尼罗罗非鱼无乳链球菌微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

通过设计筛选引物和探针、优化反应浓度和退火温度,构建一种尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的微滴式数字PCR(dd PCR)检测方法,分析该方法的敏感性、特异性及重复性,并应用于临床样品检测。结果显示:当引物、探针浓度分别为0.9μmol·L^(-1)、0.3μmol·L^(-1)且退火温度为56.9℃时,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR方法阴、阳性微滴分布界限明显,平均拷贝数高,有较高扩增反应效率;线性关系线良好(R^(2)=0.997 3),最低检测限为2.56 copies·μL^(-1);与猪链球菌2型、鱼类海豚链球菌和其他5种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应;重复变异系数为3.15%;临床样品检测结果与实时荧光PCR方法结果的符合率100%,与细菌分离鉴定方法结果符合率为94.12%。结果表明,建立的罗非鱼无乳链球菌dd PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可对罗非鱼无乳链球菌感染的临床样品进行定量检测,为尼罗罗非鱼无乳链球菌的研究提供有益参考。

浅谈初中物理教学的育人功能

物理教学不仅要传授知识,还要发挥育人功能,促进学生全面发展。然而,当前初中物理教学在发挥育人功能方面还存在一些不足,如育人目标不明确、教学方式单一、实践活动缺乏等。文章分析了初中物理教学的育人功能,指出了存在的问题,并从明确育人目标、创新教学模式、加强科学实践、融入信息技术、优化评价机制等方面提出了策略建议。只有将育人理念贯穿教学全过程,不断创新教学方式方法,才能充分发挥物理教学的育人功能,促进学生德智体美劳全面发展。

罗非鱼湖病毒微滴式逆转录数字PCR检测方法的建立

建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的罗非鱼湖病毒反转录微滴式数字PCR (RT-ddPCR)检测方法,可为罗非鱼湖病毒的定量检测提供技术支持。参照NCBI中GenBank登陆的TiLV第3段全基因序列,选择hypothetical protein gene基因作为靶位基因设计合成了1对引物和探针,以TiLV-cDNA为模板,摸索、优化反应方法,建立与实时荧光RTPCR检测方法的线性关系,分析方法的敏感性、特异性、重复性,最后进行临床样品检测。结果显示,当引物、探针浓度分别为500、300 nmol·L^(-1)且退火温度为54.2℃时,建立的TiLV RT-ddPCR扩增反应效率最高、阴阳性微滴分布界限最明显、平均拷贝数较高;敏感性强,检测限低至2拷贝·μL^(-1),且在1~90 000拷贝·μL^(-1)范围内与实时荧光RT-PCR检测的线性关系较好(R2=0.995 8);检测变异系数低(4.86%);与其他5种常见的水生动物疫病病毒[鲤浮肿病毒(Carp edema virus, CEV)、锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus, KHV)、草鱼出血病毒(Grass carp reovirus, GCRV)、鲫造血器官坏死病毒(Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)、细胞肿大虹彩病毒(Red sea bream iridovirus, RSIV)]阳性样品未发生交叉反应;在临床样品的检测中,48份罗非鱼样品结果均为阴性,5份能力验证样品中3份为阳性,与能力验证满意结果一致。

罗非鱼链球菌双重荧光PCR方法的建立及临床应用

为构建一种无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)的双重荧光PCR检测方法,根据筛选的海豚链球菌LysR基因和无乳链球菌Sip基因设计特异性引物和探针,优化反应浓度和退火温度,建立标准曲线,分析方法的敏感性、特异性和重复性,最后进行方法的初步应用。结果显示:当无乳链球菌引物和探针浓度分别为0.20和0.16μmol/L,海豚链球菌引物和探针浓度分别为0.20和0.32μmol/L,且退火温度为53℃时,建立的双重荧光PCR方法荧光曲线标准,线性关系线良好,有较高的扩增反应效率;无乳链球菌和海豚链球菌最低检测限分别为29.6和10.7 CFU/mL,与猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2)和其他8种常见的水生动物疫病病原体无交叉反应,重复变异系数均小于2%;临床样品及人工污染样品检测结果与细菌分离鉴定方法符合率为100%。结果表明,本研究建立的罗非鱼链球菌双重荧光PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可同时对无乳链球菌和海豚链球菌进行检测,为罗非鱼链球菌病的临床诊断和研究提供了技术支撑。

