SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的 克隆表达SARS CoVS1蛋白 ,构建SARS基因疫苗。方法 从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS CoVS1蛋白的编码序列 ,将该序列克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。采用脂质体法转染VeroE6细胞 ,用Westernblot检测S1蛋白的表达。结果 PCR方法扩增出 2 0 0 0bp左右的基因片段 ,插入pVAX1构建重组表达载体后 ,经序列测定证实扩增的片段为SARS CoVTor 2株S1蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞 ,收集细胞总蛋白 ,Western检测获得特异蛋白带。结论 成功克隆并表达了SARS CoVS1蛋白 。

微量免疫法制备小鼠抗人补体C9抗血清

目的 建立一种简便有效的免疫方法 ,制备抗人补体C9抗血清。方法 将鉴定好纯度的免疫原稀释至恰当浓度 ,以硝酸纤维素膜吸附抗原 ,将之埋入小鼠背部皮下 ,并再次免疫 1～ 2次。间接ELISA法鉴定抗血清效价 ,免疫印迹实验鉴定抗血清的免疫反应特异性。结果 间接酶联免疫吸附实验滴定抗血清的效价约为 1× 10 -5,抗血清对正常人血清成分进行的免疫杂交实验得到特异性的C9蛋白条带。结论 以硝酸纤维素膜吸附抗原的微量免疫方案获得特异性和效价均佳的免疫效果。

磁转联合脂质体实现高效细胞转染

目的优化体外培养细胞的外源基因转染方案。方法采用磁性微粒联合脂质体,将重组人绿色荧光蛋白表达载体(pAAVIREShrGFP)外源DNA定向转染COS7细胞,荧光显微镜下观察外源基因的表达,比较不同转染条件及DNA载量的细胞转染效果。结果DNA与Combimag按1∶1的比例混合转染可以得到很高的转染效率,过高的DNA载量使转染效率减低。结论利用磁转结合脂质体可使低剂量的DNA达到快速、简便和高水平的转染。

人CD137分子基因克隆及其在COS-7细胞中表达的研究

目的 克隆人CD13 7分子的编码序列 ,将其重组入真核表达载体 ,并表达于COS 7细胞。方法 从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法克隆编码人CD13 7的编码序列 ,对其序列进行测定。将测序正确的CD13 7编码序列克隆入真核表达载体PCI neo ,构建重组表达载体。采用脂质体法转染COS 7细胞 ,用流式细胞仪检测CD13 7分子的表达。结果 PCR方法扩增出一 80 0bp左右的基因片段 ,插入PCI neo构建重组表达载体后 ,经序列测定证实扩增的片段为人CD13 7编码序列。将重组子转染COS 7细胞 ,流式细胞仪检测显示有 2 7.11%的细胞表达人CD13 7分子。结论 成功地克隆并在COS 7细胞中表达了CD13 7分子。

肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶

目的蛋白质组学分析鉴定与肿瘤细胞共培养T细胞的表达差异蛋白。方法双向电泳分离有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白,PDQuest软件分析筛选肿瘤细胞诱导表达异常的蛋白点,用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MAL-DI-TOF MS)对酶解消化样品进行肽质量指纹图谱(PMF)分析,结合数据库搜索鉴定蛋白质。结果PDQuest分析有/无肿瘤细胞共培养的T细胞蛋白双向电泳图谱,70余个蛋白点表达水平差异显著,其中与肿瘤细胞共培养的T细胞有一明显表达下调的蛋白点,质谱分析结合数据库检索表明该蛋白点为腺苷脱氨酶。结论肿瘤细胞诱导T细胞下调表达腺苷脱氨酶。

重组α-病毒的制备和鉴定

目的 探讨从DNA水平制备重组α 病毒的新途径 ,寻找更简便的制备重组α 病毒疫苗的新方法。方法 将表达β 半乳糖苷酶的载体和包装载体用磷酸钙法共转染BHK包装细胞 ,收集并纯化上清中的病毒。再用该病毒在体外感染BHK细胞 ,鉴定所制备病毒滴度和目的基因的表达情况。结果 用本方法制备出了较高效价的重组病毒 ,并能在哺乳细胞中很好地表达。结论 从DNA水平可以制备出较高滴度的重组α 病毒 。

脱脂棉及尼龙棉柱分离纯化T淋巴细胞的比较研究

目的 建立脱脂棉柱纯化人外周血T淋巴细胞的方法 ,并与尼龙棉柱分离法进行比较。方法 密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞 ,通过玻璃器皿黏附的方法去除其中的单核巨噬细胞 ,再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T淋巴细胞经流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度 ,台盼蓝排斥实验检测纯化T细胞活力。结果 脱脂棉及尼龙棉柱滤过法对纯化T细胞的活力均无影响。

