苜蓿基因组密码子偏好性分析

物种基因的密码子使用具有偏好性,能避免氨基酸的错误掺入。苜蓿(Medicago)密码子的偏好性尚未见报道。为揭示苜蓿属基因组密码子偏好性特点,我们利用软件分析四种苜蓿基因编码区密码子组成、相对同义密码子使用频率(RSCU)等参数探讨密码子偏好性特点,同时用多种方法分析造成苜蓿密码子偏好性的影响因素,计算确定苜蓿的最优密码子,最后通过聚类分析研究物种间密码子使用偏好性进化关系。结果表明:四种苜蓿的密码子偏好性相对较弱,其中‘中苜1号’最弱,苜蓿密码子第三位偏爱使用A/T;四种苜蓿密码子偏好性受自然选择压力的影响大,最优密码子多以A/T结尾;四种苜蓿的偏好性相似,且与烟草(Nicatiana tabacum L.)、番茄(Solanum lycopersicum L.)偏好性接近。本研究为苜蓿密码子优化应用提供了理论基础,特别是通过优化可以提高Cas9蛋白表达量促进基因编辑。

根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系的优化

为进一步提高根癌农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化效率,本试验以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种‘中苜1号’为试验材料,通过筛选高效再生的植株,以筛选出的植株叶片为外植体,并通过调节培养基激素配比,在农杆菌侵染过程中添加谷氨酰胺、进行冷处理等措施优化苜蓿由农杆菌介导的遗传转化体系。试验结果表明:转化过程中以嫩叶作为外植体,菌液和重悬液中添加150μmol·L^(-1)乙酰丁香酮,侵染过程中使用300μmol·L^(-1)的谷氨酰胺将瞬时转化效率从32%提高至92%,转化效率提高到31%。研究紫花苜蓿的遗传转化体系可为紫花苜蓿高效遗传改良及基因功能研究提供了技术支持。

真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制探究

为探讨真菌诱导子调控紫草素合成的分子机制,以新疆紫草无菌苗为试材,经尖孢镰刀菌、立枯丝核菌制备成的诱导子生物诱导后,对其根部进行RNA测序和分析。结果表明,与对照组比较,尖孢镰刀菌试验组差异表达基因1735个;立枯丝核菌试验组差异表达基因1043个。GO(gene ontology)分析发现,2个试验组差异表达基因主要富集在细胞过程、细胞组分中膜和分子功能中催化活性等生物学过程。KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析发现,2个试验组在植物与病原菌互作、植物激素信号转导途径和苯丙素合成等通路均有大量差异表达基因富集。2个试验组差异表达情况相同的转录因子主要包括bHLH、AP2/ERF-ERF和LOB等,并发现参与紫草素合成及其正向调控的AeGHQH、AeDSH1、AeAP、AePAL、AeDI2、AePGT、AeHMGR、AeG10H基因在2个试验组均上调表达,其中尖孢镰刀菌试验组上调表达较显著。以上结果从分子水平探究了新疆紫草对真菌诱导子生物诱导的响应机制,为未来真菌诱导子应用于新疆紫草种植生产奠定了理论基础。

