ADAMDEC1通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的生长和转移

目的:探究敲减解整联蛋白及金属蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)结构域样癸蛋白1(ADAM domain-like decysin 1,ADAMDEC1)对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法:利用GEPIA和UALCAN在线数据库对ADAMDEC1在胰腺癌组织中的表达情况进行分析。Western blot检测人胰腺癌细胞系(MIA PaCa-2和PANC-1)和胰腺导管细胞系(hTERT-HPNE)中ADAMDEC1的蛋白表达水平。采用CCK-8实验、集落形成实验、细胞划痕实验和Transwell实验检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;Western blot检测敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞中迁移、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达水平的影响。此外,通过恢复性实验,检测Wnt/β-catenin信号通路激动剂CHIR-99021对敲减ADAMDEC1抑制胰腺癌细胞生长和转移作用的影响。结果:(1)ADAMDEC1在胰腺癌中高表达;(2)敲减ADAMDEC1表达后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力显著下降;(3)敲减ADAMDEC1后,E-cadherin蛋白表达增加,而基质金属蛋白酶9、N-cadherin和vimentin蛋白表达减少,Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达亦减少;(4)CHIR-99021与ADAMDEC1小干扰RNA共处理胰腺癌细胞,可逆转敲减ADAMDEC1对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。结论:ADAMDEC1在胰腺癌中高表达,可通过Wnt/β-catenin信号通路调控胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响

旨在研究马立克病病毒(Marek′s disease virus,MDV)编码的mdv1-miR-M4-5p对MDCC-MSB1细胞增殖和凋亡的影响,将mdv1-miR-M4-5p模拟物、抑制物及其阴性对照转染MDCC-MSB1细胞后48 h,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相关分子的转录;CCK-8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期和凋亡。结果显示:与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p模拟物转染显著上调MDCC-MSB1细胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的转录水平,下调TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表达转录,促进细胞的增殖,减少G1期细胞,增加S和G2细胞,降低细胞凋亡率。与对照组相比,mdv1-miR-M4-5p抑制物转染后MDCC-MSB1细胞的增殖、凋亡及其相关分子转录的结果与mdv1-miR-M4-5p模拟物转染后的结果相反。综上,Mdv1-miR-M4-5p可促进MDCC-MSB1细胞增殖,抑制其凋亡,这可能是通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路来实现的。

ZFP36L1对胰腺癌细胞生长调控的机制研究

目的:探究锌指蛋白36样蛋白1(ZFP36L1)对胰腺癌细胞生长的影响及其调控机制。方法:在线网站UALCAN和GEPIA分析ZFP36L1在胰腺癌中的表达及其表达变化与胰腺癌患者不良预后的相关性。Western blot检测ZFP36L1在胰腺导管细胞(HPNE)和3种不同胰腺癌细胞中的蛋白表达情况。CCK-8和集落形成实验检测ZFP36L1过表达及干扰对胰腺癌细胞增殖的影响;细胞划痕和Transwell实验检测ZFP36L1表达变化对胰腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;流式细胞术分析ZFP36L1表达变化对胰腺癌细胞周期的影响。生物信息学分析ZFP36L1的互作蛋白;Co-IP检测ZFP36L1与丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)间的相互作用;Western blot检测过表达ZFP36L1对p38 MAPK信号通路相关蛋白表达及磷酸化的影响;回复实验检测过表达MAPK14在ZFP36L1调控胰腺癌细胞功能中的影响。结果:(1)ZFP36L1在胰腺癌中高表达,与胰腺癌患者不良预后正相关;与HPNE相比,ZFP36L1在MIA PaCa-2和ASPC-1胰腺癌细胞中的表达水平较高,在PANC-1胰腺癌细胞中的表达水平相对较低;(2)过表达ZFP36L1后,PANC-1和MIA PaCa-2细胞活力、集落形成、迁移和侵袭能力显著增加,干扰ZFP36L1表达则获得相反的结果;(3)细胞生长调控过程中ZFP36L1可促进胰腺癌细胞进入S期;(4)ZFP36L1可与MAPK14相互作用调控胰腺癌细胞生长,过表达MAPK14可逆转ZFP36L1过表达诱导的胰腺癌细胞活力和细胞迁移能力增加,使ZFP36L1敲降胰腺癌细胞的活力和迁移能力进一步下降。结论:ZFP36L1是潜在的胰腺癌促进蛋白,可通过细胞周期调控及与MAPK14互作调控胰腺癌细胞的生长。