免疫磁珠法分离人外周血CD4^+ CD25^+调节性T细胞

目的建立人外周血单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离方法(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率。方法采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人外周血单个核细胞中的CD4+CD25+调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CD4+T细胞,再用抗CD25+的磁珠阳性分选CD4+CD25+T细胞。分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;胞内因子染色检测其转录因子FOXP3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞增殖抑制效应。结果阴性分选CD4+T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4+CD25+Treg细胞的纯度为(95.1±1.2)%。胞内因子染色FOXP3在CD4+CD25+Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%3。H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞具有明显的抑制作用。结论采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快速地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4+CD25+Treg,为进一步研究其功能提供了方便。

CD4^+ CD25^+调节性T细胞对乙肝疫苗弱/无应答者外周血单个核细胞分泌IL-4水平和抗-HBs产生的影响

目的:通过分析乙肝疫苗弱/无应答者外周血单个核细胞(PBMC)剔除CD4+ CD25+调节性T细胞(简称Treg细胞)和不剔除Treg细胞后,用乙肝表面抗原(HBsAg)诱导,检测其培养上清IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平,来探讨Treg细胞与乙肝疫苗弱/无应答现象的关系。方法:选择25例乙肝疫苗无应答者,30例弱应答者,同时选择20例强应答者作为对照,用HBsAg在体外诱导剔除和不剔除Treg细胞的3组人外周血PBMC,采用酶联免疫吸附法(ELISA)测定培养上清的IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平。结果:剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导,其培养上清IL-4分泌水平强应答组、弱应答组和无应答组相比无明显差异(P>0.05),其抗-HBs的产生水平也无明显差异(P>0.05);不剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导,其培养上清IL-4分泌水平与抗-HBs的产生水平弱/无应答组与强应答组相比差异有显著性(P<0.01),弱/无应答组的IL-4分泌水平与抗-HBs的产生水平显著低于强应答组。结论:不剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导,其培养上清IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平弱/无应答者与强应答者相比显著低下。由于IL-4主要是由Th2细胞分泌,因此我们推测乙肝疫苗弱/无应答现象可能是由于Treg细胞抑制了Th2细胞的极化,从而影响了机体的体液免疫应答。

补体膜攻击复合物刺激血管内皮细胞胞浆游离钙离子浓度的变化

目的 在单个细胞水平 ,观测亚溶破补体膜攻击复合物 (MAC)诱导的血管内皮细胞 [Ca2 + ]i的动态变化。方法将原代培养的人脐静脉内皮细胞 ,以Fluo 4 /AM(1～ 6 μmol/L)和 0 .0 2 %PluronicF 12 7进行细胞钙荧光指示剂负载后 ,于 0℃组装亚溶破剂量的MAC。在 37℃条件下 ,以LSCM实时监测MAC沉积引起的胞浆钙荧光强度的变化。结果 MAC沉积后 ,多数细胞的钙荧光强度迅速增强 ,以后随时间的推移 ,升高的钙荧光逐渐下降 ,直至恢复至静息水平。定量分析选定的胞浆区域钙荧光强度的变化发现 ,不同细胞在 [Ca2 + ]i 的变化高度、持续时间和胞内钙振荡的特征等方面存在异质性。结论 MAC沉积到内皮细胞表面后 ,可诱导胞浆游离钙离子的浓度增高 ,且不同细胞 [Ca2 + ]i

质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究

目的 构建针对SARS CoV的特异性siRNA质粒 ,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染。方法 根据SARS CoV的全长基因序列 ,以 4个不同的部位为靶点 ,分别设计、合成含有 19nt干扰序列的一段寡核苷酸 ,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3 .1 H1载体中 ,构建表达siRNA的质粒。采用脂质体法将质粒转染VeroE6细胞 ,经潮霉素抗性筛选后 ,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验 ,以观察干扰效应。结果 对所构建的质粒分别测序 ,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致。用不同浓度的SARS CoV感染转染质粒后的细胞 ,与阴性对照相比 ,其细胞病变减轻、活细胞显著增加 ,病毒空斑明显减少。结论 利用RNA干扰能有效的抑制SARS CoV在细胞中的复制 ,并对细胞有保护作用 ,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法。

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的 选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD4 6和CD5 5 ,设计构建了新型的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子。方法 以CD4 6cDNA和CD5 5cDNA为模板 ,通过PCR及PCR重叠延伸技术 (SOE)得到CD4 6 /CD5 5嵌合cDNA。为避免双分子连接后的空间结构和功能的变化 ,在CD4 6与CD5 5之间引入了多肽氨基酸接头 (Linker) ,然后克隆构建GPI锚固型CD4 6 /CD5 5 BluescriptM13克隆载体。结果 获得了阅读框完整、连接部位正确的GPI锚固型CD4 6 /CD5 5嵌合分子cDNA。结论 本研究为研制开发新一代的多功能。

人PD1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1(+)片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1(+)表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。

