胚胎造血干细胞发育全程线粒体动态特征及功能研究

目的:描绘线粒体在小鼠胚胎造血干细胞发育全程的动态特征并探究线粒体在此过程中的功能。方法:分析小鼠胚胎造血干细胞发育动态连续群体的单细胞转录组数据,描绘线粒体及能量代谢相关基因的动态变化特征;利用荧光探针染色结合流式细胞术对上述各个阶段细胞内线粒体的数量及膜电位进行检测,探究造血干细胞发育过程中线粒体数量和活性的动态变化特征;在共孵育诱导体系中加入抑制线粒体合成及能量代谢的小分子抑制剂,并结合造血集落形成实验评价抑制线粒体功能后对于体外造血诱导的影响。结果:(1)单细胞转录组数据分析显示,相较于糖酵解相关基因,线粒体合成及氧化磷酸化相关基因在生血内皮细胞和I型造血干细胞前体阶段呈现显著高表达,并且这部分基因能够显著区分连续动态发育群体。(2)荧光染色及流式细胞术结果显示,线粒体数量和膜电位在从生血内皮细胞到造血干细胞前体的连续发育过程中呈现不断上升的趋势,在II型造血干细胞前体阶段达到最高,而在胎肝造血干细胞中有所下降。(3)体外共孵育及造血集落培养结果显示,与对照组相比,抑制线粒体呼吸链I和V能够显著减少胚胎主动脉-性腺-中肾区CD31+细胞诱导产生的造血集落数量(P<0.05)。结论:(1)线粒体合成及氧化磷酸化相关基因在生血内皮细胞和I型造血干细胞前体中显著高表达,并能区分连续发育群体;(2)线粒体数量和膜电位在造血干细胞连续发育过程中不断上升,在II型造血干细胞前体中达到最高;(3)体外抑制线粒体呼吸链I和V能够显著降低造血产物生成。

一种高效小鼠骨髓红系造血岛富集方法的建立

红系造血岛(erythroblastic island,EBI)是哺乳动物红细胞终末分化的独特微环境,EBI研究对于深入理解生理和病理条件下造血微环境的组成和变化至关重要。骨髓中EBI分布较为分散,现有富集方法的富集效果不尽如人意。研究旨在建立一种新的更高效的小鼠骨髓EBI富集方法。在前人研究的基础上进行了创新和优化,建立了以二次密度梯度沉降结合洗涤去除非EBI细胞团为核心的富集方法。通过细胞团形态观察、瑞氏吉姆萨染色、成像流式技术(imaging flow cytometry,IFC)等手段比较了该方法与现有富集方法的富集效果,在直接镜检和瑞氏吉姆萨染色中发现,方法4富集体系中少见单细胞,主要为以巨噬细胞为核心周围围绕红细胞的典型EBI结构。使用IFC技术对于F4/80、CD71以及CD11b进行分析,富集产物中约63.7%的细胞团为EBI,高出之前方法的最高标准(方法3),约38.4%。富集的EBI中发现巨噬细胞为CD11b^(-),且除红细胞外,部分EBI中存在CD11b^(+)细胞,与之前的研究相符。结果显示,该方法在没有造成EBI结构明显破坏的情况下,富集效果在去除单细胞以及非EBI细胞团等方面显著优于现有其他方法,适合对EBI纯度要求较高的研究,为造血微环境研究提供了有效的方法和手段。

放烧复合伤小鼠骨髓基质细胞对粒-巨噬系祖细胞生长的影响

为了进一步阐明放射损伤复合烧伤(放烧复合伤)时骨髓造血基质细胞支持粒-巨噬系祖细胞造血能力的变化,采用小鼠骨髓基质细胞体外融合培养和粒-巨噬系祖细胞集落(CFU-GM)培养的方法,观察了5Gy照射复合15％Ⅲ度烧伤时基质细胞对支持CFU-GM生长的影响。结果表明:①单纯5Gy照射,单纯烧伤及放烧复合伤后,其骨髓基质细胞支持正常粒-巨噬系祖细胞造血的能力明显下降,以伤后3-5天最为显著,伤后10天仍未恢复至正常;②当骨髓基质细胞和粒-巨噬系祖细胞均受到致伤因素作用时,单纯照射及放烧复合伤组的CFU-GM形成能力下降更为明显,至正常对照组的10％以下,单纯烧伤组也有明显下降,但恢复较快;③在本研究所涉及的各种情况下,损伤的效应均有伤后3-5天达最低值的规律,之后可不同程度地恢复。实验结果提示,在上述损伤因素的作用下骨髓基质细胞的功能确已受到了不同程度的损伤,因此在治疗由此所引起的造血功能障碍时,同时加强促进基质细胞修复的措施,可能会取得更满意的疗效。