非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及临床应用

为建立非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,以非洲猪瘟病毒P72蛋白编码基因为靶基因设计引物和探针,利用正交试验方法优化反应体系及扩增程序,建立了非洲猪瘟病毒微滴式数字PCR方法,并对其敏感性、特异性及稳定性进行评估。结果显示:建立的方法最低检出限为0.58 copies/μL,与荧光PCR方法相比更敏感;本方法与布鲁氏菌、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒无交叉反应;对10倍稀释的标准物质检测10次,变异系数为8.44%,重复性好。利用建立的方法对100份临床样品进行检测,结果均为阴性,与荧光PCR检测结果一致;对5份实验室间比对样品进行检测,检测出阳性样品4份,阴性样品1份,与实验室间比对给定的样品盘结果一致。结果表明,本研究建立的微滴式数字PCR方法的敏感性、特异性和稳定性符合要求,适于非洲猪瘟病毒临床检测。

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的结构与功能研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV引起的一种高度接触性传染病。作为一种RNA病毒,PRRSV的基因组存在广泛变异,其中以NSP2和ORF5基因变异为主。由于不同谱系毒株的ORF5有特征性的核苷酸序列,因此ORF5可用于PRRSV的分型。ORF5编码GP5蛋白,GP5蛋白含有多个表位,可与细胞受体作用,从而影响病毒的感染、复制。近年来,关于PRRSV的分子流行病学调查倾向于揭示不同毒株所特有的氨基酸突变。这些突变通常发生在GP5蛋白的信号肽编码区、非中和表位、中和表位和跨膜区。因此有研究将这些突变数据与病毒的毒力强弱、中和能力关联起来。而研究者尝试通过突变来推测GP5蛋白的构象或功能改变,从蛋白互作的结构基础层面来解释这种联系。由于GP5的三级结构并不能用传统的高分辨率冷冻电镜以及X射线晶体学方法观测,因此生物信息学方法成为相关研究的唯一选择。此外,GP5可用于基因工程疫苗的研制。综述了近年来关于GP5蛋白的生物信息学研究,并总结了GP5蛋白对病毒感染、复制、毒力、中和的影响,汇总了基于GP5的基因工程疫苗性能评测。

广东及周边省份猪繁殖与呼吸综合征病毒2型谱系8毒株变异规律和传播研究

【目的】使用贝叶斯系统动力学方法重建猪繁殖与呼吸综合征病毒2型(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus 2,PRRSV-2)谱系8毒株在广东、广西、湖南、江西和福建5个省份间的传播及遗传演化规律,为猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)的针对性防控提供参考。【方法】本研究对来自上述5省所有可用的PRRSV-2的ORF5序列进行系统发育分析,选取其中的谱系8毒株,剔除重组序列及可疑序列。将空间数据结合病原体的进化与流行病学特征进行分析,利用BEAST及相关软件计算病毒的共同祖先、核苷酸替代速率及不同地理位置间可能的传播方向和迁移速率等。【结果】系统发育分析显示,南方5省猪群中流行的PRRSV-2被分为4个谱系,其中154株被鉴定为谱系8毒株。在剔除1株重组毒株和3株可疑毒株后,来自上述5省的谱系8毒株ORF5序列具有强烈的时间信号,且最佳拟合模型为GTR+I+G。贝叶斯系统动力学分析表明,5省间谱系8毒株具有2.748×10^(-3)核苷酸替换/位点/年(95%HPD:2.053×10^(-3)~3.428×10^(-3))的核苷酸替代速率,它们的最近共同祖先可能出现在2002年(95%HPD:1998-2005年)。据SPREAD3计算,广西的毒株向广东(Rate=0.876)、湖南(Rate=0.892)、江西(Rate=0.883)、福建(Rate=0.889)传播,以及部分福建毒株向广西(Rate=0.897)传播。【结论】自2005年以来,广东、广西、湖南、江西和福建5省猪群中流行的PRRSV-2具有丰富的遗传多样性,其中谱系8毒株具有较高的核苷酸替代速率,且有效种群大小在2006-2007年和2009-2013年明显上升。同时,广东、广西、湖南、江西和福建5省谱系8毒株的最近共同祖先可追溯至2002年,且以广西作为潜在发源地在该地区持续传播。

