利用CRISPR/Cas9系统创制水稻品种GW2基因的突变体

培育具有育种价值的GW2基因编辑的水稻优异新品种在水稻育种中具有重要意义,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以生产上广泛推广应用的13份水稻品种为材料,对粒质量基因(GW2)进行定向性状改良,通过农杆菌转化创制出一批无T-DNA元件的水稻非转基因GW2突变纯合株系。结果表明:13份T0代水稻转基因中,有28.0%~59.1%植株的GW2基因发生了突变,纯合突变株数量占总突变株数量的35.0%,双等位突变株数量占总突变株数量的14.2%,杂合突变株数量占总突变株数量的50.8%。此外,不同水稻品种发生的突变类型也略有不同。对13份T2代非转基因水稻GW2突变纯合株进行千粒质量性状的考种分析。与对应的野生型亲本品种相比,纯合突变水稻植株的千粒质量显著提高10.81%~58.22%。本研究结果极大地丰富了GW2的突变类型,为不同水稻品种的高产稳产创造了重要的种质资源,同时也为利用基因编辑提高水稻产量提供了有价值的育种信息。

调控牛体型大小的信号通路及候选基因研究进展

体型大小在牛的生产、健康、育种选择和环境适应中起着关键作用,是由一系列复杂的数量性状如体重、体长和体高等组成的。目前,对牛体型大小的相关研究已经取得一定成果,但对牛体型大小变异的遗传基础尚不清楚。文章对调节体型大小的重要信号通路如胰岛素/胰岛素样生长因子1(Insulin/IGF1)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、雷帕霉素靶蛋白(TOR)、河马(Hippo)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路及影响牛体型大小的候选基因如多形性腺瘤(PLAG1)基因、非染色体结构维护亚基凝聚素Ⅰ复合物亚基G(NCAPG)基因、配体依赖性核受体辅阻遏物样蛋白(LCORL)基因、沉默调节蛋白1(SIRT1)基因和信号转导转录激活因子3(STAT3)基因等进行了综述,旨在为进一步解析牛科动物体型大小的遗传机制提供基础,并为通过分子育种改良这些性状提供依据。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用研究进展

基因编辑技术是一种对目的基因进行特定修饰的技术,被广泛应用于生物育种、疾病模型构建等研究领域。CRISPR/Cas9系统由重复和间隔单元组成的CRISPR阵列和一个Cas基因座位组成,能够对生物体性状进行目的基因定点编辑,具有简单、精确且高效的特点。CRISPR/Cas9基因编辑技术通过引入基因敲除、基因敲入、缺失、点突变和单核苷酸突变等不同形式的修饰广泛应用于畜禽的基因编辑,以研究畜禽关键基因功能,从而加速性状改良。相较于猪、鸡等其他畜禽,CRISPR/Cas9技术对羊的研究相对滞后。文章重点阐述了CRISPR/Cas9基因编辑技术在羊育种功能基因验证中的应用,对其在产肉性状、纤维性状、泌乳性状和人类疾病模型等方面的应用研究进展及前景进行了简要概述,以期为我国羊产业的可持续发展提供参考。

CRISPR/Cas9基因编辑技术在鱼类养殖应用的研究进展

随着生活水平的提高,人们对水产品的需求量也不断增加。鱼类养殖是水产养殖的重要组成部分,提高养殖鱼类的产量已成为当前亟待解决的问题。育种为提高养殖鱼类产量做出了重大贡献,为满足全球对优质蛋白日益增长的需求,亟需应用新技术加速育种进程,以进一步提升鱼类产量。基因编辑技术(包括ZFNs、TALLENS和CRISPR/Cas9)是目前加快遗传改良进程的重要工具,其中CRISPR/Cas9技术在编辑基因方面具有速度快、成本低、精度高等优点,因此在养殖鱼类基因编辑中的应用不断扩大。目前研究人员已对20多个鱼类养殖品种进行优良性状改良。文章总结了CRISPR/Cas9技术及其在鱼类养殖业中的应用及现状,并展望了未来的发展方向,以期为CRISPR/Cas9技术在鱼类养殖中的应用提供一定参考。

转录调节因子IFRD1基因研究进展

干扰素相关发育调节因子1(interferon-related developmental regulator 1,IFRD1)基因编码一种与干扰素相关的蛋白质。在胚胎发育和组织再生过程中,该蛋白质可能作为一种转录共激活因子/抑制因子控制特定细胞类型的生长和分化。IFRD1基因在动物的肌肉发育、脂肪形成及小鼠肠道发育中发挥重要作用,为改善肉类品质提供了理论基础,同时也与其他系统发育及疾病发生相关。文章对IFRD1基因的结构特点、调控组织发育和疾病发生中的功能及其在畜禽方面的研究进展进行了综述,以期为该家族的后续研究提供新思路。

