.74,徐闻14.79,北海15.54。壳长的特殊配合力为三亚—徐闻17.75,三亚—北海18.27,徐闻—北海18.12;壳高为三亚—徐闻14.98,三亚—北海15.51,徐闻—北海15.46。壳长的平均杂种优势为三亚—徐闻1.41,三亚—北海0.96,徐闻—北海0.67;壳高为三亚—徐闻1.13,三亚—北海1.60,徐闻—北海1.19。表明北海的亲本较好。

添加光合细菌对糙海参幼苗培育阶段的影响研究

以受精后24 h孵化出的糙海参(Holothuria scabra)耳状幼体为研究对象,探讨养殖水体不同量光合细菌对糙海参苗期生长、成活、消化道消化酶活性和养殖水体水质变化的影响。试验设4个处理,光合细菌(浓度为1×1011cfu·m L-1)添加量分别是0 m L(组1,对照组)、50 m L(组2)、100 m L(组3)和150 m L(组4),每个处理设3个重复,每个重复放养4×104尾幼体于室内水泥池(5 m×3 m×1.5 m)中,试验周期为41 d。结果表明,添加光合细菌组的糙海参出苗体质量和成活率均显著高于对照组(P<0.05),而组3和组4的体质量和成活率又明显优于组2(P<0.05),组3和组4之间的差异不显著(P>0.05)。添加光合细菌还能不同程度地影响糙海参苗体消化道蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的活性,试验组3种酶的活性均显著高于对照组(P<0.05),而组3和组4的蛋白酶活性和纤维素酶活性显著高于组2(P<0.05),淀粉酶活性在3个试验组之间无显著差异(P>0.05)。在试验第10天后,各试验组氨氮(NH3-N)和亚硝酸盐含量显著低于对照组(P<0.05),在试验第20天后,各试验组化学需氧量(COD)的值显著低于对照组(P<0.05),而总磷(TP)的差异不大(P>0.05)。表明光合细菌可以促进糙海参幼体的生长,提高消化酶活性和成活率,并改良育苗水体水质。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)不同世代养殖群体的遗传多样性分析

采用微卫星位点对凡纳滨对虾的海南群体(进口亲虾繁育的第1世代:G1)、山东和饶平群体(G2)、湛江2和湛江3群体(G3)、湛江1和上海群体(G4)共4个世代7个养殖群体的遗传多样性进行了分析。从21对微卫星引物中筛选出12对有效扩增引物,对7个群体共280个个体进行扩增,得到10个多态位点,共获得等位基因数63个。各位点的等位基因数在2—15个之间,各群体的平均等位基因数在4.70—5.80之间。平均观测(期望)杂合度在0.36—0.43(0.53—0.65)之间。杂合子偏离指数(D)为负值,表明存在杂合子缺失现象。对7个群体、10个多态位点进行Hardy-Weinberng平衡检测,共有54个偏离平衡。对7个群体间的遗传分化水平进行检测,得到近交系数FIS在9个多态位点均为正值,两两群体间的固定指数FST值在0.149—0.375之间。FST显著性检验表明,各群体之间的遗传分化极显著(P<0.01)。分子方差分析结果显示,大部分遗传变异(72.17%)来自于群体内,来自于群体间的遗传变异(27.83%)较小。凡纳滨对虾不同世代间遗传变异大,随着繁育世代的增加,遗传多样性降低。

基于FIASCO技术的合浦珠母贝微卫星标记分离与筛选研究

用FIASCO(Fast Isolation by AFLP of Sequences Containing Repeats)技术开展了合浦珠母贝Pinctada fucata基因组微卫星标记的分离与筛选研究。合浦珠母贝基因组DNA经限制性内切酶MseI酶切后与接头连接,用生物素标记的(CA)15探针与其杂交,然后用磁珠富集、洗脱获得单链目的片段,经PCR扩增后形成双链,最后进行克隆转化,构建微卫星富集文库。挑选克隆用探针引物(CA)15和载体引物进行第2次筛选,获得阳性克隆357个,测序结果表明,297个克隆(83.2%)含有微卫星序列,包括479个微卫星DNA结构域。其中完美型微卫星有370个(77.3%),非完美型95个(19.8%),复合型14个(2.9%)。合成引物49对,有31对(63%)扩增出目的产物,其中9对在种群中(n=32)具有扩增多态性,其多态信息含量PIC值在0.375―0.809之间,平均为0.536;等位基因数在2―9个之间,平均为4.889个;观测杂合度介于0.200―0.600之间,平均为0.415;期望杂合度的变化范围为0.454―0.844,平均为0.598。表明FIASCO技术适合于合浦珠母贝微卫星标记的分离与筛选。

尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼及其正、反杂交群体的遗传多样性

用7对微卫星引物检测了尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）和奥利亚罗非鱼（O.aureus）群体及其正、反交群体共128个个体的遗传多样性。共检测到38个等位基因,尼罗罗非鱼、奥利亚罗非鱼、正交群体和反交群体的平均等位基因数分别为4.0、1.4、5.3和2.7,平均PIC值分别为0.557、0.099、0.590和0.497,平均观测杂合度分别为0.505、0.071、0.826和0.883,平均期望杂合度分别为0.622、0.117、0.684和0.598,杂合子偏离指数（D）分别为-0.146、-0.241、0.215和0.522。结果表明,正交群体的遗传多样性比两个亲本群体都高,反交群体介于两个亲本群体之间;正交群体的观测杂合度和期望杂合度也高于两亲本群体,反交群体的期望杂合度介于两者之间,但实际观测杂合度却最高;两亲本群体存在一定的杂合子缺失,而杂交群体则存在杂合子增加的现象,尤其是反交群体的观测杂合度大量增加。卡方检验表明,正交群体偏离Hardy-Weinberg平衡的位点较少（3个位点）,而其他3个群体大部分位点均偏离平衡,存在遗传漂变现象。4个养殖群体间遗传分化具有显著性（FST为0.081-0.610,P〈0.01）。UPGMA系统树显示,正交种与尼罗罗非鱼的亲缘关系较近。表明正交群体受亲本群体的影响最大,其生长优势除了性别因素外,遗传因素可能也具有重要作用。

