对虾暴发流行病的一种新病原——副粘病毒样病毒

对１９９６年我国河北、山东人工养殖的日本对虾和中国对虾暴发流行的虾病进行了病原学研究，发现引起本次虾病暴发流行的病原是迄今尚未见报道的对虾的一种新病原——副粘病毒样病毒。该病毒主要侵害对虾肝胰腺，导致细胞严重变性。

人肿瘤坏死因子α逆转录病毒表达载体的构建

应用ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒构建了含人肿瘤坏死因子－α ｃＤＮＡ的过渡性载体ｐＢＴ１和ｐＢＴ２。用限制性内切酶ＢａｍＨＩ与ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＴ１ＤＮＡ，分离出了ＴＮＦ－α ｃＤＮＡ基因片段，并在其平末端加入了ＢａｍＨＩ接头。进而将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＴＮＦ－αｃＤＮＡ克隆到了逆转录病毒载体ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１５′－端长末端重复序列（ＬＴＲ）下游的ＢａｍＨＩ切点上，构建了重组质粒ｐＺＩＰＴＮＦ。该重组质粒经琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶消化和核酸杂交鉴定分析，证明ｐＺＩＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１中插入了ＴＮＦ－α ｃＤＮＡ，并且方向正确。本研究为应用重组逆转录病毒介导ＴＮＦ－α基因转移与治疗奠定了基础。

人白细胞介素6逆转录病毒表达载体的构建

实验以ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｌｌｋｓ质粒为载体，构建了人白细胞介素６次级克隆ｐＢＩＬ－６。用限制性内切ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＶ消化ｐＢＩＬ－６，分离并回收了ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段，并在其平未端加入了ＢａｍＨＩ接头。实验将带有ＢａｍＨＩ粘性末端的ＩＬ－６全基因片段插入到了逆转录病毒载体ｐＺＬＰＮｅｏＳＶ（Ｘ）１的ＢａｍＨＩ位点上，构建了重组质粒ｐＺＬＰＩＬ－６。经对重组予ＤＮＡ的琼脂糖凝胶电泳、限制住内切酶分析和核酸杂交鉴定，筛选出了含有ＩＬ－６ｃＤＮＡ片段及插入方向正确的ｐＺＬＰＩＬ－６。

重组逆转录病毒介导的肿瘤坏死因子基因转移与哺乳动物细胞表达

以构建的重组肿瘤坏死因子逆转录病毒载体ｐＺＩＰＴＮＦＤＮＡ转染Ｃｏｓ７细胞，获得了ＴＮＦα暂时性表达。采用ＤＮＡ－磷酸钙共沉淀法，将ｐＺＩＰＴＮＦＤＮＡ导入了单向性逆转录病毒包装细胞ψ２，在Ｇ４１８选择下，克隆出了ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞系。该细胞可产生重组ＴＮＦ逆转录病毒。本研究利用ψ／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞分泌的重组逆转录病毒连续传代感染ψ２或ＰＡ３１７细胞以及病毒交替感染ψ２和ＰＡ３１７细胞，制备了高滴度单向和双向性重组ＴＮＦ逆转录病毒，其滴度可高达１．４×１０６，并发现获得的病毒滴度在传代感染的第３代达到高峰，随之趋于平衡。利用重组ＴＮＦ逆转录病毒感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，建立了３Ｔ３／ｐＺＩＰＴＮＦ细胞，该细胞的４８ｈ培养上清中可产生３２Ｕ／ｍＬ的ＴＮＦα。利用重组ＴＮＦ逆转录病毒直接感染ＮＩＨ３Ｔ３细胞后的４８ｈ培养上清中，ＴＮＦα活性也可达到８Ｕ／ｍＬ。实验还观察到３Ｔ３／ｐｚＩＰＴＮＦ细胞有自身生长抑制现象。本研究结果成功地实现了重组逆转录病毒介导的ＴＮＦα基因在哺乳动物细胞中的转移与表达，为进一步实施肿瘤基因治疗奠定了基础。