黏病毒抗性蛋白A(MxA)通过增强干扰素刺激应答元件(ISRE)活性诱导HepG2细胞干扰素刺激基因表达

目的研究黏病毒抗性蛋白A(MxA)对HepG2细胞Janus激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)途径的影响。方法采用pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2细胞,免疫荧光细胞化学染色检测MxA蛋白在HepG2细胞的表达和定位,Western blot法检测MxA蛋白表达;采用MxA小干涉RNA(si-MxA)转染HepG2细胞并以α干扰素(IFN-α)处理细胞,实时荧光定量PCR检测HepG2细胞黏液病毒抗性蛋白A(MxA)、蛋白激酶R(PKR)和寡聚腺苷酸合成酶(OAS)的mRNA表达,Western blot法检测MxA、PKR、OAS、细胞信号转导子与转录激活子1(STAT1)、磷酸化的STAT1(p-STAT1)、STAT2、p-STAT2和干扰素调节因子9(IRF9)的蛋白表达。此外,pcDNA3.1-Flag-MxA与pISRE-TA-luc分别共转染至HepG2和HepG2.2.15细胞,荧光素酶活性检测干扰素刺激应答元件(ISRE)活性。结果MxA蛋白在HepG2细胞质和细胞核均有表达且细胞质表达量高于胞核。敲低HepG2细胞中MxA表达虽不影响IFN-α诱导的STAT1、p-STAT1、STAT2、p-STAT2和IRF9蛋白的表达,但显著降低抗病毒蛋白PKR和OAS的表达。过表达MxA的HepG2细胞ISRE活性增强且PKR和OAS蛋白表达增高,但这种效应却在HepG2.2.15细胞中被抑制。结论MxA通过增强JAK/STAT信号通路ISRE活性诱导抗病毒蛋白表达。

COL4A1在胆管癌中的表达分析

目的探究胆管癌发生发展的分子机制。方法在GEO数据库中下载数据集GSE89749,并依次进行差异基因分析、GO/KEGG富集分析和蛋白-蛋白网络(PPI)分析以得到关键基因。TCGA数据库中分析COL4A1在肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌和乳腺浸润癌等16种癌症的基因表达情况。结果差异基因和GO/KEGG富集分析显示差异基因被显著富集在含胶原蛋白的细胞外基质。PPI分析结果显示基因胶原IVα1基因(COL4A1)为关键基因。COL4A1基因在胆管癌、结直肠癌和食管癌等8种癌症中高表达。结论COL4A1在胆管癌组织中显著高表达,这为探究胆管癌发生发展的分子机制提供了新的角度和实验基础。

NHP2调控肝癌细胞衰老机制的生物信息学分析

为了探讨核糖核蛋白NHP2在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达情况,了解其与疾病进展与预后的关系,通过Quick Go、GEPIA 2在线数据库筛选HCC细胞衰老的差异表达基因并确定了研究对象基因NHP2;进一步使用STRING、TIMER 2.0、UALCAN数据库等生物信息学方法分析NHP2在泛癌中的差异表达以及在肝癌和其他泛癌中病理进展过程中的相关性,并预测预后生存关系;使用miRNet数据库分析其靶向miRNAs和lncRNAs,应用Cytoscape v3.8.0绘制可能的CeRNAs调控网络图。结果显示,在线数据库检索到细胞衰老相关生物学过程相关基因113个,HCC差异表达基因2 206个,共有19个差异表达基因参与了肝癌细胞衰老的生物学过程。其中,NHP2在包括HCC的多种癌症中显著高表达,NHP2高表达的肝癌人群预后较差,具有统计学差异。NHP2基因编码的互作蛋白有10个,主要参与了1个信号通路(KEGG信号通路)、6个分子功能(molecular function,MF)、11个细胞组分(cellular component,CC)和7个生物学过程(biological process,BP)。结果预测出NHP2靶向miRNAs有2个,lncRNAs有57个。研究结果表明,NHP2在包括HCC的多种肿瘤中高表达,且根据患者的年龄、分期等状态有明显差异,在HCC增殖和衰老过程中,可能通过lncRNAs/miR-1-3p/NHP2或lncRNAs/miR-124-3p/NHP2调控轴进行调节,是HCC预后的预测因子和潜在治疗靶点。