组蛋白去甲基化酶KDM5A调控H3K4me3参与神经管畸形发生的分子机制

神经管畸形(NTDs)的病因与防治是出生缺陷领域研究的重点,叶酸可以预防神经管畸形但其机制不明。本文借助低叶酸细胞模型和低叶酸NTDs小鼠模型通过染色质免疫共沉淀、Cut&Tag等技术,探讨了组蛋白去甲基化酶lysine demethylase 5A(KDM5A)及其调控的下游组蛋白H3K4me3修饰在叶酸缺乏导致的NTDs发生中的潜在分子机制。结果显示,低叶酸的细胞模型中,qRT-PCR、Western印迹结果显示,KDM5A分子表达明显下降(P<0.05)。作为组蛋白H3K4me3调控的上游关键酶,进一步通过染色质免疫共沉淀ChIP、ChIP-qPCR实验证实,叶酸缺乏下组蛋白H3K4me3在神经发育基因Axin 2和Atoh 1基因启动子区富集增加(P<0.05)。通过构建KDM5A基因敲除细胞模型,借助Cut&Tag试验证实,KDM5A基因敲除后H3K4me3主要富集在神经发育基因上。最后在低叶酸导致的NTDs小鼠模型的脑组织中,RT-qPCR、Western印迹以及ChIP-qPCR实验显示,E9.5 d的NTDs胎鼠脑组织中KDM5A表达下降(P<0.05),Axin2、Atoh1表达升高(P<0.05),Axin2、Atoh 1基因启动子区的H3K4me3富集增多(P<0.05)。综上所述,KDM5A蛋白在叶酸缺乏导致的NTDs中发挥重要作用,其可通过调控下游H3K4me3进而调控神经发育靶基因Axin2、Atoh 1异常表达,介导NTDs的发生。本研究从叶酸缺乏介导KDM5A调控组蛋白修饰来探讨NTDs的发病机制,为降低出生缺陷,促进生殖健康提供依据。

不同耐旱性肥披碱草干旱胁迫下生理响应和转录组学分析

肥披碱草(Elymus excelsus Turcz.)是禾本科披碱草属多年生草本植物,具有生长茂盛、叶片宽厚、营养价值高和适口性好等特点,是一种优质牧草。为探讨肥披碱草的耐旱性,本研究以前期从东北8个野生资源中筛选的耐旱型和干旱敏感型肥披碱草为试验材料,采用20%PEG-6000模拟干旱胁迫对幼苗(5周龄)处理0(对照),3,7和14 d,观察植株表型、测定渗透调节物质、活性氧代谢和抗氧化酶活性等生理指标的变化,并进行转录组测序,以探究肥披碱草在干旱胁迫下的生理响应及内在调控机制。结果表明:干旱胁迫下,与干旱敏感型相比,耐旱型肥披碱草的脯氨酸(Pro)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)、可溶性糖(SS)含量均显著升高(P<0.05),其中在胁迫14 d时脯氨酸含量和可溶性糖含量达到最高,比干旱敏感型分别提高20.39%和19.11%。转录组分析表明,耐旱型和干旱敏感型差异表达基因分别为3463个和2651个,其中有795个共同调控基因,上调633个,下调159个。耐旱差异表达基因主要富集在抗氧化活性、转移酶活性、精氨酸和脯氨酸代谢等途径中,其中proB、rocF和ALDH基因可能参与肥披碱草抵御干旱胁迫过程。本研究为进一步挖掘肥披碱草响应干旱胁迫的候选基因和耐旱育种提供了理论基础。

SCtool:识别复杂性状和疾病间遗传关联的工具

识别复杂性状和疾病间遗传关联可以提供有用的病因学见解,并有助于确定可能的因果关系的优先级。尽管已有很多工具可以实现复杂性状和疾病间遗传关联,但是某些工具代码可读性差、并且不同工具基于不同的计算机语言、工具间的串联性较差。因此,本研究基于全基因组关联研究(GWAS)数据,提出了SCtool,一个开源、跨平台和用户友好的软件工具。SCtool整合了ldsc,TwosampleMR和MR-BMA三种软件,其主要功能是基于GWAS汇总水平的数据,识别复杂性状和疾病、复杂性状和复杂性状以及疾病与疾病间的遗传相关性并探究其间潜在的因果关联。最后,使用SCtool揭示了全身性铁状态(铁蛋白,血清铁,转铁蛋白,转铁蛋白饱和度)与表观遗传时钟GrimAge之间的遗传关联。