重组人αD型干扰素的纯化研究

αD型干扰素(IFN αD,亦称白细胞干扰素)具有广谱的抗病毒、抑制肿瘤细胞及免疫调节等多种重要的生物活性。现行的IFN αD纯化工艺存在着纯化效率低、时间长、影响因素多等不足。本研究建立了新的纯化工艺流程。该工艺将制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳,放在了阴离子纤维素层析之前,并省略了阳离子纤维素层析的步骤。

腺病毒滴度不同测定方法比较

目的将目前测定腺病毒滴度常用的OD260法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法、细胞病变(CPE)法进行比较研究,分析和讨论各种方法的优缺点。方法 4种重组腺病毒(Ad-G-AT2R-EGFP、Ad–CMV-EGFP、Ad-mif-shRNA-EGFP和Ad-CBA-GFP)扩增、纯化后,同时分别用OD260值法、荧光定量PCR法、绿色荧光蛋白标记法、壳蛋白免疫法及CPE法测定病毒滴度,并以壳蛋白免疫法测定结果作为标准,对各种方法所得结果进行比较研究。结果绿色荧光蛋白标记法、CPE法与壳蛋白免疫法同时测定4种腺病毒滴度,其结果无统计学差异(P>0.1)。荧光定量PCR法测定值明显高于壳蛋白免疫法(P<0.05),但与该法测定结果间存在良好的相关性(r=0.965),约为壳蛋白免疫法所测得结果的10倍。OD260法测得结果与壳蛋白免疫法测得结果间则无相关性。结论绿色荧光蛋白标记法与壳蛋白免疫法是测定腺病毒感染性滴度最为快速有效的方法,其结果客观可靠,能真实地反映病毒的实际感染力。荧光定量PCR法测定结果反映的是完整的病毒颗粒数,能够间接反映病毒的感染力,且该方法操作简单,耗时短,同样有较高的实用性。

中国旋毛虫分离株成虫和新生幼虫基因文库的构建及筛选

利用λＺＡＰⅡ载体构建了中国分离株Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌａｓｐｉｒａｌｉｓ及Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌａｎａｔｉｖａ成虫和新生幼虫ｃＤ－ＮＡ基因文库，检测结果表明，所克隆的ｃＤＮＡ片段分布在０．２～２．０ｋｂ之间，表明２个ｃＤＮＡ基因文库对ｍＲＮＡ的覆盖面很大。利用ＲＡＰＤ技术，以肌幼虫基因文库作对照，采用７０个单引物及２０对复合引物对以上２个文库进行筛选扩增，结果：（１）共获得２条Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ及４条Ｔ．ｎａｔｉｖａ的成虫与新生幼虫特异性基因片段，鉴于成虫与新生幼虫是旋毛虫的２个侵袭性阶段，其所特有的特异性基因片段极有可能就是这２个时期虫体的侵袭性因子基因，即所要寻找的强保护性抗原基因，从而为后续研究奠定了基础；（２）发现１条Ｔ．ｓｐｉｒａｌｉｓ种特有的基因片段，这一特异性基因片段为虫种鉴定提供了物质条件；（３）发现旋毛虫同种不同分离株（中国分离株及法国分离株）间ｃＤＮＡ文库扩增图谱完全相同。

核心抗体阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染分子生物学特性及追踪结果的研究

目的了解我国核心抗体阳性合格献血者隐匿性乙肝病毒感染(OBI)情况,分析血清学和分子生物性特征。方法对HBs Ag(-)、NAT检测无反应性的合格献血者血浆,进行乙肝两对半检测和anti-HBs定量检测,对核心抗体阳性标本进行病毒核酸提取,和BCP/PC区及S区巢式PCR扩增,对扩增结果阳性产物纯化后进行基因测序及序列分析,同时进行QPCR定量检测。对HBV DNA阳性的献血者进行追踪检测和分析。结果在1 033名合格献血者中,抗-HBc(+)占47.4%,阳性率随年龄的增长而增加(P<0.001),30岁以下年龄组为32.6%而到50岁以上年龄组为为69.8%。777/1033为抗-HBs(+),占75.2%。在抗-HBc(+)人群中共检出14例HBV DNA(+),其中7例抗-HBs滴度在100 IU/L以上,在抗-HBc(+)合格献血者中OBI阳性率为2.86%。8/14例OBI为B型,1例为C型。7/14能追踪的标本中,1例发现抗-HBe血清转换为阳性。所有追踪标本的病毒均变成检不出。5例BCP/PC区序列发生突变,3例S区氨基酸变异。结论经HBs Ag及NAT检测合格的抗-HBc(+)献血者,其血液中仍有一定几率含有HBV DNA,存在经输血传播病毒的威胁,提示在乙肝高流行地区需进一步提高核酸检测方法的灵敏度,必要时可增加抗-HBc的检测。