一株猪源停乳链球菌类马亚种的分离鉴定

【目的】停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)可引起猪关节肿大和运动障碍,大大降低饲料报酬和猪场经济效益,近年研究提示停乳链球菌类马亚种(Streptococcus dysgalactiae subsp.equisimilis)是一种潜在的人兽共患病病原。对猪源停乳链球菌类马亚种进行研究,可为防治该病提供数据,具有公共卫生意义。【方法】2022年3月广东省某规模化猪场出现仔猪关节肿大和跛行症状。为确定病因,无菌采集发病仔猪关节液进行细菌分离培养,对优势菌进行形态观察、生化鉴定、16S rDNA基因序列分析、小鼠致病性试验及抗生素敏感性试验,并对其毒力基因进行PCR鉴定。【结果】根据分离菌株的形态特征、生化特性,结合16S rDNA序列测定与在线BLAST分析结果,确定其为链球菌属的停乳链球菌类马亚种。药敏试验结果表明,分离菌株对头孢曲松、头孢克洛、青霉素G、头孢氨苄、头孢吡肟、环丙沙星、磺胺异恶唑、大观霉素、恩诺沙星敏感,对丁胺卡那、多西环素、多粘菌素B、诺氟沙星、氨苄西林次敏感,而对卡那霉素、庆大霉素、链霉素、林可霉素、阿莫西林表现出耐药性。毒力基因PCR鉴定结果表明,分离菌株的基因型为eno+napr+cfb-lmb+bca-bac-scpB+cyl+。小鼠致病性试验结果表明,分离菌株导致小鼠内脏病变和死亡,具有显著的致病性。【结论】首次报道了华南地区有关致病性猪源停乳链球菌病例,研究结果为临床猪源停乳链球菌病的防治提供参考。

广东省东莞市猪乙型脑炎流行病学调查

为了解东莞市猪乙型脑炎的流行情况,于2009年-2011年对东莞市内猪养殖场采集猪血清4 282份,进行血清学与病原学检测。其中,应用ELISA检测方法对3 918份血清进行血清学检测,检测抗体阳性数2217份,抗体阳性率56.58%;应用实时定量RT-PCR检测方法对364份血清进行病原学检测,检测病毒阳性10份,病毒阳性检出率2.75%。结果表明,东莞市内饲养的猪存在乙型脑炎带毒的情况,免疫接种猪群的免疫效果比较理想,未免猪群存在乙型脑炎感染情况。

肉类大肠杆菌O_(157)∶H_7污染情况调查

大肠杆菌O157∶H7是一种重要的人兽共患病原微生物,人感染大肠杆菌O157∶H7可出现腹泻、出血性结肠炎、溶血性尿毒综合征及血栓性血小板减少紫癜等严重并发征,严重者可导致死亡[1]。1983年,Riley

东莞市马传染性贫血病流行病学调查

为了解东莞市马传染性贫血病流行情况，在2006-2013年在东莞市辖区的5个马场采集1746匹次马血清，采用琼脂凝胶免疫扩散试验方法进行检测，结果为检测1746匹次马血清，马传染性贫血病抗体均为阴性。结果表明，东莞市马的监测、检疫和流行病学调查等措施落实到位，消灭了马传染性贫血病。

应用荧光PCR方法检测动物组织弓形虫

弓形虫病是由刚第弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人畜共患病，宿主种类十分广泛，人和动物的感染率均很高。该病分布于世界各地，动物的感染很普遍，但大多数为隐性感染，

广东东莞市屠宰场及猪体内沙门氏菌的分离与鉴定

[目的 ]为了解东莞市屠宰场场地及屠宰猪的沙门氏菌污染情况。[方法 ]东莞市动物疫病预防控制中心从东莞市各镇街屠宰场采集猪肝样品320份,污水水样96份,环境空气样品160份,屠宰用具、工作台、地板等涂抹拭子共96份,进行沙门氏菌的分离与鉴定。[结果 ]共分离出沙门氏菌111株,检出率为16.5%。其中从猪肝样品中检出沙门氏菌64株(20%)、空气样品中检出15株(9%)、污水样品中检出22株(10.4%)、器具中检出10株(16.5%)。其中鼠伤寒沙门氏菌31株、肠炎沙门氏菌15株、甲型副伤寒17株。[结论 ]东莞市屠宰猪沙门氏菌污染情况比较普遍,应当引起监管部门的重视。