魁蚶3个群体及杂交子代遗传多样性分析

为探明魁蚶不同群体间遗传多样性差异,以魁蚶中国群体、韩国群体和杂交子一代群体为研究对象,利用线粒体基因(16S rRNA和COⅠ)和核糖体内部转录间隔区(ITS-1)对5个魁蚶群体共150个样本进行遗传多样性分析。结果显示,魁蚶16S rRNA、COⅠ和ITS-1同源序列片段长度分别为605、766 bp和419 bp,其中16S rRNA和COⅠ基因片段A+T含量均高于G+C含量,ITS-1片段A+T含量均低于G+C含量。16S rRNA和COⅠ基因分别定义了4个和14个单倍型,主体单倍型所占频率分别为81.58%和61.43%,ITS-1定义了24种单倍型,主体单倍型所占频率为50.67%。单倍型邻接关系树结果显示,16S rRNA和COⅠ基因均为4个子一代群体聚为1支,即墨群体独有的单倍型为1支,而ITS-1的分支无明显群体特征。16S rRNA和COⅠ的遗传分化结果均表明,即墨群体与其他4个群体间遗传分化较大,其他4个群体间不存在分化;ITS-1的结果显示,5个群体间的遗传分化指数值均小于0.25,遗传分化不明显。试验结果表明,在进行魁蚶种内遗传进化研究时,线粒体基因的敏感性高于核糖体基因,即墨群体的遗传多样性明显高于4个子一代群体。

小鼠囊胚不同孵化结局的基因表达分化模式研究

目前对哺乳动物受精卵到囊胚发育命运的研究较为清楚,但囊胚孵化到着床前的分化过程还不明确,囊胚有两种孵化结局,即孵化和未孵化,故初步分析了囊胚两种孵化结局的发育差异.通过分析不同孵化结局囊胚的转录组,发现囊胚由扩张到孵化过程中基因表达呈现特异的趋势,1433个基因在孵化过程中表达上调,743个基因表达下调;如果囊胚未能孵化,这部分上调基因的表达调控受到显著抑制.孵化与未孵化囊胚间的差异基因涉及免疫与炎症、细胞分化、凋亡等生化过程,提示这些分子可能与着床过程的母胎识别相关.通过qPCR分析发现,孵化囊胚相较未孵化囊胚,基因Podxl、Lama1、Ptk2b表达上调,Pramel17、Amigo2、Pramel31表达下调,数据与转录组分析结果一致.结果表明:小鼠囊胚在孵化过程中基因表达呈现特定的分化,决定了孵化与否的命运结局,分化也与胚胎着床能力形成相关.

miR-34a靶向调控前列腺癌发生相关基因SIRT1的表达

前列腺癌在我国发达地区发病率迅速升高,化疗耐药是前列腺癌治疗最棘手的阶段,因此基于小RNA的无免疫原性的治疗具有广泛应用前景。研究表明miR-34a具有抑癌作用,而其靶标基因的鉴定鲜有报道。本研究结果显示SIRT1基因的表达存在着转录后基因表达调控机制。miRBase数据库预测显示SIRT1基因3'-UTR序列中存在着19个miRNA的靶标位点。通过系列截断实验及萤光素酶报告系统来鉴定到SIRT1基因3'-UTR区域中的功能miRNA为miR-34a。通过靶标位点的突变及三联体、miRNA的类似物及抑制剂来进一步验证了靶位点的有效性。在前列腺癌细胞DU145和CWR22RV1中存在miR-34a对靶标SIRT1基因的转录后抑制作用。本研究的结果可能为前列腺癌的miR-34a靶向基因治疗提供了理论依据。

