种子细胞库的建立及应用

目的 用细胞和生物材料体外培养、体内移植 ,修复骨及软骨的缺损。检测新药、新材料毒性实验 ,需要不同类型的种子细胞。为了防止细胞老化和污染 ,让实验具有科学性和可重复性 ,特别是软骨细胞培养 ,建立细胞库更有必要。方法 无菌取目的组织 ,用胶原酶、胰蛋白酶加纱巾法原代培养 ,建立具有增殖能力强 ,无污染 ,长期冻存 ,复苏成功率高的细胞系。结果 自建骨、骨膜、软骨、骨髓、骺板软骨等 2 0个细胞系。还收集了其他细胞系 16个。为院内外 35名研究生 ,98次复苏冻存细胞均获成功。结论 原代培养用酶消化加纱巾法分离成功率高。 2 2次原代培养 ,2 0次成功建系。建立种子细胞库为科研教学提供了方便。既省时 ,又节约经费 。

人乙状结肠管状腺癌移植裸鼠模型的建立及应用

本文报导用人乙状结肠原发部位的管状腺癌组织块移植到裸鼠体内荷瘤后,在生物学研究和临床诊断治疗方面的应用,建立了一个有实用价值的动物模型,该模型先后传代20余次、因各种实验需要接种裸鼠125只:其形态及生物学特征和组织的抗原性仍保持不变,用鼠间传代第1(?)代肿瘤组织做体外细胞培养,第5天就可见到单层细胞长出,呈腺样管状结构,在应用性实验中,用放射性核素标记的抗结肠癌单克隆抗体2C10在本模型裸鼠体内的放射免疫显象,为过渡到临床病人的定位诊断提供了必要的参数和依据,另外还用鼠间传代的肿瘤组织块,经液氮冻存28个月后再接种到裸鼠皮下肿瘤仍同样生长,并能传代,其形态特点与原发肿瘤基本一致,这对保持裸(?)肿瘤模型的延续性,减少鼠间传代的工作量和所需费用,为肿瘤实验研究工作的重复性,将有很明显的实际意义。

人黑色素瘤细胞系(HMM-239)的建立及其生物学特性

人黑色素瘤细胞系在国外虽已建立近200个[1],但在国内尚未见报道。

新型脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备

目的探讨脱细胞软骨基质三维多孔支架的制备方法以及将其应用于关节软骨组织工程的可行性。方法取天然人软骨粉碎后,采用梯度离心法取100 nm～5μm软骨微丝,脱细胞处理后制备为质量体积比为3%的悬液,采用冷冻冻干法制备脱细胞软骨基质三维多孔支架。254 nm紫外线和碳化二亚胺/ N-羟基琥珀酰亚胺对支架进行交联。冷冻冻干后,对支架材料进行组织学及扫描电镜观察,测定支架孔径和孔隙率、吸水率,并采用MTT法分析支架浸提液毒性。分离培养犬BMSCs,用TGF-β1成软骨诱导后种植至支架,倒置显微镜、电镜观察细胞在支架上的生长、分化情况。结果组织学观察显示,三维多孔支架中无软骨细胞碎片残留,甲苯胺蓝染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性。扫描电镜显示支架内孔洞相互连通,孔径为(155 ± 34)μm,孔隙率为91.3% ± 2.0%,吸水率为2 451% ± 155%。MTT 法显示不同浓度支架浸提液与对照DMEM培养液吸光度值比较,差异无统计学意义(P > 0.05),支架无细胞毒性。倒置显微镜观察,细胞在支架上黏附良好;扫描电镜下细胞在支架上均匀分布,细胞呈圆形或椭圆形,并有基质分泌。结论制备的脱细胞软骨基质三维多孔支架去细胞彻底,保留了软骨ECM主要成分,无毒,具备合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是软骨组织工程良好的支架载体。

脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究

目的 :研究脂肪干细胞的分离及向软骨方向定向诱导的方法。方法 :从成年兔颈后部或腹股沟处脂肪组织取材 ,酶消化法分离、培养脂肪干细胞 ;免疫荧光测定CD3 4 抗原的表达 ;流式细胞仪测定CD3 4 抗原百分比 ;分别用15 %牛血清、少血清 (5 % )及无血清诱导培养基定向软骨细胞方向诱导 ;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果 :从兔脂肪组织中能分离出生长旺盛的干细胞 ,CD3 4 抗原表达阳性 ,表达百分比与骨髓干细胞无明显差异 ;定向诱导后表现出软骨细胞的特性 ,诱导效果无血清诱导培养基效果最好。结论 :从兔脂肪组织中能分离出干细胞 ;生物学特性与骨髓干细胞相似 ;能向软骨细胞方向诱导 ;无血清诱导培养基效果最好。