长期游泳运动对大鼠铁状态的影响

目的 :观察不同的运动时间对铁状态的影响。方法 :大鼠随机分为 3、6、12个月的三个游泳运动组和相应安静组 ;运动期满后观察血液学铁状态指标和器官非血红素铁 (NHI)含量和NHI总含量 (TNHI)的变化。结果 :与安静组相比 ,三种不同时间长度的运动均诱导一种具有血浆铁浓度降低、血浆转铁蛋白铁饱和度降低而血红蛋白浓度和红细胞比容得到维持的血液学低铁状态 ;这种低铁状态伴有肝、脾、心、肾NHI浓度显著降低 ,但与运动时间无关 ;肝、脾和肾TNHI变化与其浓度变化方向一致 ,但心脏没有显著变化 ;上述器官TNHI随时间增加而增多。结论 :尽管运动诱导的低铁状态类似于铁缺乏中期表现 ,但由于器官NHI重分布和铁贮存并没有进行性降低 ,因此 ,长期运动引起的低铁状态可能是机体内铁代谢对运动的适应 ,不存在所谓“运动性铁缺乏”

微波复温对玻璃化冻存大鼠胚脑细胞活性的影响

以孕17～19d的SD大鼠为材料,对胚脑细胞进行玻璃化深低温保存,在冻存3、10、20、30、60d后,胚脑细胞样品分别采用常规的38℃水浴复温和微波复温即在300mL10℃水中,控制微波功率为800W,频率2450MHz,复温时间80s.检测胚脑细胞的功能变化,比较两种复温方法对细胞活性的影响.结果表明:胚脑细胞玻璃化冻存3～30d,细胞的回收率、存活率、细胞内琥珀酸脱氢酶(SDH)、超氧化物歧化酶(SOD)活性都有下降的趋势,过氧化氢(H2O2)含量显著增加,但冻存30d后这些指标保持基本稳定,与第60d比较无显著差异(P>0.05).微波复温组的细胞存活率,细胞内SDH、SOD的活性高于水浴复温组,细胞内H2O2含量明显低于水浴复温组.说明微波复温能够提高复温速率,对胚脑细胞的损伤要低于水浴复温.

流式细胞术联合检测骨髓细胞CD271、CD133、CD34的表达与分析

本研究检测骨髓细胞的CD271、CD133和CD34的表达,分析细胞表达CD271与CD133及CD133与CD34的相关性。根据不同设计组合用CD45-PerCP、CD271-PITC、CD133-PE和CD34-FITC标记骨髓细胞,获得细胞后以FSC、SSC和CD45反复对细胞群进行定位和筛选,然后用流式细胞术检测骨髓细胞和骨髓单个核细胞(MNC)的上述表达。结果表明,骨髓细胞CD271+、CD133+和CD34+表达率分别为0.16%、0.20%和0.43%,骨髓单个核细胞分离后CD271+、CD133+和CD34+表达率分别0.49%、0.47%和1.07%;骨髓细胞的CD271+CD133+共表达率为0.02%,单个核细胞分离后的CD271+CD133+的共表达率为0.03%。90%CD133+细胞表达CD34,40%CD34+细胞表达CD133。结论:建立的三色荧光联合检测方法可作为检测骨髓中CD271+,CD133+和CD34+细胞的方法。CD271阳性细胞与CD133和/或CD34阳性细胞是不同的细胞群,CD271可能在评价和指导骨髓间充质干细胞的临床治疗中有重要意义。

应用绿色荧光蛋白研究外源基因在造血细胞的表达调控

以增强型绿色荧光蛋白为报道分子,研究双基因逆转录病毒载体介导小鼠骨髓细胞的基因转移中,SV(simianvirus)40启动子和内部核糖体进入位点(internalribosomeentrysite,IRES)对双基因共表达的影响。构建双基因中间序列分别为SV40启动子和IRES的载体pLESN和pLEIN。经包装获得较高滴度的病毒上清,以共培养的方式感染5-氟尿嘧啶预刺激的小鼠骨髓细胞。流式细胞仪检测表明转染效率约25%,PCR证明EGFP基因整合至骨髓细胞基因组。半固体培养转基因细胞7d,LEIN组获得具有G418抗性的集落中98%表达绿色荧光,而LESN组54%。结果表明:在双基因逆转录病毒载体介导的小鼠骨髓细胞的基因转导中,IRES与内部SV40启动子相比,更能保证双基因的共同表达。