过度拥挤所致的细胞膜曲率改变对肿瘤侵袭的影响及机制

目的肿瘤细胞异常增殖会产生组织内部愈发拥挤的力学环境。肿瘤细胞在狭窄空间内面对相互挤压所产生的物理刺激,会引发一系列力学响应。由于没有一个很好的体外群体细胞模型来模拟体内肿瘤原发灶的浸润过程,因此过度拥挤环境下的机械力如何调控肿瘤侵袭的生物力学机制至今不明。因此本项目的研究目的就是首先建立一个过度拥挤下的肿瘤细胞侵袭模型,并研究机械力调控肿瘤侵袭的力学生物学机制。方法(1)以肿瘤细胞A431为实验对象,构建过度拥挤环境下导致肿瘤细胞发生侵袭的模型。(2)利用超分辨共聚焦、原子力显微镜,扫描电镜等观察过度拥挤对细胞膜曲率和张力的影响。(3)借助活细胞工作站观察细胞膜曲率变化对拥挤应变的响应。(4)利用过表达Tocal-1细胞系干扰细胞膜曲率,探究细胞膜曲率在肿瘤细胞侵袭能力的变化。结果利用已建立的模型研究发现,过度拥挤通过影响细胞膜曲率促进肿瘤细胞侵袭。干扰膜曲率会逆转肿瘤细胞的侵袭过程。结论细胞增殖导致的过度拥挤应变会引发细胞膜曲率发生变化,从而诱导肿瘤细胞发生侵袭。细胞膜机械力敏感蛋白有关可能参与了这一过程,从而激发下游的信号通路。

INTS10对HCC细胞周期、凋亡、生长和迁移能力的影响

为了探究整合因子复合物亚基10(integrator complex subunits 10,INTS10)对人肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)细胞周期、凋亡、生长和迁移能力的影响及其潜在的分子作用机制,利用慢病毒感染法获得稳定过表达或敲低INTS10的HCC细胞系,采用qRT-PCR和Western blotting检测INTS10 mRNA和蛋白表达水平,接着采用CCK-8法、克隆形成和BrdU实验检测细胞生长情况,采用Transwell小室实验检测细胞迁移能力,采用流式分析术检测细胞的周期和凋亡.结果显示:过表达INTS10可显著抑制HCC细胞的凋亡、生长和迁移能力,促进G1期细胞数量的增加,而敲低INTS10则呈现相反的表型.通过通路富集分析发现,周期相关通路被显著富集,过表达INTS10后,CDC25A和CDK4的mRNA和蛋白质水平显著减少,而CDKN1A的水平显著增加,敲低INTS10则呈现相反趋势.综上,本研究初步揭示了INTS10在HCC细胞中可能通过影响G1/S期相关蛋白质的表达而发挥抑癌基因的功能,为下一步更为深入的功能和机制研究提供了基础.

碳离子诱发线粒体损伤抑制非小细胞肺癌细胞增殖机理

以人非小细胞肺癌A549细胞为研究对象,通过观察细胞的增殖抑制情况和线粒体的形态学变化、膜电位改变、膜相关蛋白释放以及线粒体自噬等现象,探讨碳离子通过影响线粒体功能抑制肺癌细胞A549增殖的机理。利用CCK-8细胞增殖检测法和细胞克隆形成率检测法筛选得出半增殖抑制的碳离子照射剂量;通过线粒体膜特异性染料染色观察线粒体的形态学变化、分析膜电位的改变;利用蛋白免疫印迹及实时荧光定量PCR方法检测线粒体相关蛋白的表达量差异;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;利用免疫荧光共定位与蛋白免疫印迹检测线粒体自噬;清除线粒体后再给予碳离子照射,观察细胞凋亡率的变化情况。结果表明:在4 Gy剂量照射下,A549细胞即可达到明显的增殖抑制。在此剂量照射下:线粒体形态皱缩;线粒体膜电位下降;线粒体膜孔蛋白Bax和Bak表达量上升,膜间蛋白Cyto-C和SMAC表达量上升,细胞凋亡率和线粒体自噬水平升高;当清除线粒体后,碳离子对A549细胞的凋亡水平无显著影响。碳离子能够抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖,在4 Gy剂量照射下即可达到半增殖抑制;当清除A549细胞的线粒体后,碳离子丧失其促细胞凋亡的作用。因此,碳离子通过引起线粒体膜电位的改变,释放促凋亡蛋白,抑制A549细胞的增殖。