骨髓基质细胞与关节软骨细胞生物学特性的比较研究

目的 观察兔骨髓基质细胞 (MSCs)诱导和基因修饰后的主要生物学特性 ,并与关节软骨细胞进行比较。 方法 抽取成年雄性新西兰大白兔髂骨骨髓 ,密度梯度离心获得骨髓基质细胞 ,培养传至第 5代 ,按处理方法分为常规培养液组 (A组 )、条件培养液组 (B组 )及重组缺陷型腺病毒携带肝细胞生长因子 c DNA转染组 (C组 )。条件培养液为常规培养液中含转化生长因子 - β1 (10 ng/ml)、碱性成纤维细胞生长因子 (2 5 ng/ml)和地塞米松 (10 - 7mol/L)。切取兔膝关节软骨 ,3mg/ml 型胶原酶消化传代培养至第 3代 (D组 )。观察原代 MSCs及第 5代 MSCs(体外培养 8～ 10周后 )细胞形态 ,对第 5代 MSCs及第 3代软骨细胞进行 、 型胶原免疫组织化学染色 ,MTT法检测细胞增殖情况。阿利新蓝法检测细胞培养上清液中糖胺多糖 (GAG)含量。提取各组培养细胞总 RNA,RT- PCR检测 、 型胶原表达。 结果 原代 MSCs为短梭形、簇状生长 ,传代细胞呈长梭形、旋涡样生长。A组细胞爬片 型胶原免疫组织化学染色阳性 , 型胶原免疫组织化学染色阴性 ,GAG含量低 ,与 D组比较 ,差异有统计学意义 (P<0 .0 5 )。B组细胞爬片 、 型胶原免疫组织化学染色阳性 ,GAG含量升高 ,与 D组比较差异无统计学意义 (P>0 .0 5 ) ;C组转染后第

孕三烯酮和米非司酮对子宫内膜异位症患者异位内膜及腹腔液巨噬细胞凋亡的影响

对培养的异位子宫内膜及腹腔液巨噬细胞分组加入孕三烯酮及米非司酮药物 ,观察其细胞生长情况及形态学变化 ,同时进行细胞凋亡率检测等研究 ,探讨子宫内膜异位症的临床治疗。方法 :对 12例患子宫内膜异位症妇女异位子宫内膜的离体组织及腹腔液进行细胞培养 ,在相同的生长期 ,分别加入一定剂量的孕三烯酮或米非司酮后 ,观察细胞的生长状况并用流式细胞仪检测其凋亡率。结果 :加入药物后 ,细胞的生长速度减慢 ,其凋亡率较未用药组明显增加 ,差异有显著性 (P <0 .0 5 ) ,而两种药物在同一种细胞 ,相同作用时间的凋亡率无统计学意义。结论 :孕三烯酮及米非司酮对异位子宫内膜细胞及腹腔液巨噬细胞有抑制作用 ,并且可以诱导异位子宫内膜细胞及腹腔液巨噬细胞的凋亡。

关节软骨细胞外基质源性软骨组织工程取向支架的制备

背景:仿生天然软骨细胞外基质特殊的力学、结构特性和生化成分的软骨组织工程支架具有巨大的应用潜能。目的:观察仿生天然关节软骨细胞外基质的生化和结构特性,探讨关节软骨细胞外基质材料及软骨组织工程取向支架的制备方法,并对其理化性质进行检测。设计、时间及地点:组织工程材料支架制备及性能分析的体外实验,于2007-07/2008-07在解放军总医院骨科研究所完成。材料:将新鲜猪关节软骨湿法粉碎,差速离心,收集无细胞的软骨细胞外基质成分。脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶及碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺均为美国Sigma公司产品。方法:对关节软骨细胞外基质材料进行组织学和形态学检测后,用pH3.2的稀盐酸制成质量浓度为20g/L溶液,采用定向结晶及冷冻干燥技术制成关节软骨细胞外基质源性取向支架,再采用物理化学方法交联,同时制备多孔软骨细胞外基质源性非取向支架。主要观察指标:①关节软骨细胞外基质材料的生化组成和形态。②软骨细胞外基质取向支架和非取向支架的表面特征及孔道结构。③取向和非取向软骨细胞外基质支架的孔隙率、吸水膨胀率、力学特性的比较。结果:收集的关节软骨细胞外基质材料中无细胞存在,纤维为纳米尺度,甲苯胺蓝、番红花O、奥新蓝染色及Ⅱ型胶原染色阳性;制备的取向支架具有纵向排列的孔道结构,孔径100～200μm,分布均匀,非取向支架的孔呈海绵样结构;两种支架孔隙率均≥95%,吸水膨胀率均≥96%。取向支架纵向压缩模量和拉伸模量为:(2.02±0.02),(22.10±0.67)MPa,均大于非取向支架,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:天然关节软骨细胞外基质材料与天然关节软骨的生物力学特性相似,可满足软骨组织工程的需要,是一种比较理想的软骨组织工程支架。