输血医学专业高等教育模式的探索

目的高质量输血医学学历教育是培养专业人才基本素质,进而提升输血医学行业服务质量与水平的根本保障。方法以南方医科大学临床医学5年本科专业资源为依托,结合高质量的国内与国际输血医学教育资源,有计划、有目标、分阶段、分层次地开展先进理念的教学模式,特别吸收发达国家的先进知识与技术,补充专业教学内容,突出先进性,提高教学质量,改善输血医学专业学生知识结构。建立教学效果评价制度,以保证课程水平和教学质量的重要环节。结果从全校公共基础课入手,注重临床专业课程(执业医师考试科目)与生物技术专业课程的结合,遴选26门课程进行学习;强化4门输血医学专业主干课程进行重点建设,使得核心课程模块可以满足输血医学相关领域中临床型和技术型两类人才培养的有机结合。挖掘国内优秀资源,聘请血液中心、医院输血科和研究机构的专家,结合各自优势整合在输血医学专业课中,开展专题内容讲授。同时,聘请美国耶鲁大学医学院输血医学领域著名专家,以远程教学模块形式,在《输血技术学》和《临床输血学》的课程之上,独立地开展新知识和新技术的教学工作。理论课程实施以知识点为模块,联系基础、拓展应用的构建模式,在选修课模块中,根据大学生文化素质教育的具体要求,从校50多门文化素质教育课程中遴选出10门课,以带动我校输血医学专业教学水平的整体提高。实验课程设计了自主设计性实验和综合设计性实验。实践教学以培养输血医师和输血技师为基本目标,安排学生在教学医院进行42周的临床实习和10周的血液中心(血站)技能实习。结论明确南方医科大学输血医学专业为临床医学的一个方向,最大限度促进了专业教育国际化进程,初步制定了符合我国输血医学专业岗位需求的输血医学本科高等教育方案,使毕业生获得考取临床医师执照资格的专业知识与技能,具备输血医师的临床输血治疗或指导合理用血能力,以及输血技师的专业背景和特长,进而适应日益提高的输血医学岗位或继续教育要求。

鳗鱼“狂游病”病原学研究

对近两年在我国福建省等地养殖的鳗鱼暴发流行的一种不明病因的疾病（俗称“狂游病”），通过寄生虫学、细菌学、病毒学检查，以及人工感染回归试验，确认其病原为鳗冠状病毒样病毒。该病毒主要侵害鳗鱼的肝脏、肾脏和心脏，导致这些器官的实质细胞呈现变性。

广东阳江地区隐匿性乙型肝炎病毒检出率与分子生物学特性分析

目的调查和分析广东省阳江地区人群的隐匿性乙型肝炎病毒感染(OBI)的检出率与分子生物学特征。方法随机收集广东阳江地区非肝脏性疾病住院患者和健康人群HBsAg阴性血清标本138(人)份,采用巢式聚合酶链反应(Nested-PCR)扩增标本中HBV BCP/PC DNA片段(核苷酸序列区间位nt1679—1973)并测定序列;采用荧光定量聚合酶链反应(QPCR)测定OBI病毒载量。结果在138人(份)HBsAg阴性血清标本中,29份为HBV DNA阳性,确认为OBI,其病毒载量介于不可定量(<1IU/ml)至1008.9IU/ml之间,中位数(M)为8.8IU/ml;抗-HBc阳性健康人群中OBI的检出率名显高于其他HBV血清学标记阳性的标本(P<0.05)。29份OBI标本中有19份的BCP/PC序列出现变异,3份出现缺失,1份出现G1896A/G1899A双位点变异,1份出现G1764A变异;10份标本在CURS和Enh2调控区发生变异。结论阳江地区健康人群的OBI检出率较高,OBI的产生及其低病毒载量存在可能与病毒核心蛋白(C)调控区序列变异相关。