自噬调节电离辐射引起的神经胶质瘤细胞初级纤毛发生

探讨自噬与电离辐射诱导人神经胶质瘤细胞初级纤毛发生的关系。神经胶质瘤细胞M059K和M059J进行10GyX射线照射或血清饥饿处理,免疫荧光法检测纤毛标志物Arl13b及基体结构蛋白γ-tubulin指示初级纤毛并统计纤毛发生率,免疫荧光法检测自噬标志物LC3联合蛋白质免疫印迹法检测p62蛋白表达量评估细胞自噬水平,利用氯喹(CQ)或雷帕霉素(RAPA)抑制或激活自噬水平并检测对细胞纤毛发生的影响。结果显示:M059K细胞中具有纤毛的细胞比例约为40%,X射线照射处理后3d上升至75%以上(p<0.01),但M059J细胞中纤毛细胞的比例(约7%)在X射线处理后无明显变化,然而血清饥饿处理3 d时M059K和M059J中纤毛细胞的比例分别上升至约80%(p<0.01)和50%(p<0.01)。血清饥饿导致两种细胞的自噬水平均显著升高,但X射线照射仅引起M059K细胞自噬水平升高而对M059J细胞影响不明显。使用RAPA激活细胞自噬能够显著提高两种细胞中纤毛细胞的比例,而使用CQ抑制自噬能够降低X射线照射引起的M059K细胞纤毛发生或血清饥饿引起的M059J细胞纤毛发生。这些结果表明M059K和M059J细胞在X射线处理后自噬激活水平的差异可能是导致两种细胞在照射后纤毛发生情况不同的重要原因,提示自噬在电离辐射诱导神经胶质瘤细胞纤毛发生中发挥重要调节作用。

GATA3通过调控LIFR抑制人乳腺癌细胞的迁移能力

目的探究GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3,GATA3)对乳腺癌细胞迁移能力的影响。方法在MCF7细胞中利用慢病毒载体介导的基因干涉技术敲低GATA3基因,使用实时定量荧光PCR(qRT-PCR)和蛋白质印迹检测GATA3和LIFR的mRNA和蛋白表达水平,Transwell实验检测MCF7细胞的迁移能力。在MCF7和T47D细胞中用染色质免疫沉淀(ChIP-qPCR)实验检测GATA3在LIFR的启动子区的结合位点。在敲低GATA3基因的MCF7细胞中回补LIFR,通过细胞划痕实验和Transwell实验检测MCF7细胞的迁移能力。结果与对照组相比,敲低GATA3基因的MCF7细胞的迁移能力增强(P_(均)<0.05)。与对照组相比,敲低GATA3基因的MCF7细胞的LIFR表达水平降低(P_(均)<0.05)。乳腺癌细胞MCF7与T47D中GATA3在LIFR的启动子区有结合(P_(均)<0.05)。在敲低GATA3基因的MCF7细胞中稳定过表达LIFR可以部分挽救GATA3基因敲低引起的细胞迁移能力的增强(P_(均)<0.05)。结论GATA3通过转录激活LIFR抑制乳腺癌细胞MCF7的迁移。

ZEB1-3′UTR促进乳腺癌细胞MCF-7迁移机制的研究

对与ZEB1-3′UTR结合的microR-NAs进行生物信息学分析。结果表明,与对照组相比,过表达ZEB1-3′UTR后MCF-7细胞迁移能力显著增强。采用RNA22、Microrna、Targetscan数据库筛选出与ZEB1-3′UTR结合的microRNAs,三个数据库公共预测的microRNAs有9个,分别是miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-494、miR-873、miR-381、miR-300、miR-431和miR-342,其中miR-429、miR-200b、miR-200c、miR-342在乳腺癌中高表达。以上研究表明,ZEB1-3′UTR能够竞争性结合肿瘤细胞表达的内源性microRNAs,促进了MCF-7细胞迁移。

复方葛根汤诱导结肠癌HCT116细胞铁死亡分子机制研究

为探究复方葛根汤对结肠癌HCT116细胞增长作用及其分子机制,通过MTT法检测、克隆形成、形态学分析探讨复方葛根汤对HCT116细胞增长作用,以活性氧试剂盒检测、荧光显微成像及蛋白免疫印迹法探究其分子机制。研究结果显示,与溶媒对照组相比,复方葛根汤能显著抑制HCT116细胞增长能力,并呈浓度和时间依赖性,机制上能显著增加细胞内活性氧,显著上调铁死亡相关蛋白PTGS2、ACSL4蛋白的表达,及明显下调铁死亡相关蛋白GPX4表达,表明复方葛根汤可能通过诱导铁死亡机制抑制HCT116细胞增长。