去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损

目的:探讨周围神经缺损的治疗方法,评价去细胞同种异体神经移植修复人体长段周围神经缺损的效果。方法:实验于2003-04-14/2004-05-14解放军总医院骨科完成。取正常健康捐献者的周围神经,进行化学处理,应用化学萃取法制备去细胞同种异体神经,对11例周围神经缺损的住院患者进行神经移植,修复神经缺损。分别于术后定期对患者进行感觉、运动功能检查,并行肌电图检查。结果:参与的11例患者,均获得随访,无缺失。7例患者术后功能有恢复,改善率64%(7/11),其中1例移植9cm修复正中神经缺损的患者术后6个月,感觉与运动功能开始恢复,术后16个月,患手能够持物,感觉和肌力恢复。11例患者中6例缺损位于腕部以上的患者恢复3例,术后6个月行肌电图检测,有神经冲动穿过,改善率50%(3/6),5例缺损位于腕部以下的患者恢复4例,改善率80%(4/8)。结论:应用化学去细胞神经同种异体移植可修复人体周围神经缺损,并且可以避免取自体神经的弊端。

人关节软骨脱细胞基质的制备

目的制备人关节软骨脱细胞基质。方法切取人关节软骨,对之冷冻干燥后,采取化学去污剂TritonX100及DNA酶和RNA酶等试剂制备脱细胞的人关节软骨。做HE、番红0及软骨蛋白聚糖(aggrecan)免疫组化染色等方法进行检测。结果HE染色、番红0染色均显示细胞陷窝内己无细胞结构番红花0染色阳性;软骨蛋白聚糖免疫组化染色阳性。结论人关节软骨冻干后,经去污剂酶等处理方法可脱去软骨的细胞成分,并且保留了软骨细胞外基质,成功制备了人关节软骨脱细胞基质。

改良化学去细胞同种异体神经制备方法的实验研究

[目的]改进去细胞异体神经化学萃取制备方法,制备出细胞及髓鞘去除完全、神经机构保存完好的去细胞异体神经移植物。[方法]SD大鼠14只,取双侧坐骨神经(共28根),分3组进行化学萃取去细胞处理:Son-dell法组(10根)、改良法组(10根)和对照组(8根)。Sondell法组所用萃取剂为Triton X-100和脱氧胆酸钠;改良法组所用萃取剂为Triton X-200、SB-10和SB-16;对照组未进行化学处理。处理后神经行HE染色、快蓝染色、基底膜素免疫组化染色及环境扫描电镜观察,并从去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性三方面综合评价。[结果]在去细胞异体神经物理性状方面,改良法制备的去细胞异体神经韧性弹性略好于Sondell法;HE染色表明,2种方法的去细胞效果均较好,但改良法对神经结构的破坏较小;快蓝染色、基底膜素免疫组化染色、环境扫描电镜结果均表明,改良法在对髓鞘的去除、基底膜素的保留及神经结构的保存方面均优于Sondell法;综合质量评分结果表明,2种方法在去细胞效果方面相似(P1>0.05),髓鞘去除及神经结构的保存方面改良法优于Sondell法(P2、P3<0.05),综合去细胞程度、髓鞘染色分级和结构完整性3方面,改良法制备的去细胞异体神经质量优于Sondell法(P4<0.05)。[结论]综合运用萃取剂Triton X-200、SB-10和SB-16的化学萃取方法,是一种较为理想的去细胞异体神经制备方法,能够制备出免疫物质清除完全、神经结构较好保存的去细胞异体神经移植物,为自体神经移植找到了较好的替代解决方法。