中和性马抗体对SARS-CoV感染的防治作用

目的探讨马抗SARSCoV中和性抗体是否对SARSCoV感染有防治作用。方法用SARSCoV(BJ01株)免疫马匹,从免疫马血清中制备IgGs及其F(ab’)2片段。通过细胞病变法(CPE)、MTT法和空斑形成实验(PFU)等方法,在体外培养的VeroE6细胞中检测F(ab’)2片段对SARSCoV感染的预防性和治疗性作用。再在Balb/c小鼠体内模型中,用CPE法和定量RTPCR方法检测该抗体的保护性效应。结果CPE、MTT和PFU三种方法证实来自三匹马的血清F(ab’)2的中和滴度均达到1∶1600以上。体内实验证实,50μg的F(ab’)2片段可以完全中和1×104TCID50SARSCoV。结论马抗SARSCoV抗体在体内外均能有效地中和SARSCoV和预防其感染宿主细胞,为马抗体将来在大的灵长类动物或人体内进行实验提供实验依据。

衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL-2中的作用

目的研究衰变加速因子对 CD3阳性与阴性 Jurkat细胞的增殖效应及对 IL- 2分泌的影响。方法应用 MTT比色实验观察交联 DAF单抗 DG3与固相化抗 CD3联合作用对 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞增殖效应 ;IL - 2依赖 CTL L3H- Td R掺入实验检测 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞 IL - 2的分泌 ;细胞 EL ISA检测 CD3阳性与 CD3阴性 Jurkat细胞IL - 2 R的表达。结果交联 DG3可协助促进固相化抗 CD3对 CD3阳性 Jurkat细胞的增殖效应和 IL - 2分泌 ,并可引起 IL - 2 Rα链表达增加 ,此作用可被 Src家族酪氨酸激酶抑制剂 PP2所抑制 ,而对 CD3阴性 Jurkat细胞无此作用。结论衰变加速因子可协同促进固相化抗 CD3对 CD3阳性 Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL- 2分泌及 IL- 2 R表达增加。

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的:克隆表达SARS-CoVS蛋白,构建SARS全长基因疫苗。方法:从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoVS1和S2蛋白的编码序列,再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1,构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western检测S蛋白的表达。结果:PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段,两片段插入pVAX1构建重组表达载体后,经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染VeroE6细胞,收集细胞总蛋白,Western检测获得特异蛋白带。结论:成功克隆并表达了SARS-CoVS蛋白,为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。

IgG型抗CD55×抗β-Gal基因工程双特异性抗体的构建

目的 探讨用生物学方法治疗病毒感染性疾病及肿瘤的新途径。方法 以有重要补体活化调节功能的膜补体调节蛋白CD5 5为靶点 ,以 β GaL为模拟病毒或肿瘤抗原 ,制备“IgG”型抗CD5 5×抗 β Gal基因工程双特异性抗体 ,并对该重组抗体真核表达后的结合活性进行初步的验证。结果 克隆的CD5 5抗体可变区片段为新的小鼠抗体可变区片段 ,经HEK 2 93细胞表达后的重组抗体显示了良好的CD5 5及Fc结合活性。

PD-L1 mAb的制备、鉴定及其特性的研究

目的 制备抗程序化死亡配体 1(ProgrammedDeath Ligand 1,PD L1)的mAb杂交瘤细胞系并对其分泌的抗体特性进行研究。方法 用我室纯化的PD L1 IgG4Fc融合蛋白免疫Balb c小鼠 ,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2 0进行融合 ,经筛选和克隆化后 ,建立杂交瘤细胞系。以Western blot等方法研究抗体特性。结果 得到 3株能够稳定分泌抗体 ,效价高的杂交瘤细胞系 2D10、1C3和 1A6 ,Western blot显示 2D10、1C3和 1A6能与PD L1(Mr 为 5 80 0 0 )结合。结论 得到杂交瘤细胞系稳定分泌的mAb ,在抗病毒免疫、抗肿瘤反应和自身免疫性疾病的免疫诊断和

人脐静脉内皮细胞清除补体攻膜复合物的机制

目的 探明内皮细胞清除补体攻膜复合物 (MAC)的途径及其清除动力学。方法 原代培养的人脐静脉内皮细胞以RH4 14荧光标记质膜双层 ,0℃组装亚溶破剂量的MAC ,37℃复苏后 ,LSCM实时监测MAC沉积诱导的质膜囊泡化形成和胞吞、胞吐情况。流式细胞仪定量检测内皮细胞表面MAC抗原的清除情况。结果 MAC沉积后 ,内皮细胞有活跃的质膜囊泡化形成 ,囊泡以胞吞和胞吐 2种方式离开细胞 ,并以前者占优。 37℃条件下 ,内皮细胞清除表面MAC的半衰期约为 5min。结论 内皮细胞可通过胞吞和胞吐 2种机制清除细胞表面沉积的MAC ,并以胞吞方式为主。