济南地区献血者中人疱疹病毒8型(HHV-8)IgG抗体的检测及相关危险因素分析

目的:了解人疱疹病毒8型(HHV-8)在济南地区不同献血者中的感染情况,并对其与年龄、性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性进行统计学分析。方法:以HHV-8 ORF K8.1合成多肽为抗原,采用ELISA方法检测献血者血清中相应IgG水平。结果:520份血清中抗HHV-8 ORFK8.1抗体的总体检出率为5.962%(31/520),有随年龄增加而增高的趋势,但与性别、HBV、HCV、梅毒螺旋体的相关性无统计学意义。结论:济南地区献血者中有一定比率的HHV-8感染。采取措施,防止HHV-8经输血传播具有一定的现实意义。

整合课程“感染免疫与相关疾病”的带教体会

为了适应医学教育改革的发展趋势,加强学生的自主学习能力和分析解决问题能力的培养,山东大学医学院构建了系列整合课程体系。其中"感染免疫与相关疾病"将医学免疫学、医学微生物学、人体寄生虫学、传染病学以及药理学(抗生素)、病理学(传染病病理)等关联较密切的学科内容进行有机整合,采取课堂教学、PBL、实验教学、临床见习相结合的教学方式,目前已开设近三年,在主动学习和分析解决问题的能力培养以及临床思维方式的培养等方面取得了优于传统教学模式的良好教学效果。文章着重讨论带教过程中遇到的问题及体会。

医学微生物学实验教学改革的体会

为了适应新世纪对高素质人才的要求,在医学微生物学的实验教学中就如何激发学生的学习兴趣、培养学生的创新能力等进行了一些改革和探索.文章从实验室建设、实验内容以及教学方法方面进行了阐述.

HPV16L1 ORF的基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 :获得足够量的人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)L1融合蛋白及含HPV 16L1ORF序列的基因重组体。方法 :通过PCR扩增获得HPV16L1基因片段 ,将此片段插入原核细胞表达载体pGEMEX 1,构建相应的重组表达质粒 pGEMEX L1,将此质粒转化大肠杆菌JM 10 9(DE3) ,得到的转化子经IPTG诱导表达后进行菌体蛋白的Westernblotting免疫印迹分析。结果 :HPV16L1基因重组体构建成功 ,克隆的目的基因片段在大肠杆菌中产生的融合表达产物在Westernblotting检测中具有和抗HPV16L1阳性血清反应的抗原性。结论 :HPV16L1基因片段可在大肠杆菌中得到有效表达 。

人乳头瘤病毒HPV16L1-E7C重组质粒的构建及其细胞的免疫性

目的:构建HPV16L1-E7C重组质粒并研究其细胞免疫性。方法:利用基因克隆技术将HPV16L1-E7CDNA片段定向插入pcDNA3.1载体,构建重组质粒pcDNA16L1-E7C,然后将其免疫C57BL/6小鼠,利用T淋巴细胞增殖试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖能力,同时利用ELISA试验检测免疫小鼠的脾淋巴细胞分泌γ-干扰素(IFN-γ)的水平。结果:特异性T细胞增殖试验中实验组3H-TdR掺入率为18339±1972,对照组为6737±1243,实验组小鼠T细胞增殖水平明显高于对照组(P<0.05)。DNA免疫后实验组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平为0.89±0.56,对照组为4.81±1.33,两者相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:重组质粒能增强小鼠的细胞免疫功能。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒的构建及免疫原性研究

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组腺病毒,为沙眼衣原体腺病毒疫苗的研究奠定基础。方法:根据Genebank中E型Ct MOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到MOMP基因片段,克隆至pcDNAII载体,测序后连接入腺病毒穿梭载体pDC316。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至HEK293细胞,在Cre-loxP重组酶作用下进行重组,包装成重组腺病毒颗粒,用PCR和RT-PCR方法进行鉴定。并用动物免疫试验检测重组腺病毒的免疫原性。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出约1.1 kb的特异MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实穿梭载体pDC316-MOMP构建正确。穿梭载体pDC316-MOMP与含腺病毒基因组的辅助质粒PBHGlox△E1,3Cre共转染至293细胞,出现明显细胞病变效应。收集重组腺病毒,PCR法证实重组腺病毒含有MOMP基因,RT-PCR证实重组腺病毒在293细胞能表达MOMP基因。重组腺病毒免疫小鼠可诱导特异性抗体产生,证明重组腺病毒具有良好免疫原性。结论:成功构建了E型沙眼衣原体MOMP基因重组腺病毒,该重组腺病毒可诱导小鼠产生特异性抗体。