不同癌细胞的力学响应蛋白组学研究

在癌症进展过程中,癌细胞会遇到来自细胞外微环境的各种力学胁迫。阐明癌症细胞响应这些胁迫的机制,有望推动新型抗癌疗法的发展。本研究构建了流体黏度、流体剪切力、基质黏附性、限制性微环境下压力和拉伸力等5类力学胁迫体系,研究了代表六类癌症的8种细胞系在各类胁迫条件下的增殖和迁移行为改变。进一步的,本工作研究了其中5种癌细胞在高流体黏度和高基质黏附性胁迫条件下对的蛋白组差异分析。在两类胁迫中,本研究共鉴定到10790蛋白,有9249蛋白在两类胁迫中共同鉴定到,有2931蛋白显著性差异,其中1413蛋白在高流体黏度胁迫下显著差异,1264蛋白在高基质黏附性胁迫下显著差异,286蛋白在两类胁迫条件下均显著差异。进一步分析揭示差异蛋白较多与线粒体内膜、基质、ATP结合、能量代谢等相关,表明在受到高流体黏度和高基质黏附性胁迫时,线粒体会起到响应胁迫并调控细胞生理过程的作用,揭示了潜在的力学响应途径。在受到流体黏度胁迫的5种癌细胞中,ITIH4和A2MG均发生上调,其中ITIH4的上调表达也进一步被WB实验验证。以上结果提示ITIH4可能作为力学敏感因子响应流体黏度胁迫。另外,在受到高基质黏附性的5类癌细胞中,FN1蛋白显著上调,提示FN1可能参与到对高基质黏附胁迫这一过程中。本研究结合蛋白组学手段系统研究了不同种类癌细胞对响应力学胁迫时的蛋白质表达变化,发现了新的力学响应分子,有助于进一步阐明癌细胞的力学响应机制。

敲低线粒体转录因子A(TFAM)抑制人宫颈癌细胞及骨肉瘤细胞自噬及增殖、侵袭和迁移

目的研究线粒体转录因子A(TFAM)对宫颈癌HeLa细胞及骨肉瘤U2OS细胞的线粒体功能、自噬、增殖、侵袭、迁移的影响。方法HeLa、U2OS细胞转染TFAM小干扰片段(si-TFAM)下调TFAM表达,Mito-Tracker Red CMXRos染色结合激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位(MMP)、MitoSOX^(TM)Red标记法检测线粒体活性氧(mtROS)水平、实时定量PCR检测线粒体DNA(mtDNA)的表达,免疫荧光细胞化学染色检测自噬体数量的变化。Western blot法检测TFAM、微管相关蛋白1轻链3A/B(LC3A/B)、自噬相关基因2A(ATG2A)、ATG2B、ATG9A、锌指转录因子Snail、基质金属蛋白酶2(MMP2)和MMP9的表达。CCK-8法、平板集落形成实验检测细胞增殖,Transwell^(TM)实验、划痕愈合实验检测细胞侵袭、迁移的变化。结果下调TFAM表达导致HeLa及U2OS细胞MMP减少,mtDNA拷贝数减少,mtROS产生量增加。LC3A/B蛋白含量较对照组明显下降,胞质内自噬体数量明显减少,自噬早期阶段蛋白ATG2B、ATG9A表达量明显减少。HeLa及U2OS细胞Snail、MMP2和MMP9蛋白表达均减少。干扰TFAM表达,抑制HeLa及U2OS细胞的增殖、侵袭、迁移能力。结论下调TFAM表达抑制线粒体功能,延缓自噬进程,降低宫颈癌细胞及骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移能力。