ZmCYP72A5基因调节玉米株高和抽穗时间的研究

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术对玉米ZmCYP72A5基因进行编辑,获得9个基因突变株系,分别命名为L1-L9,进而研究其在玉米生长发育中的功能。研究发现,突变植株平均高度明显降低,但植株节间数没有变化。进一步分析发现,突变植株的第9至11节间和节间细胞长度明显缩短,其抽穗时间延迟了2-5 d,叶片持绿时间延长,衰老变慢,但是籽粒鲜重和百粒重并没有降低。这些结果表明,该基因在玉米生物育种具有良好的应用潜力。

NRG4基因对急性髓系白血病细胞增殖、凋亡及周期的影响

为了分析、检测造血系统恶性肿瘤患者和细胞系中NRG4基因的表达情况,探讨其对急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞系增殖、凋亡、周期和集落形成的影响。运用基因表达综合数据库(gene expression omnibus,GEO)和OncoLnc数据库分析NRG4在造血系统恶性肿瘤患者中的表达情况及其对患者预后的影响,实时荧光定量PCR检测NRG4在造血系统恶性肿瘤各细胞系中的表达情况。构建包含NRG4 shRNA及scramble对照慢病毒,感染AML细胞系Molm-13、KG-1a和Kasumi,采用生长曲线、AnnexinV/7-AAD和PI染色、集落形成等方法评价NRG4对AML细胞增殖、凋亡、周期和集落形成的影响。结果表明,NRG4在AML患者骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMCs)中的表达水平显著高于健康对照,高表达NRG4的白血病患者的生存率显著低于低表达患者(P<0.05)。在Molm-13、KG-1a和Kasumi细胞中敲降NRG4能够显著抑制细胞的增殖、集落形成,促进细胞凋亡,并使细胞阻滞于S期(P<0.05)。总之,NRG4基因在AML患者和细胞系中高表达,并与患者预后不良相关,对AML细胞系具有显著的促癌作用。研究结果有助于阐明AML的发生机制,为新治疗靶点的开发奠定了基础。

毛竹种质分子鉴别SRAP、AFLP、ISSR联合分析

选择10份毛竹(Phyllostachys edulis)种质,突破以往单一分子鉴别的分析方法,采用AFLP、ISSR、SRAP3种标记数据联合进行判别分析,结果显示:联合鉴别分析可以有效提高种质鉴别率,其效果顺序为(AFLP+IS-SR+SRAP)>(AFLP+SRAP)>(ISSR+SRAP)>(AFLP+ISSR);单一鉴别的一致性顺序为SRAP>AFLP>ISSR。探讨了毛竹种质-Q、油毛竹等种质的分子遗传特征。

应用CRISPR/Cas9系统构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系

目的利用成簇的、规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(CRISPR/Cas9)基因组编辑技术,构建Rev-erbβ基因敲除的HEK293细胞系。方法通过单向导RNA(sgRNA)介导Cas9蛋白对目的基因靶位点DNA进行特异性的切割,然后经DNA同源重组单向导RNA或非同源末端连接方式进行修复,以实现对Rev-erbβ基因进行敲入、敲除修饰操作的目的。首先,针对Rev-erbβ基因设计4个sgRNA,经筛选选择活性较高的sgRNA1及sgRNA2用于构建p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2串联载体。然后将p CMV-h Cas9-U6-Rev-erbβsgRNA1&sgRNA2和p Ad-E1/hRev-erbβdonor质粒载体共转染至HEK293细胞,通过药物筛选、克隆化及序列测序获得整合有外源供体基因片段的一条链,另一条链为片段缺失的Rev-erbβ基因完全敲除的HEK293(Rev-erbβ-/-)细胞系。最后通过用Western blot法和实时定量PCR对敲除Rev-erbβHEK293细胞系(C3-6)进行检测。结果敲除Rev-erbβ基因的HEK293细胞系中均未检测到Rev-erbβmRNA和蛋白质的表达。结论利用CRISPR/Cas9技术,成功构建了基因定点修饰和敲除的Rev-erbβ-/-HEK293细胞系,为Rev-erbβ的功能和作用机制研究提供有效工具。

植物抗旱基因工程研究进展

从渗透调节物质、清除活性氧、保护生物大分子及其膜结构的蛋白质、转录因子及其他酶类的基因工程等方面 ,综述了目前用于植物抗旱基因工程的研究进展及存在的一些问题。

CYP7A1基因-204位点A/C变异对启动子活性的影响(英文)