联合分析HCV种属信息区和高度保守区序列确定广东地区HCV基因型和亚型

目的扩增HCV种属信息区NS5B和高度保守区5-UTR基因序列,用系统进化树法深入分析HCV基因型和亚型,阐明广东地区丙型肝炎患者HCV基因型和基因亚型的特点。方法采集99例慢性丙型肝炎病例血清,应用RT-PCR技术分别扩增HCVNS5B区和5-UTR特定片段,测序后进行系统进化树分析,确定HCV基因型及亚型。结果99例患者标本均准确分型,其中NS5B区段分型74例,5-UTR区段分型99例。HCV基因型和亚型的分布:1a亚型1例、1b亚型59例、1型7例、2a亚型11例、3a亚型3例、3b亚型2例、3型3例、6a亚型13例;另有2例标本在两区段分型不同,5-UTR/NS5B区段分型分别为6a/1b和3a/1b。两区段共同分型74例,72例标本在两区段基因型一致,2例标本在两区段基因型不同,为HCV重组体。结论联合分析HCV不同区段基因序列,可提高HCV基因分型的准确度及灵敏性。广东地区慢性丙型肝炎患者HCV基因亚型分布以1b为主;其次为6a和2a;3型中的a、b亚型也占有一定比例。

深圳地区无偿献血人群隐匿性乙型肝炎病毒感染血清学和分子生物学特征分析

目的了解深圳地区无偿献血人群中隐匿性乙型肝炎病毒（OBI）感染情况，分析无偿献血者中OBI的BCP／PC区和S区变异特征。方法应用ELISA和NAT方法筛查深圳地区84865（人）份无偿献血者血液标本，对HBsAg－／HBVDNA＋标本做BCP／PC、S区及全基因序列巢武－PCR扩增以及病毒载量的测定，对检测的病毒序列做基因分型和与HBV野毒株序列比对分析。结果深圳地区无偿献血者HBsAg－／HBVDNA＋检测率为1：2652（32／84865），这类标本的ALT均正常（〈40）；其中OBI检出率为1：3031（28／84865），28例OBI中22例为B基因型、4例为C基因型、2例未能确定基因型。OBI血清型分类中21例为adw、4例为adr、1例为ayr、2例未确定。所有OBI标本的病毒载量为〈10～1701（中位数116）IU／mL。BCP／PC区有35．7％（10／28）的标本出现G1896A突变，B型标本在MHR第1个袢状结构区（aa124-aa137）氨基酸的置换频繁。结论深圳地区无偿献血者中存在着相对较高的OBI；其OBI标本中BCP／PC区的碱基突变以及B型的主要亲水区（MHR）氨基酸的置换可能是其发生发展的机制之一。

对虾副粘病毒样病毒的细胞分离培养

选用鲤鱼上皮乳状瘤细胞（ＥＰＣ）和虹鳟肝细胞（Ｒ１），对新发现的对虾暴发流行病病原副粘病毒样病毒进行了细胞分离与培养。结果证实对虾副粘病毒样病毒可在这２种鱼类传代细胞中复制，其中ＥＰＣ培养的病毒粒子的滴度在１０８／ｍＬ以上。