苍术素通过ROS/Nrf2/HO-1信号通路诱导肺癌细胞凋亡和自噬

目的:探讨苍术素(atractylodin,ATR)对肺癌细胞凋亡和自噬的影响,并初步探讨其可能分子机制。方法:体外培养非小细胞肺癌A549和H460细胞,CCK-8检测不同浓度苍术素对肺癌细胞和HBE细胞活力的影响。Hoechst染色及流式细胞术检测苍术素对肺癌细胞凋亡的影响。Western blot法检测P62、beclin-1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)、Kelch样ECH关联蛋白1(Kelch-like ECH-associated protein-1,Keap-1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]的蛋白表达;吖啶橙染色(acridine orange,AO)检测酸性自噬泡的表达;免疫荧光检测LC3和Nrf2的表达;氯喹(chloroquine,CQ)阻断A549细胞的自噬后,采用Western blot分析,AO染色和流式细胞术检测细胞的自噬和凋亡;DCFH-DA检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)的表达水平。结果:苍术素抑制肺癌A549和H460细胞的活力,促进肺癌细胞凋亡;在苍术素作用下,肺癌A549细胞内的酸性自噬泡数量显著增长,同时LC3和beclin-1蛋白表达量显著升高,而P62则减少。CQ阻断A549细胞的自噬,并逆转苍术素诱导的细胞凋亡;同时苍术素显著促进细胞内ROS的表达,抑制Keap-1的蛋白表达,上调Nrf2、HO-1及NQO1的蛋白表达。结论:苍术素可抑制肺癌细胞活性,并通过自噬诱导肺癌细胞凋亡,其作用机制可能与ROS/Nrf2/HO-1通路有关。

长链非编码RNAALOX12P2对口腔鳞状细胞癌细胞活力、迁移及侵袭的影响

目的:本研究旨在深入了解ALOX12P2在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达和定位,以及其对口腔鳞状细胞癌细胞活力、迁移及侵袭产生的影响。方法:(1)通过数据库UALCAN(the University of Alabama at Birmingham cancer data analysis portal),对头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)组织中ALOX12P2的表达及其与临床病理特征的相关性进行分析;利用GDC和UCSC Xena数据库分析ALOX12P2在OSCC中的表达和对生存预后的影响。(2)对OSCC细胞系中ALOX12P2的表达进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测。(3)ALOX12P2的亚细胞定位通过RNA核质分离实验检测。(4)对CAL-27细胞建立AL-OX12P2敲减组(SS-ALOX12P2组)和敲减对照组(SS-NC组);对HN30细胞建立ALOX12P2过表达组(ALOX12P2组)和过表达对照组(vector组);由CCK-8和Transwell评估ALOX12P2对细胞活力、迁移和侵袭能力的影响。(5)由Western blot实验检测ALOX12P2表达水平改变后对上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关基因以及PI3K/AKT通路的影响。结果:与正常组织相比,ALOX12P2在HNSCC和OSCC组织中的表达较高,其表达与不良预后有关;RT-qPCR结果显示,在6种OSCC细胞系中,ALOX12P2的相对表达水平均高于正常细胞(P<0.05);RNA核质分离结果显示,ALOX12P2定位于细胞核;与SS-NC组比较,SS-ALOX12P2组中ALOX12P2相对表达量明显降低(P<0.01),细胞活力、迁移及侵袭能力也明显降低(P<0.01);与vector组相比,ALOX12P2组中AL-OX12P2相对表达量明显增高(P<0.01),细胞活力、迁移及侵袭能力也明显升高(P<0.01);Western blot结果显示,敲减ALOX12P2导致E-钙粘蛋白(E-cadherin)的蛋白水平升高,N-钙粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的蛋白水平降低(P<0.01);ALOX12P2过表达而结果显示相反(P<0.01);敲减ALOX12P2导致p-PI3K和p-AKT的蛋白表达减少(P<0.01),过表达ALOX12P2则显示p-PI3K和p-AKT的蛋白表达增多(P<0.01)。结论:在OSCC中,ALOX12P2呈现出较高的表达水平,并且能促进OSCC细胞活力、迁移及侵袭。这种作用可能与ALOX12P2激活PI3K/AKT信号通路有关,进而促进了EMT过程的发生。