人巨细胞病毒感染致血管内皮细胞损伤机制的研究

目的观察人巨细胞病毒(HCMV)感染对人血管内皮细胞氧化应激的影响及对血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)和糖基化终产物受体(RAGE)时序性表达的影响,研究HCMV感染致动脉粥样硬化(AS)的作用机制。方法用HCMV感染血管内皮细胞,用激光共聚焦显微镜检测细胞内活性氧(ROS)的改变;采用RT-PCR方法检测不同感染时段细胞VCAM-1及RAGEmRNA的表达。结果HCMV感染血管内皮细胞后,HCMV组荧光强度显著高于对照组(P<0.01)。感染0 h时,VCAM-1 mRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时达高峰,12 h开始回落,24 h回落更明显,与0 h比较,均有统计学意义(P<0.01),48 h接近0 h表达水平(P>0.05)。感染0 h时,RAGEmRNA有基础水平的表达,4 h开始升高,8 h时表达水平明显升高,随感染时间延长,表达量逐渐增高,感染24 h时达高峰,48 h开始回落,仍维持在较高的水平,各时段与0 h比较,均有统计学意义(P<0.01)。结论HCMV感染血管内皮细胞后能够增强氧化应激,促进VCAM-1及RAGE的mRNA表达,并且呈时间依赖性。HCMV有可能通过增强氧化应激、上调VCAM-1及RAGE的表达介导血管内皮细胞的炎症反应,促进动脉粥样硬化的发生、发展。

HPV_(16)L1-E7重组腺病毒载体疫苗免疫BALB/c小鼠的研究

目的:探讨人乳头瘤病毒16型L1-E7重组腺病毒载体疫苗的免疫效应。方法:①将rAd5HPV16L1-E7载体疫苗在293细胞中扩增后,以肌肉注射、腹腔注射、滴鼻和灌胃途径免疫小鼠,采用ELISA法测其血清IgG抗体水平;②制备脾细胞悬液,加入到96孔无菌培养板中,并分别加入rAd5HPV16L1-E7特异性蛋白和RPMI1640+10%胎牛血清,加入3H-TdR1μCi/孔,做T-细胞增殖实验;③取经过培养56h的培养液进行IFN-γ的测定。结果:不同途径免疫的BALB/c小鼠血清IgG抗体水平均高于对照组(P<0.05),但以肌注组产生抗体量最多,IFN-γ和T-细胞增殖亦高于对照组(P<0.05)。结论:rAd5HPV16L1-E7重组活病毒疫苗既能刺激T-细胞产生细胞介导的免疫应答,又能刺激B-细胞产生抗体介导的免疫应答,说明其具有很好的免疫原性。

SARS冠状病毒M基因片断在大肠杆菌中表达及其抗原性的研究

目的:获得纯的重组SARSCoVM蛋白,并初步测定重组蛋白的抗原性。方法:软件分析SARSCoVM蛋白富含免疫表位的片断,体外合成编码SARSCoVM蛋白15-170aa序列的DNA片段,利用DNA重组技术,将该合成DNA克隆至表达载体pGEX-5X-1,构建重组质粒pGEX-SARSCoVM。在大肠杆菌BL21中诱导表达GST-SARSCoVM重组融合蛋白,分离纯化GST-SARSCoVM蛋白,利用纯化蛋白作为抗原,建立ELISA试验检测抗SARSCoVM抗体。结果:GST-SARSCoVM蛋白分子量为43kD,纯化的GST-SARSCoVM蛋白作为抗原检测血清中SARSCoVM抗体,53例正常成人献血者血清未检出SARSCoVM抗体。结论:SARSCoVM蛋白表达成功,在健康人血清中未检出SARSCoVM抗体。