羊软骨细胞在生物反应器中的培养和扩增

[目的]探索在旋转生物反应器内,应用微载体技术快速扩增分化良好的羊软骨细胞的方法。[方法]将培养的羊软骨细胞应用Cytodex3微载体在旋转生物反应器(RCSS)内,进行动态培养,应用倒置显微镜对微载体表面的软骨细胞进行动态观察,并对收获的软骨细胞进行Ⅰ、Ⅱ型胶原的细胞免疫化学染色分析。[结果]关节软骨细胞于1d内贴附于Cytodex3微载体表面,细胞初期为圆球形、半球形凸起,逐渐向周围伸展,随时间的延长,贴附于微载体的细胞逐渐增多,到培养后期,细胞密度可达最初接种的15～17倍,在微载体上收获的软骨细胞经Ⅰ型胶原的免疫细胞化学染色呈阴性,Ⅱ型胶原染色则呈强阳性。[结论]利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增羊软骨细胞,可为构建组织工程化人工软骨提供大量活性、分化良好的软骨细胞。

酸性氧化电位水用于室内环境表面消毒效果的观察

目的观察酸性氧化电位水(EOW)对无菌室物体表面消毒后的效果。方法采用EOW浸泡拖布、抹布擦拭实验室、细胞培养室内的地面、墙、桌面,水浴锅内表面及拖鞋用EOW各浸泡5 min,前5处物体表面经擦拭、浸泡后,用培养皿扣贴取材,并按A、B、C、D 4组进行菌落计数;A组:为消毒前;B组:使用EOW擦拭、侵泡消毒后;C组:采用紫外线照射30 min后,从5处表面取材培养;D组:采用紫外照射30 min后,用EOW擦拭、浸泡后消毒采样培养。结果A组:GLP实验室、细胞培养室内环境表面均有菌落,有的无法计数;B组:除水浴锅中有1个平皿长出1个菌落处,有效率达90%;C组:虽经紫外线照射,空气中消毒效果较好,但从5处物体表面取材培养,可能与紫外线消毒离地面的距离较高有关;D组:细菌培养均为阴性。结论EOW消毒效果肯定、价格低廉,大面积、高处擦拭消毒使用方便,对皮肤刺激性小,符合环保要求,值得推广应用。

乳鼠心肌细胞的体外培养及生物学特性研究

目的探讨乳鼠心肌细胞的体外培养方法并对其生物学特性进行观察。方法1～3日龄新生SD大鼠10只,用无酶消化法行含血清培养基原代心肌细胞培养,连续观察细胞生长及传代情况40天。α-横纹肌肌动蛋白抗体标记培养细胞,以流式细胞仪行心肌细胞纯度鉴定,Giemsa染色观察培养心肌细胞形态,吖啶橙-碘化丙啶(AO-PI)染色法检测培养细胞活性。记录培养心肌细胞总数,计算单个乳鼠心脏细胞产量。结果原代组织块和单个心肌细胞在接种后24～48h贴壁,其中部分出现搏动并持续至观察期末。培养细胞群鉴定心肌细胞纯度为94.1%,活细胞比例95.3%,95%可信区间(CI)为91.6%～99.0%。平均每个乳鼠心脏单细胞产量为3.3×106个,95%CI为2.1×106～4.5×106个。结论无酶消化法培养的乳鼠心肌细胞纯度、活力及产量能够满足心肌细胞研究的需要。

微球化人脐带Wharton胶间充质干细胞移植裸鼠皮下构建异位软骨

背景:软骨细胞外基质具有众多的信号分子蛋白和因子,其成分和特性最接近天然软骨组织,因而其很可能是构建组织工程软骨的最理想原料。目的:探讨海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球复合人脐带Wharton胶间充质干细胞在裸鼠皮下异位构建组织工程软骨的可行性。方法:制备软骨细胞外基质微丝悬液,将人脐带Wharton胶间充质干细胞接种于海藻酸钙-软骨细胞外基质混合凝胶微球中体外培养后植入裸鼠背部皮下(实验组),以人脐带Wharton胶间充质干细胞混合于单纯藻酸盐凝胶微球作为对照组,于4周后取材进行大体和组织学苏木精-伊红、甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化观察。结果与结论:体外培养时微球中干细胞呈球形软骨细胞样形态,生长、增殖情况良好;实验组术后第4周取材可见外形呈类软骨样组织块,甲苯胺蓝、番红O及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,镜下观察可见大量类软骨样细胞及类软骨陷窝样结构,植入的混合凝胶微球周围组织无明显炎症反应;对照组显示微球部分降解,周围仅有少量炎症细胞及淋巴细胞。结果可见海藻酸钙-软骨细胞外基质具有良好的组织相容性,复合干细胞形成的微球植入裸鼠皮下可以构建为类软骨样组织。