微生态制剂对糙海参生长、消化酶活性及水质的影响

以受精后24 h孵化出的糙海参(Holothuria scabra)耳状幼体为研究对象,探讨养殖水体不同微生态制剂对糙海参苗期生长、存活、消化道消化酶活性和养殖水体水质变化的影响。实验设5个处理组,每隔5 d分别向4个试验组育苗池泼洒乳酸菌(浓度为1×108cfu·mL-1)15g(G1)、芽孢杆菌(总菌数为5×109·g-1)10 g(G2)、光合细菌(浓度为1×1011cfu·mL-1)50 mL(G3)和复合菌(G4,包含光合细菌30 mL、乳酸菌10 g和芽孢杆菌3 g),对照组(C)不添加微生态制剂。实验结果表明:试验组的糙海参出苗体重显著高于对照组(P<0.05),而G1的体重明显大于其余试验组(P<0.05),G3和G4之间的差异不显著(P>0.05);成活率由高到低依次为G4、G3、G2、C、G1,其中G2和C之间差异不显著(P>0.05),其余组之间差异显著(P<0.05)。微生态制剂的添加还能不同程度地影响糙海参苗体消化道的蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活性,G3和G4的蛋白酶和淀粉酶活性显著高于其它组(P<0.05),两组之间差异不显著(P>0.05);G1和G4的纤维素酶活性显著高于其它组(P<0.05),两组之间差异不显著(P>0.05)。各试验组苗池水质的氨氮、亚硝酸盐和COD值分别在实验第10天、20天和30天显著低于对照组,微生态制剂对糙海参苗期养殖池的总磷(TP)影响不大(P>0.05)。研究结果表明,糙海参育苗池中泼洒微生态制剂可以促进幼体的生长,提高消化酶活性和成活率,并有改善育苗水体水质的作用。

合浦珠母贝选育家系的遗传多样性分析

该研究选取具有多态性的6对微卫星引物对构建的2批合浦珠母贝（Pinctada fucata）完全双列杂交家系的遗传多样性进行了分析。6个微卫星标记在9个家系360个个体中共检测到32个等位基因,有效等位基因（Ne）为1.758 7-3.586 5,观测杂合度（Ho）为0.144 4-0.488 9,期望杂合度（He）为0.432 0-0.722 2,Shannon指数（I）为0.691 9-1.507 4。9个家系都有单态位点,平均Ho为0.129 2-0.466 7,平均He为0.155 0-0.439 6,平均I为0.248 5-0.712 2。有19个位点（占35.19%）极显著地偏离Hardy-Weinberg平衡。各家系之间的遗传距离为0.109 0-1.137 2,遗传相似性系数为0.320 7-0.896 8。家系L4B46与L4B48的遗传距离最大,与D3D313的遗传距离最小。UPGMA法聚类分析显示,9个家系分为3支,L4B48单独成一支,B4D426、B4D427与D4B445聚成一支,其余家系聚成一支。该研究结果为合浦珠母贝家系选择育种的亲本选择与交配设计提供了科学依据。

合浦珠母贝对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究

从单胞藻粒径大小、表面结构、生化组成及饵料浓度等角度开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)对不同种类及浓度的单胞藻摄食与消化效果研究。投喂粒径大小相近的牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)和湛江叉鞭金藻(Dicrateria zhanjiangensis)混合藻,粒径大小不同的亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)和海水小球藻(Marine chlorella)混合藻,用细胞计数法检测剩余混合藻中各单胞藻浓度。分别投喂以上4种不同浓度梯度的单胞藻,观察比较粪便中单胞藻消化状况。结果显示,合浦珠母贝对粒径大小相近的单胞藻没有表现出明显的选择性摄食(P>0.05),对粒径较大的单胞藻摄食率明显高于粒径较小的单胞藻(P<0.05);随着投喂单胞藻浓度的升高,合浦珠母贝对单胞藻的消化程度降低。

合浦珠母贝幼贝生长性状的遗传参数估计

以广东徐闻和海南三亚2个地理群体合浦珠母贝（Pinctada fucata）为亲本，采用人工授精方法构建了33个全同胞家系。在162日龄时从每个家系随机抽取50个个体，共1650个，测量其壳长、壳高、壳宽和体质量4个生长性状，利用动物模型对4个性状进行遗传参数分析。结果表明，合浦珠母贝4个生长性状的总平均值分别为（16．284±4．46）mm、（14．854-4．39）mm、（4．584±1．52）mm、（0．66±0．67）g。4个性状的遗传力分别为0．202±0．020、0．2034-0．020、O．200±O．021和0．2044-0．020，均属中等遗传力，因此可以用选择育种进行遗传改良。4个性状间表型相关系数和遗传相关系数的范围分别为0．667～0．698和0．685～0．959，其中壳长、壳高和壳宽之间的遗传相关系数均低于0．7，与表型相关一致，而三者与体重间的遗传相关系数较高（0．868～0．959），其中壳宽与体质量间的遗传相关系数最高（0．959）。本研究中合浦珠母贝的4个性状为中等遗传力，并可通过对壳宽的选育来改良体质量性状。上述结果为进一步开展合浦珠母贝选择育种研究奠定了基础。