猪链球菌检测及分型方法研究进展

猪链球菌是一种重要的人畜共患病病原,有多个血清型,不同血清型的毒力也不相同,因此,对猪链球菌的鉴定和分型就显得尤为重要。目前,有许多方法应用于猪链球菌的检测及分型,包括常规的病原学诊断、血清学方法、生化实验以及应用最为广泛的分子生物学技术。本文就这几种方法展开详细的论述。

种鸡H5+H7N9二价苗免疫效果的跟踪监测

为了解H5+H7N9二价苗对种鸡的免疫抗体水平,作者采用HI检测方法对种鸡进行跟踪监测,分别在免疫前及免疫后7、14、21、28、75d时采集血清样品进行抗体水平检测,并在21d时进行加强免疫。结果表明,在免疫前及一免后7、14、21d和二免后7d时,H5N1 Re-8株抗体水平均为100%,H7N9 H7-Re1株抗体水平在一免后14d已上升到合格水平,二免后7d已达到峰值逐步上升,并在二免后54d仍能保持100%。结果表明,H5+H7N9二价苗免疫效果理想,两种毒株间未出现互相影响。

东莞市近年来犬类流行疾病调查与分析

对我市镇街畜牧兽医站接诊病例中的犬瘟热、细小病毒病病例进行对比分析,了解我市近期犬类流行疾病的情况,调查犬类疾病的流行动态,从而做好相关疾病的免疫。

东莞某屠宰场猪链球菌检测及分离鉴定

【目的】猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的猪病原菌,也是一种人兽共患病病原体。其中猪链球菌2型(SS2)致病力最强,不但引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎甚至死亡,也可导致人的感染和死亡。为评估屠宰场猪链球菌的传播风险,对东莞某屠宰场进行猪链球菌的采样检测和分离鉴定。【方法】采集40头猪的关节液和扁桃体进行PCR检测和猪链球菌分离,分离菌分别进行形态学和生理生化鉴定、16S rDNA PCR扩增、分型PCR检测和抗生素敏感性试验。【结果】对40头猪的关节液和扁桃体提取DNA进行PCR检测,在40份关节液中,猪链球菌阳性率为22.5%,但未检出猪链球菌2型阳性;在40份扁桃体样品中,猪链球菌阳性率为32.5%,其中猪链球菌2型阳性率为7.5%。从40头猪的扁桃体和关节液共80份样品中分离出3株猪链球菌,PCR结果表明,3株分离菌中1株为猪链球菌4型,基因型为epfmrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-;其他2株为猪链球菌9型,基因型分别为epf-mrp+gdh+gapdh+fbps-orf2+sly-和epf-mrp-gdh+gapdh+fbps-orf2+sly+。药敏试验表明,3株猪链球菌菌株对青霉素G、林可霉素、多粘菌素B和磺胺异恶唑耐药,对恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素和阿莫西林敏感。【结论】该屠宰场猪群中存在猪链球菌的隐性感染,提示存在猪链球菌2型感染人的风险。

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性,应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性,检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原,并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法,H7体系能检测出1:10-10抗原稀释度,N9体系能检测1:10-9抗原稀释度,对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应;检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明,荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。

东莞市犬弓形虫抗体血清学调查

弓形虫病是由刚第弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人畜共患病，宿主种类十分广泛，人和动物的感染率都很高。该病分布于全世界各地，动物的感染很普遍，但多数为隐性感染，可以感染的动物已知有猫、犬、猪、羊、牛、兔、鸽、鸡等40余种。孕妇感染弓形虫后可导致早产、流产、胎儿发育畸形，研究表明弓形虫感染与艾滋病（AIDS）有密切的关系。

应用间接ELISA方法检测马鼻疽抗体

为了验证间接ELISA方法检测马鼻疽抗体的可行性,在东莞市4个马场采集马血清,应用间接ELISA方法进行检测,同时对这些马匹进行鼻疽菌素滴眼反应检疫。结果为间接ELISA阳性对照血清和阴性对照血清结果均成立,采集51份马血清马鼻疽抗体均为阴性,鼻疽菌素滴眼反应检疫结果均为阴性。结果表明,应用间接ELISA方法检测马鼻疽抗体可行,东莞市的马匹未发现有马鼻疽的感染。