基于分子标记技术构建黄瓜高通量分子育种体系

【目的】在黄瓜育种中,苦味和空心都是影响商品品质的重要因素。本研究针对调控苦味和空心的主效基因拟开发分子标记,并在此基础上建立两套精准且高效的分子育种技术体系。【方法】一是采用果实逆境下不苦的Bt新等位基因bt-2及其相关分子标记,结合Bi基因分子标记进行黄瓜的前景选择;二是利用CsALMT2基因上能够导致750份黄瓜重测序资源中14.27%的果实空心性状的SNP28756924开发分子标记,并进行KASP基因分型和田间表型验证。【结果】叶苦果不苦黄瓜双分子标记的高通量筛选显著提高了无苦味黄瓜株系的育种效率,选择准确率达96.87%;果实不空心分子标记的验证结果准确,表明该标记能够在苗期对黄瓜果实空心性状进行辅助选育。【结论】创建了叶苦果不苦和果实不空心黄瓜的高通量分子育种体系。与传统的苦味和空心检测方法相比,这两套体系具备高准确性、便捷性和高通量筛选的优势,加速了无苦味和不空心黄瓜的育种进程。

V(D)J重排酶RAG与转座子及转座子基因编辑工具的关系

V(D)J重排是高等脊椎动物产生特异性抗体和受体的基础事件,是适应性免疫的特征,其关键酶重组激活基因(RAG)及V(D)J重排如何起源是免疫学中的一个基础问题。多种证据表明RAG和V(D)J重排可能起源于转座事件。本文就V(D)J重排酶RAG的功能,及其和原始RAG转座子的关系进行论述,同时思考RAG转座子和转座子基因编辑工具的联系,旨在为新型基因编辑工具研发和利用提供参考。

CELⅠ酶的粗提取及其活性检测

CELⅠ酶是第一个从真核生物中提取的用于高效特异切割DNA双链碱基错配和DNA扭曲的内切酶,因而也是TILLING技术中用到的一种关键酶。文章对CELⅠ酶的粗提取及其活性检测进行了研究。错配切割实验表明,CELⅠ酶在包含有G→A点突变的杂合双链中,能有效地在错配位点进行切割,并可以通过ABI377测序仪获得直观的检测结果,从而可以用于TILLING分析。

大肠杆菌耐药株的体外诱导及其acrA和marA基因分析

为检测大肠杆菌在某抗菌素的环境压力下耐药性的变化及其与acrA和marA基因突变的关系。分别用四环素、氯霉素和环丙沙星对大肠杆菌质控株ATCC25922进行体外诱导培养,测定诱导前后多种抗菌药的MIC的变化;对各菌株的acrA和marA基因进行克隆和测定。四环素诱导株产生重耐药,氯霉素和环丙沙星的诱导引起单药耐药;四环素诱导株、氯霉素诱导株和环丙沙星诱导株的acrA和marA基因序列均与ATCC25922的一致。四环素、氯霉素和环丙沙星的诱导培养并未引起ATCC25922的acrA和marA基因突变,诱导引起的大肠杆菌耐药性变化是由于其acrA和marA基因突变以外的其他原因所致。

CRISPR/Cas12f及其衍生基因工程工具的研究进展

CRISPR关联基因12f(Cas12f)由于蛋白序列短,便于基因递送及后续的基因治疗,受到广泛的关注及越来越多的研究报道。本文系统性地回顾和总结了基因编辑系统CRISPR(成簇的规则间隔短回文重复序列)/Cas12f及其衍生的相关基因编辑工具的研究进展,深入探讨了Cas12f的结构特性、间隔子相邻基序(PAM)识别与切割机制,以及基于CRISPR/Cas12f的碱基编辑和转录调控,以期为进一步开发基于Cas12f的基因编辑及治疗工具提供参考。

凝乳酶的基因克隆、序列分析及初步表达

PCR扩增得到微小毛霉凝乳酶结构基因并测定其核苷酸序列,用DNAman软件分析其核苷酸序列及推衍得到的多肽序列,结果表明扩增得到的片段为凝乳酶基因。构建了重组菌Pichia pastoris KM71/PIC9K-mcp,通过G418抗性筛选得到具有多拷贝基因的整合重组菌MK3。用甲醇诱导进行初步发酵试验,测得重组菌MK3酶活为5.4U/ml。

基因重组Taq DNA聚合酶的制备

目的制备重组Taq DNA聚合酶,为PCR提供试剂。方法用Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coli菌株,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导12 h表达Taq DNA聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4℃透析,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和PCR扩增分析其纯度和活性。结果分离纯化制备的Taq酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DNA片段。结论该方法制备可用于PCR的Taq酶具有快速简便的优点。