肝细胞生长因子对骨髓内皮祖细胞的动员作用

目的 :分析肝细胞生长因子 (HGF)能否动员骨髓内皮祖细胞 ,以及动员的内皮祖细胞能否参与创伤修复时的血管新生和内皮修复。方法 :将腺病毒HGF载体 (adenovirusvectorencodingHGFgene,Ad HGF)经尾静脉注射到Balb/c小鼠体内 ,用ELISA方法检测血浆HGF水平的变化 ;用流式细胞术检测外周血CD34+ 细胞含量变化 ;对外周血单个核细胞进行分离、培养 ,并对生长的细胞克隆进行内皮细胞表面标志Tie 2、vW因子的免疫组化检测。建立雌性小鼠CCl4肝损伤模型 ,静脉移植HGF处理后雄性小鼠外周血单个核细胞到其体内 ,4W后利用原位杂交技术检测新生肝组织中是否存在雄性细胞。结果 :注射Ad HGF能明显提高小鼠血浆的HGF水平 ,并使外周血中以CD34、Tie 2和vW因子等为标志的内皮祖细胞的数量显著增多。这些细胞参与肝损伤修复时的血管新生。结论 :HGF对骨髓内皮祖细胞具有明显的动员作用。

肿瘤坏死因子α对红系造血的抑制作用

目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNF-α)在红系祖细胞造血过程中的作用。方法:利用免疫磁珠法分离并纯化人类外周血CD34+细胞,在体外与TNF-α一起培养,测定红系、非红系细胞扩增倍数及集落形成能力;用流式细胞仪检测细胞表面标记。结果:TNF-α抑制暴式红系集落形成单位(BFU-E)的形成及血型糖蛋白A(GpA)的表达,增加红系集落形成单位(CFU-E)和非红系集落的数量;GpA+细胞缺乏TNFR I表达,TNF-α增加GpA-细胞表达TNFRⅡ;这些TNFRⅡ+的GpA-细胞具有树突状细胞(DC)相关的表面标记。结论:TNF-α抑制红系祖细胞的生长,选择性地发生在分化的早期阶段,与TNF-α诱导增加的DC有关。

脐血造血干/祖细胞的密度分离实验研究

目的为建立脐血造血细胞库，减少脐血储存空间，探讨脐血造血干／祖细胞的密度分离效果。方法选用五种不同比密的 Ｆｉｃｏｌｌ分离液（１．０８４、１．０７７、１．０７２、１．０６４、１．０５４ ｇ／Ｌ）分离脐血细胞，采用流式细胞技术（ＦＣＭ）和全自动血细胞分析仪分析了４１例脐血造血干／祖细胞和有核细胞（ＮＣ）的回收率并作了对比研究。结果１．０６４ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌ分离脐血有核细胞回收率３．６％，淋巴细胞去除率为８６．６％２所分离的单个核细胞（ＭＮＣ）中ＣＤ３４＋细胞平均纯度为１０．３％，最高可高达４６．６％；所分离的细胞体外易形成 ＣＦＵ－ＧＭ及ＢＦＵ－Ｅ。结论不同比密分离脐血造血干／祖细胞具有不同影响。其中 １．０６４ ｇ／Ｌ Ｆｉｃｏｌｌ分离脐血造血干／祖细胞是一种方便、实用、有效的方法。所分离的细胞体外有较强的增殖能力。

Bmi-1基因调控造血干细胞自我更新的研究进展

造血干细胞(hematopoieticstemcell,HSC)的自我更新维持每天血细胞数量,Bmi-1基因属Polycomb(PcG)基因家族成员。最近研究表明,Bmi-1在调控正常和白血病干细胞的自我更新中起重要作用,本文就Bmi-1的结构,功能和在造血干细胞的自我更新中的作用作一简要综述。

长期运动对器官贮存铁和游离铁代谢的影响

目的观察运动情况下组织器官游离铁(FI)代谢和贮存铁(SI)的变化及其与非血红素铁(NHI)的关系。方法SD大鼠分为运动组(EG)和静息组(SG);EG游泳3个月后分析两组肝脏、脾脏、肾脏、心脏和骨髓细胞NHI和FI含量,计算SI和SI/FI的比率。结果与SG比较,EG的运动显著降低肝脏NHI和FI含量,减少SI含量,升高SI/FI比率;显著降低脾脏和骨髓细胞NHI含量,升高FI含量,减少SI含量,降低SI/FI比率;显著增加肾脏NHI含量和FI含量,增加SI含量,降低SI/FI比率;显著增加心脏FI含量,维持SI含量,降低SI/FI比率。结论长期运动导致组织细胞FI代谢和SI发生变化,但不同组织之间发生行为分化;运动导致不同组织细胞SI与FI之间的铁转移,在组间比较或不同组织之间应用NHI比较SI时要考虑FI的变化。