斑马鱼prkd1基因在心脏早期发育过程中的作用研究

为了探究蛋白激酶D(protein kinase D,PKD;又名PRKD)家族典型成员prkd1基因对早期心脏发育的影响,选用模式动物斑马鱼为研究对象,设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示,prkd1基因敲低会导致斑马鱼心脏发育异常,出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型;斑马鱼心率分析数据显示,与野生型斑马鱼相比,prkd1基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精后3 d(3 days post fertilization,3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低prkd1组进行测序,差异基因富集分析表明,prkd1的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过qRT-PCR对高通量测序结果进行验证,并对早期心脏发育关键因子进行检测,结果显示,部分心血管相关基因显著下调,tbx5a、gata4等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明prkd1基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育关键基因来影响早期心脏发育,在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒S1、M和ORF3基因遗传进化分析

为了解2020—2021年我国部分地区猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)毒株变异及遗传进化情况,试验从多个地区的51家猪场采集340份疑似感染PEDV的猪小肠组织、粪便和肛拭子,提取病毒核酸后采用RT-PCR方法扩增S1、M和ORF3基因并测序,与GenBank中PEDV参考毒株进行比对分析,利用生物信息学软件构建遗传进化树,分析核苷酸序列同源性及氨基酸序列。结果表明:共获得57份PEDV阳性样品,来源于14家猪场,猪场阳性率为27.5%,并对从阳性猪场获得的14株毒株进行命名。与经典毒株CV777相比,14株PEDV毒株的S1、M和ORF3基因均出现不同程度的氨基酸突变。在14株毒株的S1基因中,Heyuan2021-7毒株位于G1-2分支,其余13株位于G2分支,14株毒株与参考毒株GD-A核苷酸序列的相似性较高,为89.3%~99.9%,存在多处氨基酸的缺失和插入。在M基因中,14株毒株位于G2分支且与参考毒株FR-001核苷酸序列的相似性为98.1%~99.7%,只存在氨基酸突变。在ORF3基因中,FC2021-1、GDzq2020-12、GDmm^(2)021-1和GDjm-DG-2021-12毒株位于G1-2分支,其余10株位于G2分支,14株毒株与参考毒株VN-JFP1013核苷酸序列的相似性为95.4%~99.3%,同源性较高,只存在氨基酸突变。说明2020—2021年我国部分地区流行的PEDV毒株有G1型和G2型毒株,其S1基因较M和ORF3基因突变程度更大,PEDV的流行情况相对复杂。

长非编码RNA TNRC6CAS1作为ceRNA在肥厚型心肌病发生发展中调控BPTF表达的研究

肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)是一种以心肌细胞肥厚为特征的原发性心肌病,其发病的分子机制尚未明确。本研究整合Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中编号GSE130036和GSE36946的数据集。利用R语言对数据集中的RNA表达矩阵进行表达差异性分析。对差异mRNA进行生物功能富集分析,明确研究对象染色质重塑因子以BPTF(bromodomain PHD finger transcription factor)为核心。预测miRNA靶向mRNA和lncRNA的结合位点,构建lncRNATNRC6CAS1,miR-30c-1-3p-BPTF内源竞争RNA(ceRNA)网络。利用实时定量PCR,酶联免疫吸附测定或免疫印迹检测,在肥厚型心肌病临床样本(20例健康人和20例肥厚型心肌病患者外周血)和心肌肥大细胞模型中验证了BPTF和lncRNA TNRC6CAS1表达的明显上调(P<0.001),而miR-30c-1-3p的表达明显下调(P<0.001)。同时,在AC16细胞中对三者的表达相关性进行初步验证。最后,分别沉默BPTF,lncRNA TNRC6CAS1或过表达miR-30c-1-3p可以抑制心肌肥大标志性蛋白质的表达。以上结果表明,lncRNA TNRC6CAS1,miR-30c-1-3p,BPTF构成的ceRNA网络可能参与调控肥厚型心肌病心肌肥大病理现象的产生。三者作为潜在的肥厚型心肌病致病分子,有望成为新的检测和治疗靶点。

m^(6)A修饰与阿尔茨海默病的研究进展

N^(6)-腺苷甲基化(N^(6)-adenosine methylation,m^(6)A)是将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基添加到腺苷N^(6)位点的表观遗传修饰,在20世纪70年代被鉴定出来,占成人大脑中全部信使RNA(messenger mRNA)碱基甲基化的80%以上^([1]),还可发生在微小RNA、长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)、转运RNA(transfer RNA,tRNA)和核糖体RNA中^([2])。