肝细胞癌组织核孔蛋白85(NUP85)高表达与免疫细胞浸润及预后相关性分析

目的 探究核孔蛋白85(NUP85)在肝细胞癌(HCC)中的表达意义及免疫相关性分析。方法 综合利用多种在线数据库分析NUP85在HCC中的mRNA表达、蛋白表达以及突变情况,并进行预后诊断价值分析;采用单细胞测序数据及肿瘤免疫评估资源(TIMER)和基因表达谱交互作用分析2021(GEPIA2021)数据库分析NUP85的免疫相关性;利用基因组癌症分析(GSCA)和临床生信之家分析NUP85的药物敏感性;通过肝细胞癌综合分子数据库(HCCDB)筛选NUP85在HCC中的共表达基因,并利用R语言“limma包”分析NUP85及其相关基因的相关性;再利用R语言“clusterProfiler包”分析NUP85及其相关基因的基因本体论(GO)功能注释、京都基因与基因组百科全书(KEGG)以及基因集富集分析(GSEA);利用临床生信之家对NUP85及其相关基因进行列线图和预后风险评分模型的构建。结果 NUP85的mRNA和蛋白质在HCC中表达上调,在不同分期和分级均高表达,不利于患者预后;而其在HCC样本中突变率是19%,显著影响患者的总生存期(OS)、疾病特异性生存(DSS)以及无进展生存(PFS),且其在巨噬细胞、 B细胞、 T细胞等多种免疫细胞中高表达并与多种免疫细胞浸润水平呈正相关;此外,NUP85的表达与米尔达美替尼(PD0325901)、维莫非尼的结构类似物(PLX4720)和瑞法替尼(PD0325901)等多用药物具有显著相关性。NUP85及其共表达基因的GO功能主要富集在细胞器裂变、核分裂和染色体分离等,KEGG通路主要富集在细胞周期和运动蛋白等,并显著不利于HCC患者OS,且对HCC患者1年、 3年和5年OS预后诊断的ROC曲线下面积AUC均大于0.7。结论 NUP85高表达HCC患者预后差,并与多种免疫细胞和药物相关,可作为HCC诊断、治疗和预后的生物标志物。

Trigger转座子衍生蛋白1对肝癌细胞生长的影响

细胞周期失调是肿瘤重要的标志之一,生物信息学分析结果表明,Trigger转座子衍生蛋白1(TIGD1)在临床肝癌组织中高表达且与细胞周期相关,但相关机制未知。为了探究TIGD1调控肝癌细胞生长的具体机制,首先,利用shRNA质粒构建靶向敲低TIGD1的肝癌细胞系Hep3B,并分析TIGD1敲低对肝癌细胞生长的影响,结果表明细胞生长受阻;接着,通过细胞流式技术分析TIGD1敲低对肝癌细胞周期进程的影响,结果显示,TIGD1敲低的Hep3B细胞系的细胞周期进程主要阻滞于G2/M期;然后,通过免疫沉淀(IP)实验验证TIGD1可能发生相互结合的蛋白分子,结果表明,TIGD1可能与Aurora激酶相互作用蛋白1(AURKAIP1)存在相互结合,进一步的Co-IP实验证实了TIGD1和AURKAIP1之间的相互作用。已知AURKAIP1可调控Aurora激酶A(AURKA)的蛋白酶体降解途径,AURKA是一种有丝分裂调控蛋白,与细胞周期进程密切相关。文中进一步探究TIGD1对AURKA蛋白水平的影响,实验结果表明,在TIGD1敲低的情况下,AURKA在Hep3B细胞系中的蛋白水平明显下调,mRNA水平没有明显变化。综上所述,TIGD1可能通过调控AURKA在肝癌细胞中的转录后水平来影响细胞周期进程,从而影响肝癌的发生发展。

细胞间质上皮转化因子(c-Met)中和抗体的筛选及鉴定

目的通过抗体的随机突变库和细胞展示技术,对具有中和活性的细胞间质上皮转化因子(c-Met)抗体进行结构和活性优化,获得亲和力高、激动活性低的抗体,并使其保持亲本抗体的中和及内化活性,提高抗体偶联药物(ADC)的成药性。方法构建和筛选c-Met中和激动型抗体3E1D7的重链互补决定区3(CDR3)随机突变库,获得CDR3区有4个氨基酸突变的候选抗体2G5。通过ELISA检测2G5的中和活性,流式细胞术检测其在A549细胞的内化,CCK-8法检测2G5对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响,通过Transwell^(TM)小室检测2G5对A549细胞迁移的影响,通过Western blot法检测2G5对c-Met磷酸化的影响。结果突变抗体2G5与抗原c-Met保持较高的结合能力,半数有效浓度(EC_(50))为41.53 ng/mL,并具有较高的中和活性。在A549细胞中,2G5引起显著的内化效应,但不激活c-Met信号通路和细胞迁移。2G5不能引起HUVEC增殖。结论通过建立抗体随机突变库可优化c-Met抗体的活性,获得成药性更高的突变型抗体。