E型沙眼衣原体MOMP基因重组质粒的构建与表达

目的:构建E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)基因重组真核表达质粒pVAX1-MOMP,为探索安全的E型CtDNA疫苗奠定基础。方法:根据Genebank中E型CtMOMP基因序列设计引物,用高保真PCR方法从E型Ct基因组DNA中扩增得到约1.1kb的MOMP片段,克隆至pcDNAII载体,测序后亚克隆至表达载体pVAX1,构建卡那霉素抗性真核重组表达质粒pVAX1-MOMP,并以重组质粒转染COS-1细胞进行表达,用Westernblotting方法鉴定表达产物。结果:从E型Ct基因组DNA中扩增出特异的MOMP基因片段,酶切鉴定及DNA序列测定证实pVAX1-MOMP重组质粒构建正确,能在COS-1细胞内表达,表达产物能与抗MOMP单克隆抗体特异性结合。结论:成功构建E型沙眼衣原体MOMP真核表达质粒pVAX1-MOMP,并在真核细胞内获得表达。

HPV16L1-E7蛋白疫苗诱导小鼠产生抗体及细胞免疫应答的研究

目的 :探讨嵌合性病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白疫苗接种于动物体内诱发体液和细胞免疫反应的能力。方法 :以本室构建的HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗腹腔注射免疫BALB/c小鼠 ,在初次免疫后 ,分别于第 3、4、5周采血ELISA检测特异性抗体的产生。并耳皮下注射HPV1 6L1蛋白 ,检测特异性DHT反应。在末次免疫 2周后 ,取小鼠脾细胞 ,用HPV 1 6L1 E7蛋白刺激 ,检测T细胞增殖反应及血清IFN γ水平。结果 :HPV1 6L1 E7蛋白疫苗免疫小鼠可有效产生HPV1 6L1抗体及特异性DTH反应 ,加强免疫后 ,抗体水平升高 ,两者水平均高于对照组 (P <0 .0 1 )。HPV1 6L1 E7嵌合蛋白疫苗免疫后取小鼠脾细胞 ,在特异性HPV1 6L1 E7蛋白抗原刺激下 ,特异性T淋巴细胞明显增殖。被免疫小鼠血清中出现高水平IFN γ。结论 :嵌合病毒样颗粒HPV1 6L1 E7蛋白可诱导小鼠产生高滴度抗体、HPV1 6L1特异性TDH参与的超敏反应及细胞免疫应答的细胞因子 。

ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能

目的:建立一种简便的ELISPOT方法,用于检测和评价特异性抗体形成细胞的功能,并观察HPV16L1蛋白疫苗接种小鼠诱发体液免疫的效应。方法:将HPV16L1抗原或抗鼠IgG的俘获抗体包被在预先贴有硝酸纤维素膜的培养板微孔内,取被HPV16L1蛋白疫苗免疫的鼠脾细胞,经HPV16L1抗原刺激后加到微孔内,已固定的抗原/抗体可与细胞分泌出的抗体结合。再加入RAM-HRP标记的羊抗鼠IgG和沉淀性废物溶液(DAB),可在有HPV16L1特异抗体产生细胞的位置产生棕褐色的斑点,每个斑点代表一个分泌细胞。同时ELISA法检测血清与脾细胞上清液中HPV16L1特异性IgG水平。结果:免疫组HPV16L1特异性抗体生成细胞的频数明显高于对照组。结论:ELISPOT法较ELISA法更灵敏,HPV16L1疫苗可有效刺激小鼠产生特异性抗体。