利用TurboID邻近蛋白标记技术获得水稻互作蛋白组的实验方法

TurboID邻近蛋白标记(TurboID-based proximity labeling,TbPL)技术是将诱饵蛋白融合TurboID生物素连接酶,在该工具酶的作用下将生物素标记到邻近蛋白上,最终通过链酶亲和素偶连磁珠将邻近蛋白富集下来,通过质谱分析的方式获得互作蛋白组。本文主要以水稻重要转录因子OsWRKY53为例,详细描述了利用TbPL技术获得水稻互作蛋白组的方法和注意事项。

基于转录组测序技术揭示克罗恩病中相关的可变剪接事件

通过利用转录组测序分析了解克罗恩病(Crohn’s disease,CD)相关的可变剪接事件,鉴定高度关联的RNA结合蛋白及潜在的调控靶基因,以揭示CD形成过程中相关遗传调控机制。通过下载33个GSE66207RNA-seq数据并进行预处理,其中包括6个非狭窄非穿透型(B1型)样品、6个狭窄型(B2型)样品、8个穿透/瘘管型(B3型)样品和13个正常结肠样品;对四组样品进行差异表达基因和可变剪接事件转录组分析、进行差异表达RNA结合蛋白与差异可变剪接基因之间的相关性分析。结果显示:(1)通过差异表达基因的转录组分析发现,以正常组为参考,B1型更多基因表现为下调,B2型和B3型更多基因表现为上调。B3型的差异表达基因数量比B2型多,暗示着CD病情进展为穿透后,更多基因会出现差异表达;(2)差异可变剪接转录组分析发现,CD中存在大量剪接异常,并发生在DNA复制和细胞周期进展中。GO功能注释和富集分析显示,在B1型、B2型和B3型中,参与细胞生长的基因都发生剪接异常,在B2型和B3型中发现明显的凋亡相关通路。(3)鉴定出14个调控差异可变剪接基因的RNA结合蛋白,包括:DAZL、DDX3Y、RPS4Y1、EIF1AY、TDRD1、RBM24、RNASE2、APOBEC1、NXF3、EEF1A2、RBFOX3、PALYL、RNF17和OASL。本研究对3种表型CD进行可变剪接分析发现:在CD疾病进展中,一些参与细胞增殖、凋亡和关键信号通路的基因发生了差异可变剪接,而实验研究鉴定出的RNA结合蛋白参与了这些可变剪接基因的调控。

组蛋白甲基转移酶SETD2在肾细胞癌发生中的作用机制

肾细胞癌是一种具有复杂遗传背景的癌症,研究表明,异常的表观遗传调控是肾细胞癌发生的主要原因之一。组蛋白甲基转移酶SETD2是一种重要的表观遗传分子,并且在肾细胞癌中具有很高的突变率。为了探究SETD2在肾细胞癌发生与发展中的作用和机制,该研究利用肾脏特异性敲除SETD2的基因小鼠模型与肾细胞癌表型分析,发现在VHL缺失的条件下,SETD2的缺失能够导致肾细胞癌的发生。转录组测序结果显示,SETD2的敲除导致了Wnt/β-catenin与FoxO信号通路的激活。该研究为肾细胞癌的治疗提供了新的靶点和思路。