深圳献血者中HCV感染自然清除与病毒血症特征分析

目的测定我国深圳地区献血者中的丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染者自然清除和病毒血症,即自然康复与慢性感染者比率及其人群特征,为丙型肝炎防治研究提供数据。方法对深圳献血者中抗-HCV初筛阳性的血清标本采用2种EIA方法进行抗体再测定,以定量PCR方法测定病毒载量,并采用巢式PCR对核酸进行确认,进而将标本分为3种HCV感染状态,即病毒自然清除(RNA-/Ab+)、病毒血症(RNA+/Ab+)和假阳性(RNA-/Ab-),通过统计学方法分析3种感染状态献血者在临床信息(性别、年龄)、ALT、抗-HCV的差异。HCV RNA阳性标本通过分析5'-NCR序列进行基因分型。结果 152份初筛抗-HCV阳性的标本中,病毒自然清除标本45份、病毒血症51份、假阳性56份。50份HCV定量PCR阳性标本病毒载量范围从[(12.6～2.43)×106]IU/ml(中位值2.54×104IU/ml)。36份进行基因分型的标本包括47.2%基因1型、5.6%基因2型、19.4%基因3型和27.8%基因6型。慢性感染组标本的年龄及抗-HCV水平(S/CO值)显著高于病毒自然清除和假阳性组(χ2=7.812,P<0.05;χ2=90.865,P<0.01)。结论深圳地区献血者HCV感染病毒自然清除率约为46.9%。HCV基因型中1型为主要,6型也占有较高比例。年龄小、女性献血者更易于自然清除病毒。病毒血症即慢性感染者HCV抗体水平显著升高,其在HCV自然康复过程中的作用还有待进一步研究。

我国首届输血医学本科毕业生培养情况分析

本文通过对南方医科大学输血医学专业首届本科生培养概况及毕业就业情况的介绍和分析,展示了结合输血医学领域各类单位和部门需求设置的临床医学(输血医学方向)本科专业,不但适应了社会发展的需要,而且其毕业生在近几年相对其他行业有较好的就业前景。同时也说明由于目前我国输血医学高等教育还比较落后,因而需优化输血医学本科生的培养方案,进一步提高毕业生质量,促使输血医学专业更健康、快速地发展,从而为我国输血医学行业进步提供人力资源保障。

输血医学实践技能教学初步探讨

随着全球对安全使用血液的关注,对专业输血人员的需求越来越多。美国医院现在开展的输血医学相关服务项目包括：输血临床指导、临床供血、输血,机采治疗,细胞治疗,组织治疗。且每个医院都需有临床输血医师指导。目前,我国输血从业者现状是工作人员组成主要为输血技术人员,

基因探针和PCR对鲤吉陶单极虫的检测

采用液氮冷冻研磨法破碎吉陶单极虫（Ｔｈｅｌｏｈａｎｅｌｕｓｋｉｔａｕｅｉ）孢子，按常规法提取其基因组ＤＮＡ。取ＤＮＡＥｃｏＲＩ消化产物，采用低熔点琼脂糖回收法制备大（３．０～１５．０ｋｂ）、小（０．５～３．０ｋｂ）片段，将其克隆于ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔｋｓＥｃｏＲＩ位点，经α－互补现象、酶切鉴定和虫体ＤＮＡ生物素标记探针筛选，构建了含２３个克隆的基因文库，克隆片段介于０．９～６．８ｋｂ之间；经阳性克隆标记筛选及特性分析，制备了长度为０．９ｋｂ（１９号质粒克隆片段）的探针，该探针具有较强的敏感性和特异性。对该探针两端ＤＮＡ序列进行分析，设计出１对引物。上游引物序列为：５′ＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＧＣＡＣＡＡＣＡＡＧ３′，下游引物序列为：５′ＴＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧ－ＴＡＴＣＧＣＴＧＣ３′。

西尼罗病毒E蛋白结构域Ⅲ在昆虫S2细胞中的表达与鉴定

根据GenBank中发表的西尼罗病毒(WNV)E domainⅢ基因序列设计1对引物,用PCR方法扩增domainⅢ基因片段,回收目的基因片段定向克隆入果蝇表达载体pMT/B/V5,构建重组表达载体pMT-DⅢ。测序验证正确后,用脂质体转染法与辅助质粒pCoBlast共转染果蝇S2细胞,通过Blasticidin进行加压筛选,获得了抗性细胞S2-DⅢ。提取S2-DⅢ细胞的基因组DNA,用PCR方法检测目的基因在果蝇S2细胞中的整合与表达。用硫酸铜溶液诱导表达,收集无血清的细胞表达上清,样品浓缩后进行SDS-PAGE及Western blotting鉴定。结果表明,研究成功构建了重组表达载体pMT-DⅢ,转染细胞经12mg/L的Blasticidin筛选及鉴定后获得了稳定表达WNV E do-mainⅢ蛋白的果蝇S2细胞株。