凋亡调节基因bcl-2,bax和fas在子宫内膜异位症中的表达

应用免疫组化法检测凋亡调节蛋白bcl 2 ,bax和fas在无异位症妇女的正常子宫内膜、腹腔液巨噬细胞与卵巢子宫内膜异位症患者在位子宫内膜、异位子宫内膜及腹腔液巨噬细胞中的表达。同时 ,用TUNEL法测出各种细胞的调亡率。结果表明 ,bcl 2在异位症患者在位、异位内膜及腹腔液巨噬细胞中的表达较无异位症者增强 ,差异有显著性意义 (P <0 0 1)。bax在异位症中的表达较低 ,差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。fas在异位症患者在位及异位内膜中的表达较低 ,差异有显著性意义 (P <0 0 5 )。结果提示 ,子宫内膜异位症患者在位、异位内膜及腹腔液巨噬细胞中凋亡基因的表达与无异位症者不同 ,其凋亡率低 ,对凋亡的接受性降低 ,有利于异位内膜的种植、生存和发展。

经羟基磷灰石处理的纯钛表面有利于角膜成纤维细胞的粘附和增殖(英文)

目的:研究与纯钛相比,经羟基磷灰石表面改性处理的纯钛是否能增加兔角膜基质成纤维细胞在其表面的粘附和增殖。方法:利用生物活性的羟基磷灰石对纯钛进行表面改性。将第4代兔角膜基质成纤维细胞接种于羟基磷灰石表面改性的钛、纯钛及玻璃表面,24,48,72h后,使用丫啶橙染色的方法观察材料表面细胞的粘附和增殖情况,电镜观察材料表面的细胞形态。结果:各个时间点,羟基磷灰石表面改性的钛表面的细胞数都多于其他材料(P<0.05)。24h,羟基磷灰石表面改性的钛表面和玻璃表面的细胞扩展面积要大于纯钛表面。72h电镜观察发现羟基磷灰石表面改性的钛表面的细胞扩展面积最大,细胞张力丝最长。结论:与纯钛相比。

骨关节炎软骨中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布

目的 :研究骨关节炎软骨中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的分布。方法 :从正常关节软骨和骨关节炎软骨上取样本做切片。所有样本行HE、蕃红 0染色及Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组化。结果 :骨关节炎软骨中Ⅱ型胶原免疫组化染色不均匀。Ⅰ型胶原染色 ,在表层和中层的部分区域有不规则着色。纤维样组织中 ,Ⅰ型胶原免疫组化呈阳性 ,Ⅱ型胶原免疫组化不着色。结论 :骨关节软骨基质中Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的破坏增强与软骨细胞对其合成增强同时存在 ,软骨修复的过程中 ,部分软骨细胞发生去分化 。

阿伦磷酸钠对人成骨细胞增殖的影响

目的 :改良成人成骨细胞消化培养方法 ,研究阿伦磷酸钠对成人成骨细胞增殖的影响。方法 :手术中获取病人的髂骨块 ,酶消化法得到成骨细胞 ,传 4代后以 1× 10 5/ml的浓度种于 2块 96孔板中。MTT方法检测阿伦酸钠对成骨细胞增殖的影响。结果 :高于 10 4M浓度的阿伦磷酸钠明显抑制成骨细胞的增殖 ,浓度低于 10 5M时 ,成骨细胞的增殖不受影响。结论

可注射性组织工程软骨源性微载体的微观结构及其生物相容性观察

[目的]改进软骨源性微载体的制备方法。对其微观结构特征及其与骨髓间充质细胞的生物相容性进行观察,探索新的可注射性组织工程软骨的制备方法。[方法]将新鲜的猪关节软骨在液体中粉碎,梯度离心后制备成150～300μm的颗粒,去细胞处理后采用常规组织学方法观察软骨微粒的空间结构及化学组成,采用扫描电镜观察软骨源性微载体的形态特征,随后体外获取扩增骨髓间充质细胞,与软骨微粒复合,然后采用旋转式生物反应器扩增,构建可注射性组织工程软骨细胞。[结果]本研究制备的软骨微粒呈圆形或椭圆形,表面呈毛刷状结构,主要成分是Ⅱ型胶原和GAG,而毛刷的主要成份Ⅱ型胶原、骨髓间充质干细胞不仅与微载体结合良好,还能够在其表面大量扩增。[结论]与传统的微载体不同,软骨源性微载体与细胞复合后,不需要再将细胞消化,避免了软骨细胞外基质的损失,可以作为可注射性组织工程软骨的理想材料和方法。