CYP7A1(cholesterol7α-hydroxylase)在胆固醇向胆汁酸代谢途径中起着至关重要的作用.为研究该基因启动子区-204位点A/C多态性是否影响基因表达,利用荧光素酶作为报告基因,将含有A或C等位基因的启动子区片段分别正向和反向插入不含启动子的pGL3-basic质粒载体中,再以重组体转染4种细胞株,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定酶活性并进行比较.实验结果表明,2种基因型的正向序列启动子活性均高于相应的反向序列,含有A等位基因的启动子片段活性比含有C等位基因的片段低约1/3.TRANSFAC数据库分析显示,当-204位点等位基因为C时,可能存在1个Zic3结合位点.研究结果提示,CYP7A1基因启动子区-204位点A/C变异可减少启动子活性从而影响基因表达,其原因可能为1个潜在的Zic3结合位点的丧失.

启动子区DNA去甲基化增强子宫内膜异位症患者子宫内膜基质细胞MMP-9的表达

目的研究子宫内膜异位症中基质金属蛋白酶9(MMP-9)基因表达的DNA甲基化调控机制。方法采用甲基化特异性PCR检测在位与异位子宫内膜组织中MMP-9 mRNA的表达,采用免疫组织化学染色检测在位与异位子宫内膜组织中MMP-9蛋白的表达。原代培养子宫内膜异位基质细胞,细胞经5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-dC)处理后,分析MMP-9基因的表达及其启动子甲基化状态。结果异位子宫内膜组织中MMP-9 mRNA和蛋白的表达高于在位子宫内膜组织。异位子宫内膜组织中MMP-9基因启动子区DNA甲基化水平低于在位子宫内膜组织。5-Aza-dC处理异位子宫内膜细胞后,MMP-9的表达水平升高,MMP-9基因启动子区出现明显的去甲基化。结论 MMP-9基因启动子区DNA去甲基化增强子宫内膜异位症患者异位内膜基质细胞中MMP-9的表达。

HIF-1α的RNA干涉可引起缺氧条件下人角膜上皮细胞VEGF表达下调和PEDF表达上调

目的探讨shRNA干扰HIF-1α表达对缺氧条件下人角膜上皮细胞(h CEC)血管内皮生长因子(VEGF)和色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法针对HIF-1αmRNA序列靶点设计及合成3个小发夹RNA(shRNA),分别在体外转染自发永生化人角膜上皮细胞(S-ihCEC),转染后的S-ihCEC在1 mmol/L Co Cl2中缺氧诱导培养6 h,实时定量PCR检测HIF-1α、VEGF、PEDF的mRNA表达,Western blot法检测HIF-1α、VEGF的蛋白表达,ELISA检测PEDF的水平。结果与缺氧组比较,转染HIF-1αshRNA的S-ihCEC中HIF-1αmRNA表达下调、HIF-1α蛋白表达下调,VEGF mRNA表达下调、VEGF蛋白表达下调,PEDF mRNA表达上调(1. 22±0. 18)倍,PEDF水平升高。结论针对HIF-1α的shRNA能有效干扰S-ihCEC中HIF-1α的表达,并下调VEGF表达、上调PEDF的表达。

错配修复基因启动子甲基化和蛋白表达在葡萄胎的发生及恶变中的作用

目的探讨错配修复基因hMLH1和hMSH2启动子甲基化和蛋白表达在葡萄胎的发生及恶变中的作用。方法用甲基化敏感性核酸内切酶HpaⅡ酶切-PCR法,分析正常早孕人流绒毛、部分性葡萄胎(PM)、完全性葡萄胎(CM)和侵蚀性葡萄胎(IM)hMLH1和hMSH2启动子甲基化情况;免疫组化检测hMLH1和hMSH2原位蛋白表达。结果在正常早孕绒毛、PM、CM和IM组织中,hMLH1和hMSH2均表达于细胞滋养细胞,合体滋养细胞大多表达阴性,极少数为弱阳性。正常早孕绒毛组织均未发现hMLH1和hMSH2启动子甲基化,而hMLH1和hMSH2表达全部阳性,阳性率为100%,与PM、CM组织相比,启动子甲基化和蛋白表达均存在显著性差异(P<0.05)。IM中hMLH1和hMSH2启动子甲基化发生率分别为80.0%(12/15)和73.3%(11/15),与PM、CM相比无显著性差异(P>0.05);IMhMLH1蛋白表达阳性率为54.5%(6/11),与PM、CM相比无显著性差异(P>0.05);而hMSH2蛋白表达阳性率为36.4%(4/11),明显弱于CM,两者比较有显著性差异(P=0.044)。CM和IM组织中hMSH2启动子甲基化与其蛋白表达间存在相关性(P值分别=0.001和0.039)。结论hMLH1和hMSH2的高表达对正常细胞滋养细胞基因组的稳定性起着重要的作用;hMLH1和hMSH2启动子甲基化的发生和蛋白表达的缺失参与了葡萄胎的发生。