利用重组HPV16L1抗原检测宫颈癌抗L1或VLP抗体的对比

为了评价重组大肠杆菌表达的HPV16L1蛋白和重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP两种抗原在检测宫颈癌抗 16L1或VLP抗体及在宫颈癌血清学诊断意义上的差别 ,应用PCR技术从宫颈癌组织的DNA中扩增出全长15 35bp的HPV16L1基因片段 ,克隆至 pUC18 T载体中 ,进行DNA测序鉴定。然后 ,将HPV16L1基因克隆至pGEX 2T表达载体中 ,并诱导表达HPV16L1融合蛋白 ,分子量为 83kD ,能被HPV16L1单克隆抗体所识别。经GST柱层析法纯化后 ,与重组腺病毒表达的HPV16L1 VLP分别经酶联免疫吸附 (ELISA)法检测 12份宫颈癌患者和 35份献血员血清。 12例宫颈癌血清标本中 ,抗HPV16L1蛋白的抗体阳性率为 7例 (占 5 8.3% ) ;抗HPV16L1 VLP的抗体阳性率为 8例 (占 6 6 .7% )。经大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1检测为HPV16抗体IgG(+)的 7份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测均阳性 ;经大肠杆菌表达的重组抗原检测为HPV16抗体IgG( )的 5份患者血清 ,利用HPV16L1 VLP试剂盒检测有 1份阳性。两者对HPV16抗体的阳性检出率并无显著差异 (P >0 .0 5 )。本实验结果说明HPV16与宫颈癌高度相关 ,利用大肠杆菌表达的重组抗原HPV16L1和HPV16L1 VLP重组抗原检测抗体的敏感性并不受影响。利用重组抗原HPV16L1对宫颈癌的抗体进行定性。

中国妇女宫颈癌中HPV16E6基因序列分析及分子克隆

人乳头瘤病毒16型（Humanpapillomavirustype16，HPV16）感染与宫颈癌的发生有密切关系。研究发现，HPVI6早期蛋白E6是肿瘤相关抗原，可在HI，V相关肿瘤中持续表达，为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位。但也有文献报道，宫颈癌中HPVI6E6基因可有一定的变异性，...

山东地区汉坦病毒重要基因序列进化关系的研究

目的 :研究山东地区汉坦病毒的基因型分布。方法 :应用RT -PCR法和直接核酸测序法 ,对来源于山东省 11个肾综合征出血热流行地区的患者中获得的 31份汉坦病毒部分M基因片段进行了扩增和测序。结果 :核苷酸序列的同源性及系统发生树分析表明 ,山东地区SEO型汉坦病毒至少存在 4个不同亚型 ,HTN型汉坦病毒至少发现有 4个分支 ,不同HTN型汉坦病毒亚型间的核苷酸序列的差异达 13.0 %～2 2 .7% ,而不同SEO型汉坦病毒分支间相对保守 ,差异仅 5 .0 %～ 7.7%。结论 :山东地区存在汉坦病毒的不同的基因亚型 ,这一发现将促进汉坦病毒流行规律。

GM-CSF增强HPV16DNA疫苗免疫效果的研究

目的 :探讨GM CSF增强HPV16E6cDNA疫苗免疫效应的作用。方法 :①将C5 7BL 6小鼠 18只分为 1、2、33个组。DNA免疫前 ,每只小鼠胫骨前肌注射 0 .2 5 %的布比卡因 10 0 μl,2 4h后 ,1组注射pcDNA3.1为对照组 ;2组注射pcDNA3.1E6c ;3组注射pcDNA3.1E6c +GM CSF ,2周后加强免疫 1次 ;②加强免疫 2周后 ,取小鼠脾脏及血清进行免疫功能测定。结果 :①T细胞增殖实验结果 :3 H TdR掺入率 :1组为6 736 ,2组为 15 732 ,3组为 2 6 95 9,2组比 1组提高了 133.5 % ,3组比 1组提高了 2 78.7%、比 2组提高了71.4 % ,经t检验表明 ,3组间的两两比较差异均有统计学意义 ,P <0 .0 1;②E6CTL表位合成肽特异性刺激后IFN γ的产量 :1组无IFN γ产生 ,2组为 6 2 4 .8,3组为 832 .9,3组比 2组提高了 33.3% ,经t检验表明 ,两组间差异有统计学意义 ,P <0 .0 1;③特异性抗体的产生 :1组为 0 .0 4 2 33,2组为 0 .4 5 75 ,3组为 0 .812 5 ,2组是1组的 9.8倍 ,3组是 1组的 18.2倍 ,3组比 2组提高了 77.6 %。经t检验表明 ,3组间的两两比较差异均有统计学意义 ,P <0 .0 1。结论 :GM CSF可有效的提高HPV16E6cDNA疫苗的细胞和体液免疫效应。

