结核分枝杆菌Rv2673基因过表达对分枝杆菌细胞壁组分的影响

目的分析结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)Rv2673基因过表达对分枝杆菌细胞壁组分的影响。方法构建Rv2673在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis,Msm)中的表达载体,导入到Msm后提取膜蛋白,以抗组胺酸标签的单克隆抗体鉴定表达的Rv2673蛋白。细菌培养时加入^(14)C-葡萄糖,收获Msm后分别以氯仿∶甲醇(2∶1)、氯仿∶甲醇∶水(10∶10∶3)、ε-soak-lovolunnee试剂分步提取全细胞的细胞壁组分,其余的沉淀则用以提取LAM。以HP-TLC及SDS-PAGE方法分离提取的组分,放射自显影。结果生物信息学分析表明Rv2673蛋白为在羧基末端具有8次跨膜结构的膜蛋白;Western bloting方法检测到过表达Rv2673的菌株膜蛋白中具有表达的Rv2673蛋白。TLC方法对细胞壁组分的分步分析表明过表达Rv2673的菌株及其对照菌株间DPA、DPM、Ac2PIM2、AcPIM2和Ac2PIM4/AcPIM4等小分子脂溶性分子没有显著性差异,但Western blot分析的细胞壁中大分子脂类组分显示,Rv2673具有显著性促进Ac2PIM6和AcPIM6生成的作用,以及促进LM转变为LAM。推测Rv2673蛋白能促进大分子脂类分子的生物合成,但对细胞壁中小分子的脂类分子无显著影响。结论 Rv2673参与LAM中阿拉伯聚糖分枝结构的形成,推测Rv2673蛋白对细菌感染宿主细胞及/或宿主细胞杀死Mtb有一定影响,是有发展潜力的药物靶向分子。

结核分枝杆菌DdlA多克隆抗体的制备与鉴定

目的制备并鉴定参与结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)细胞壁中肽聚糖合成与成熟的D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(D-Alanyl-D-Alanine ligase,DdlA)多克隆抗体,并检测其效价。方法在NCBT数据中检索获取Rv2981c基因(ddlA)序列信息并构建其表达载体pColdⅡ-Tb-ddlA,在大肠埃希菌表达体系中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导DdlA蛋白表达,以琼脂糖树脂(Ni-NTA)亲和层析纯化后免疫BALB/c雌鼠,制备抗DdlA多克隆抗体。通过ELISA检测其效价,Western blot分析抗体特异性。结果成功获得可溶性表达分子质量约为40 ku的DdlA蛋白,免疫小鼠后制备的抗DdlA多克隆抗体ELISA效价为1∶2000;Western blot检测该抗体能识别分枝杆菌内源性的DdlA蛋白。结论成功制备了抗DdlA蛋白多克隆抗体。该抗体具有特异性且效价高,为研究其在结核分枝杆菌致病中的作用和筛选靶向DdlA抑制剂奠定了基础。