运动诱导的低铁状态大鼠骨髓细胞铁摄入的变化

本文观察了运动性低铁状态大鼠骨髓细胞转铁蛋白 (Tf)结合铁和非Tf结合铁摄入的变化。大鼠随机分为 6个月的运动组 (EG)和对照组 (SG)。SG平均每个幼红细胞Tf受体数为 890 15 0± 16 4849个 ,而在EG为 2 17536 0± 46 2 737个 (P <0 0 5 ) ,但受体的解离常数不受运动影响。EG中Tf的内吞平台和胞内铁聚积速度显著高于SG ,胞浆和胞内膜性成分中Tf结合铁和Fe(Ⅱ )摄入增加。EG的胞浆内Fe(Ⅱ )摄入的米氏常数值降低 ;细胞膜性成分中Fe(Ⅱ )摄入的最大速度增加。上述结果表明 ,运动不仅通过增加Tf受体的表达促进Tf结合铁的内吞 ,而且增强非Tf结合铁的内吞途径。尽管这些变化的机制尚不清楚 。

磷脂爬行酶1(英文)

磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1,PLSCR1)属于Ca2+结合的棕榈酰化II型膜蛋白,而非棕榈酰化的PLSCR1蛋白可定位于细胞核内,并与基因组DNA序列结合。最初的研究显示,PLSCR1参与细胞膜磷脂跨膜活动。随后的研究发现多种细胞因子如干扰素、表皮生长因子等和白血病细胞分化诱导剂如全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)、佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)等也能够调节PLSCR1的表达。尤其重要的是,PLSCR1蛋白可与多种蛋白如c-Abl、EGFR、c-Src、PKCδ和onzin等相互作用,提示PLSCR1在细胞信号传递中的作用。越来越多的证据表明PLSCR1的确参与细胞生长、分化、凋亡过程,并可能与肿瘤尤其与白血病发病学存在关系。

一个造血模型周期解的存在性及其性态

本文得到一个造血模型存在周期解的充分条件,并推出方程全部正解关于这个周期解全局吸引和周期解相交的充分条件。

急性白血病细胞造血细胞磷酸酶基因的突变分析(英文)

造血细胞磷酸酶 (HCP)在造血细胞发育、增殖及受体介导的有丝分裂信号传导通路中发挥关键的负调节作用 ,在motheaten小鼠中其突变可导致粒 单核细胞严重的过度聚积和功能紊乱。本研究旨在评价HCP基因突变在急性白血病发病中的作用。利用RT PCR ,SSCP及DNA序列分析技术检测了 4 1例急性白血病、8株白血病细胞系及 5 0例正常对照骨髓或外周血标本中HCP基因表达及突变情况。RT PCR显示所有标本中都有HCP基因表达 ,仅在 1例急性淋巴细胞性白血病细胞中发现一错义突变 ,发生在HCP基因氨基末端的SH2结构域 ;此外 ,分别在HCP基因的 6 9,85 ,86和 2 6 6密码子存在多态性。结论 :HCP基因突变在急性白血病中较少见 ,在白血病发病中可能起较小作用 ,需进一步研究澄清。

小鼠胎肝和骨髓细胞基因表达差异的比较研究

造血发育经历了从卵黄囊到胎肝、胎脾并最终定位于骨髓的复杂过程。虽然已有部分研究发现决定这一迁移过程的重要因素是造血微环境 ,但缺乏对不同造血器官微环境差别的系统性比较研究。为了探讨胎肝与成年骨髓造血微环境差别的分子基础 ,对小鼠胎肝和骨髓细胞RNA进行cDNA微阵列 (cDNAmicroarray)杂交 ,以生物信息学方法分析杂交结果 ,并以RT PCR和Northernblot对杂交结果进行进一步验证。结果表明 ,在 588种具有重要功能的已知基因中 ,二者相比 ,骨髓高表达的基因有 65种 ,胎肝高表达的基因有 13 1种。进一步分析发现骨髓高表达的基因中与造血相关的基因有 3 9种 ,胎肝高表达的基因中与造血相关的有 71种 ,分别占差异基因群的60 %和 54%。RT PCR和Northernblot验证的结果表明 ,CD18、CD44及PSGL 1基因在骨髓中高表达而在胎肝中低表达或不表达 ,此结果与微阵列杂交结果相符。同时还发现 ,CD18和CD44基因在胎肝中的表达水平随胎龄增加呈下调趋势。结论 :胎肝与骨髓细胞的基因表达谱显著不同 ,其中某些基因的表达随发育阶段不同而变化。这些基因的差异性表达 ,尤其是与造血细胞发育、迁移、植入等密切相关基因的差别性表达 ,可能是胎肝造血兴衰。

骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖的促进作用

本文通过制备小鼠骨髓内皮细胞无血清条件培养液(serum-free murine bone marrow endothelial cell conditioned medium, mBMEC-CM),经超滤分为分子量>10 kDa组分和<10 kDa组分,分别观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞集落生成的影响。用Wright’S Giemsa染色计数内皮细胞集落及检测骨髓内皮细胞的vWF,通过[3H]- TdR掺入量,观察mBMEC-CM原液及其组分以及外源性细胞因子对小鼠骨髓内皮细胞增殖的影响,并用分子杂交方法检测内皮细胞表达的细胞因子,从几个方面来研究mBMEC-CM对骨髓内皮细胞增殖的作用。结果显示,骨髓内皮细胞vWF 检测阳性。mBMEC-CM原液及其分子量>10 kDa组分能刺激骨髓内皮细胞集落增殖,且能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR 掺入量;分子量<10 kDa组分对骨髓内皮细胞集落增殖无明显刺激作用,也不能增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。外源加入IL-6、IL-11、SCF、GM-CSF、VEGF、bFGF 6种细胞因子能明显刺激骨髓内皮细胞集落增殖,SCF、VEGF、bFGF能明显增加骨髓内皮细胞[3H]-TdR掺入量。Atlas array膜杂交实验显示骨髓内皮细胞内源性表达GM-CSF、SCF、MSP-1、endothelin-2、thymosin β10、connective tissue GF、PDGF-A chain、MIP-2α、PlGF、neutrophil activating protein ENA-78、INF-γ、IL-1、IL-6、IL-13、IL-11、inhibin-α等细胞因子的mRNA。上述结果提示,骨髓内皮细胞无血清条件培养液对骨髓内皮细胞增殖具有促进作用。

小鼠骨髓内皮细胞条件培养液支持卵黄囊造血干/祖细胞的体外生长

目的观察小鼠骨髓内皮细胞条件培养液（ｍＢＭＥＣ－ＣＭ）对卵黄囊造血干／祖细胞体外生长的支持作用。方法取妊娠第８．５天的卵黄囊，经消化后获得卵黄囊细胞，取卵黄囊非贴壁细胞加入含１０％ｍＢＭＥＣ－ＣＭ和１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ中培养２４ｈ后，收集细胞做半固体培养。结果ｍＢＭＥＣ－ＣＭ在液体培养体系中能扩增卵黄囊造血干／祖细胞使粒－巨噬系集落形成单位（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＣＦＵ－ＧＭ）和高增殖潜能集落形成细胞（ｈｉｇｈ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ－ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｃｅｌｌ，ＨＰＰ－ＣＦＣ）的产率增加，经２４ｈ液体培养后的ＣＦＵ－ＧＭ和ＨＰＰ－ＣＦＣ的数目分别为培养０ｈ对照组的１１９．５％和１３０．８％（Ｐ＜０．０５＝；ｍＢＭＥＣ－ＣＭ联合ｆｌｔ３配基（ｆｌｔ３ｌｉｇａｎｄ，ＦＬ）和血小板生成素（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＴＰＯ）后，其扩增ＣＦＵ－ＧＭ和ＨＰＰ－ＣＦＣ的能力明显增强，ｍＢＭＥＣ－ＣＭ联合ＦＬ和ＴＰＯ经２４ｈ液体培养后的ＣＦＵ－ＧＭ和ＨＰＰ－ＣＦＣ的数目分别为培养０ｈ对照组的１３２．０％和１７６．９％?

小鼠造血干细胞表型及其分离纯化的研究进展

无论在纯化标记方面还是生物功能方面,造血干细胞都是目前研究最深入的成体干细胞,具有很大的临床应用价值。但是由于造血干细胞以极低比例存在于小鼠骨髓中,这给其分离纯化及功能研究带来了一定的难度。利用细胞表型和功能染料,通过免疫磁珠和流式细胞术可分离纯化骨髓和外周血中的造血干细胞。40年来,已有很多表面免疫表型确定可以富集小鼠造血干细胞,并且不断有新的免疫表型被发现,CD34-c-Kit+Sca-1+lineage marker-(CD34-LSK)是最常用的小鼠造血干细胞表型。本文就小鼠造血干细胞表型及分离纯化的研究做一综述。