干扰素诱导蛋白IFI16与HPV16E6、E7蛋白相互作用的研究

目的:研究人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus熏HPV)16型E6、E7蛋白与干扰素诱导蛋白IFI16的相互作用,初步揭示IFI16拮抗HPV16E6、E7致瘤活性的分子机制。方法:(1)体外GST阻滞分析:克隆、表达及纯化GST鄄HPV16E6和GST鄄HPV16E7融合蛋白,将含有IFI16蛋白的EB病毒阴性伯基特淋巴瘤穴BJAB雪细胞提取物与上述纯化蛋白孵育,通过WesternBlotting分析蛋白质的体外相互作用;(2)免疫共沉淀分析:构建表达His鄄HPV16E6蛋白的真核表达载体,将表达有IFI16和His鄄HPV16E6蛋白的293T细胞裂解物与抗His抗体孵育,用IFI16抗体检测共沉淀蛋白复合物中IFI16蛋白的存在;将表达有IFI16和HPV16E7蛋白的CaSki和SiHa细胞裂解物与HPV16E7抗体孵育,检测共沉淀蛋白复合物中E7与IFI16是否结合。结果:成功构建了原核表达质粒pGEX鄄4T/HPV16E6及pGEX鄄4T/HPV16E7,并表达、纯化获得GST鄄HPV16E6及GST鄄HPV16E7融合蛋白。体外GST阻滞分析结果表明,用IFI16单抗做WesternBlotting分析可检测到复合物中IFI16蛋白,表明GST鄄HPV16E6和GST鄄HPV16E7均可与IFI16蛋白结合。免疫共沉淀分析进一步证实,共沉淀蛋白复合物中也可检测到IFI16蛋白,证明在细胞中HPV16E6和E7蛋白也能与IFI16蛋白结合。结论:无论在体外还是在细胞中,抑瘤因子IFI16蛋白均能特?

HPV16 L1-E7重组腺病毒rAd5 HPV16 L1-E7的构建及克隆表达

目的 :研制人乳头瘤病毒 16型 (HPV16)L1 E7重组腺病毒 ,以期获得防治宫颈癌的重组腺病毒减毒活疫苗和嵌合病毒样颗粒疫苗。方法 :以HPV16型野毒株HPV16 114/K为模板 ,利用PCR克隆技术构建可表达HPV16主要衣壳蛋白L1( 1 30 1aa)和转化蛋白E7( 1 60aa)融合基因的重组质粒 pUC19L1 E7,HPV16L1 E7DNA片段经质粒 pBSL1 E7转入腺病毒Ad5穿梭质粒 pCA14L1 E7,与腺病毒质粒pBHG10 共转染 2 93细胞 ,制备重组腺病毒rAd5HPV16L1 E7,密度梯度超速离心纯化HPV16嵌合L1 E7VLP。结果 :成功构建了HPV16L1 E7重组质粒 pUC19L1 E7,制备HPV16L1 E7重组腺病毒rAd5HPV 16L1 E7,HPV16L1 E7融合蛋白可在 2 93细胞中高效表达 ,可达细胞总蛋白的 10 %以上 ,并装配成嵌合病毒样颗粒 (cVLP)。结论 :成功制备了可高效表达HPV16L1 E7嵌合L1 E7VLP的重组腺病毒rAd5HPV 16L1 E7载体疫苗 ,为HPV重组腺病毒疫苗用于宫颈癌的防治打下了基础。构建的 pUC19L1载体可以比较方便的插入外源基因 ,用来构建多价疫苗 。

七年制医学微生物学实验教学改革的初探

医学微生物学是一门实验科学,实验技术是其不可缺少组成部分.它不仅是学生了解和掌握微生物学实验基本方法和操作技术的一个学习过程,也为学生进一步深入学习其他生命科学特别是分子生物学实验技术奠定基础.本课程在细菌学、病毒学及特微等方面培养学生基本实验方法及技能,包括:显微镜的适当使用,怎样制片染色,无菌技术转移和接种细菌,选择各种各样培养基接种分离并鉴定细菌、细胞培养、病毒分离鉴定等.通过学习能加深学生对微生物学基本理论知识的理解与认识,提高观察、思考、分析和解决问题的能力.我们从七年制微生物学实验教学改革入手,着重提高实验教学质量,加强学生能力及综合素质培养.