细胞凋亡的基因调控研究进展

细胞凋亡的调控是细胞生理死亡和肿瘤等疾病发生的重要机制。分别对线虫和哺乳类动物细胞凋亡的基因调控研究进展进行了综述 ,阐述了bcl 2基因家族、c myc基因、p5 3基因、白细胞介素Ⅰβ转化酶基因家族、Fas/FasL基因对细胞凋亡的调控作用。

土槿皮乙酸通过P53和caspase蛋白抑制人乳腺癌细胞MCF-7生长机制研究

MCF-7细胞是caspase 3功能缺失的乳腺癌细胞,本研究结果发现土槿皮乙酸(PAB)可激活caspase 3的上游蛋白caspase 8和caspase 9来诱导细胞凋亡,同时PAB通过P53蛋白诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡。本试验结果为进一步阐明PAB抗乳腺癌奠定了基础。

C-fos基因功能及与麻醉关系的研究进展

C-fos基因是即刻早期基因（immediate earlygenes,IEG）家族成员之一,含3.5 kb碱基的DNA序列,由4个外显子和3个内含子组成,可转录为2.2 kb碱基的成熟m RNA,编码380个氨基酸的FOS蛋白[1]。FOS与JUN形成FOS-JUN/AP-1复合物,是转录水平上不同信号传递的＂中转站＂,与目的基因结合,激活目的基因的转录活性,

maspin基因启动区的初步鉴定

目的:研究maspin基因表达的调控机制。方法:利用PCR技术扩增maspin基因5'上游启动区860bp(-765～+95bp)不同的缺失片段,并将它们分别与荧光素酶(LUC)报告基因相连,构建了6种maspin-LUC报告基因表达质粒,通过转染实验检测maspin启动区不同长度片段在雄激素依赖性前列腺癌细胞(LNCaP)和雄激素非依赖性前列腺癌细胞(PC-3M)中驱动荧光素酶表达的活性。并转染雄激素表达受体(AR)到PC-3M细胞,观察雄激素及其受体对不同片段表达活性的作用。结果:maspin基因启动区(-312～247bp)之间含有与雄激素受体相关的负性调控元件,在(+14～95bp)之间含有一个功能性的中文(Sp1)调控元件。结论:maspin基因的表达受雄激素受体及Sp1的调节。

LRIG1在卵巢浆液性囊腺癌细胞对依托泊苷敏感性中的作用研究

目的探讨亮氨酸重复序列免疫球蛋白样结构域基因-1(LRIG1)在卵巢浆液性囊腺癌(SKOV3)细胞株中对依托泊苷敏感性的可能机制。方法噻唑蓝比色法(MMT)检测不同浓度VP16干预下48 h的SKOV3细胞组、siRNA LRIG1转染SKOV3细胞组、SKOV3/VP16细胞组和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的增殖。平板克隆检测细胞增殖,流式检测细胞凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测LRIG1mRNA表达。结果半抑制浓度(IC50)分别为62.90、115.49、156.50和195.42μg/L,siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16的耐药指数分别为1.8、2.5和3.1。SKOV3、siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞组的克隆率(F=39.338,P=0.000),细胞的LRIG1 mRNA(F=63.095,P=0.000)和凋亡细胞(F=230.046,P=0.000)明显不同,与SKOV3比较,siRNA LRIG1转染SKOV3、SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加(t=0.026、0.0710和0.125,P=0.042、0.000和0.000),细胞的LRIG1 mRNA降低(t=0.130、0.525和0.825,均P=0.000),凋亡细胞减少(t=12.350、35.506和44.412,均P=0.000),与siRNA LRIG1转染SKOV3比较,SKOV3/VP16和siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加(t=0.044和0.099,P=0.001和0.000),LRIG1 mRNA降低(t=0.395和0.695,均P=0.000),凋亡细胞减少(t=23.156和32063,均P<0.05),与SKOV3/VP16比较,siRNA LRIG1转染SKOV3/VP16细胞的克隆率增加(t=0.055,P=0.000),细胞的LRIG1 mRNA降低(t=0.300,P=0.000),凋亡细胞减少(t=8.906,P=0.000)。结论 LRIG1 mRNA影响SKOV3细胞对药物的敏感性,沉默LRIG1的耐药细胞可抑制SKOV3细胞凋亡。