Lactobacillus casei Zhang的甲基转移酶突变体与其野生型的代谢组学比较

DNA甲基化作为表观遗传学的重要组成部分,在细菌的很多生理过程中发挥着重要作用。作者基于超高效液相色谱-质谱联用非靶向代谢组学技术,比较DNA甲基转移酶突变体Lactobacillus casei(L.casei)ZhangΔpglX与野生型L.casei Zhang在对数生长前期(4 h)的代谢差异。共鉴定得到23个显著差异代谢物(P<0.05),主要富集在氨酰-tRNA生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢及半乳糖代谢等代谢途径。结果表明,DNA甲基化表型在对数生长前期可能会影响菌株对氨基酸的合成和利用;另一方面,DNA甲基化表型在对数生长前期可能会调节菌株细胞膜脂肪酸成分,改变细胞膜的通透性和流动性。

小鼠原始卵泡形成过程中可变剪切的动态变化

目的:通过对新生小鼠卵巢单个生殖细胞转录组数据进行挖掘,探究可变剪切事件是否参与调控小鼠卵泡组装过程的阶段转换。方法:基于小鼠单个生殖细胞转录组数据,用生物信息学方法分析卵泡组装过程3个细胞发育阶段的可变剪切事件及阶段转换之间的差异可变剪切事件,并用PCR验证差异可变剪切相关同源异构体的变化。结果:在小鼠卵泡组装3个发育阶段转换之间均检测到差异可变剪切事件,其中卵泡生成阶段可变剪切事件以及包囊破裂到卵泡生成时期的差异可变剪切事件富集最多,PCR验证了减数分裂相关同源异构体的变化。结论:可变剪切和小鼠卵泡组装细胞发育阶段转换相关,调控生殖细胞到卵母细胞转变过程。

斑马鱼chac1基因的表达特征及其在髓系造血中的功能研究

为探索chac1基因(ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 1)在早期胚胎发育中的功能,本研究以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象首先分析了斑马鱼Chac1蛋白的序列特征并用qRT-PCR检测了chac1在斑马鱼胚胎不同发育阶段和成鱼不同组织中的表达模式,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在chac1基因的三个外显子上设计了3条sgRNA并通过测序及qRT-PCR检测其敲除效率。苏丹黑染色3 dpf(days post fertilization)野生型和chac1突变型斑马鱼幼鱼的中性粒细胞数量;qRT-PCR检测突变斑马鱼髓系造血相关因子。结果显示:chac1是母源基因,在受精后0~3 hpf(hours post fertilization)时其表达量较高,之后随着母本基因的影响逐渐变小,chac1的mRNA表达量下降;在斑马鱼成鱼中,其在肌肉、卵巢、脑中高表达;此外,突变型斑马鱼较野生型斑马鱼相比,其苏丹黑染色阳性信号更多;chac1突变后髓系造血转录调控因子pu.1的mRNA水平上调。综上,chac1为母源基因,其缺失会促进早期中性粒细胞的发育并伴随着髓系造血转录调控因子pu.1的上调。

棉花45S rDNA内转录间隔区的克隆与分析

45S rDNA的内转录间隔区(Internal transcribed space,ITS)序列变异性强,是被广泛应用于物种间进化关系研究的序列标签.通过克隆艾克棉(Gossypium ekmanianum,AD_(6))、斯蒂芬斯棉(Gossypium stephensii,AD_(7))、异常棉(Gossypium anomalum,B_(1))、戴维逊氏棉(Gossypium davidsonii,D_(3-d))、克劳茨基棉(Gossypium klotzschianum,D_(3-k))、旱地棉(Gossypium aridum,D_(4))6个棉种的ITS序列,首次获得新鉴定的2个四倍体棉种艾克棉和斯蒂芬斯棉的ITS区序列信息,补充了异常棉、克劳茨基棉和戴维逊氏棉3个棉种ITS区序列的未知碱基.基于ITS序列信息构建了涵盖A,B,C,D,E,F,AD7个基因组的棉属系统发育树,确定了新鉴定的2个四倍体棉种进化地位,探讨了棉属亲缘关系.研究结果补充和完善了棉属ITS序列信息,进一步明确了棉属间的进化关系,为棉属亲缘关系分析提供参考.