化学核酸酶及其作用机理

化学核酸酶是一类人工设计、合成的ＤＮＡ或ＲＮＡ定位断裂工具，由核酸识别结合系统和化学断裂系统组成。它们能够在任何位点断裂单链、双链ＤＮＡ或ＲＮＡ，不受限制性内切酶的天然专一性限制。本文除介绍了一些新的化学核酸酶体系外，着重对它们的作用方式及作用机理进行了讨论。

Bridge Sequence对M1GS核酶体外切割活性的影响

目的探讨B ridge Sequence(桥序列)对M1GS核酶体外切割活性的影响,从而为人工M1GS核酶的优化设计提供一定的理论依据。方法以含大肠杆菌核酶P催化单位(M1 RNA)基因的pFL117质粒作为模板,通过巧妙设计不同的下游引物,经PCR扩增、扩增产物克隆及克隆基因的体外转录,构建一组具有不同桥序列的人工M1GS核酶。进一步将所构建的上述人工M1GS核酶分别与同位素标记的底物RNA片段进行体外切割试验,并通过同位素扫描成像系统对各M1GS核酶的切割产物加以分析。结果成功构建了针对HCMV UL54mRNA T7靶位的、四种不同桥序列长度的M1GS核酶,其桥序列长度分别为0n、t6nt、20nt和88nt,并依次命名为M1GS-T7(0)、M1GS-T7(6)、M1GS-T7(20)和M1GS-T7(88)。经体外切割试验证实,M1GS-T7(88)的靶向切割活性最强,M1GS-T7(20)的切割活性相对较弱,而M1GS-T7(0)及M1GS-T7(6)则无明显的切割活性。结论人工M1GS核酶中桥序列的长度对于其体外切割活性具有重要影响,提示在人工M1GS核酶的优化设计时,桥序列的长度是不可忽视的因素之一。

蓝藻氢代谢相关酶及其分子生物学研究进展

综述了蓝藻中催化氢代谢反应的2种关键酶—固氮酶和氢化酶的生物学特征、分子基础及其编码基因和转录等最新研究进展。蓝藻在固氮细胞中的净产氢量是固氮酶和氢化酶(包括吸收氢化酶和双向氢化酶)综合作用的结果,但在非固氮情况下的产氢则主要是由双向氢化酶催化的。可通过有效利用基因工程技术对产氢相关酶基因进行改造,改进生物产氢系统。

青蟹微卫星DNA的筛选及特征分析

利用磁珠富集法,结合生物素标记的(CA)16寡核苷酸探针从青蟹基因组MboI酶切片段中筛选微卫星DNA序列。将得到的片段与pGEM-T Easy载体连接后转化克隆构建微卫星富集文库。经PCR筛选检测,对89个阳性克隆进行测序,其中52个克隆中含有64个微卫星,完全型占87.50%,重复次数超过11次的占78.12%。根据所获微卫星的侧翼序列设计并合成了30对引物,通过优化PCR反应条件,并在35只青蟹个体中进行PCR扩增检测,最终获得了10对具有多态性的引物,为进一步开展青蟹遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究提供了基础资料。

不同生长速率花鲈肌肉转录组分析及生长相关基因筛选

【目的】筛选与花鲈肌肉生长相关的基因和信号通路,为揭示花鲈肌肉生长发育的遗传机制提供理论依据。【方法】分别取4尾生长快速[体长(34.22±2.53)cm]和4尾生长慢速[体长(17.46±1.78)cm]的花鲈个体肌肉进行转录组测序。用DESeq2 R软件包筛选差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),对DEGs进行GO富集和KEGG富集分析。通过实时荧光定量PCR验证转录组数据的准确性。【结果与结论】测序原始数据经过质量控制和组装共得到137960个unigenes,其中68334个unigenes在Nr中注释成功。获得10552个DEGs,其中2064个DEGs表达量上调,8488个DEGs表达量下调,鉴定出胰岛素样生长因子结合蛋白1基因(IGFBP1)、纤维细胞生长因子基因(FGF)、肌肉生长抑制素基因(MSTN)、生长激素受体1基因(GHR1)等与肌肉生长发育相关的基因。DEGs的GO富集结果显示,与物质和能量代谢相关的条目差异显著。KEGG富集结果显示,糖酵解/合成、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、脂肪酸降解、精氨酸和脯氨酸代谢等信号通路与肌肉生长密切相关。

抗HBV C区G_(11)饱和突变的发夹状核酶的体外制备

研究针对 HBV C区的 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶的体外制备 ,通过计算机设计针对 HBV C区的发夹状核酶 ,合成 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶基因片段 ,并把其克隆入自剪切核酶载体 p1.5的 3′- cis- Rz或 5′- cis- Rz之间。3 2 P标记 4种发夹状核酶的体外转录物 ,变性聚丙烯酰胺纯化回收获得 4种核酶。

细菌对氨基糖苷类抗生素产生抗性的机理及其控制策略

氨基糖苷类抗生素在治疗感染性疾病尤其是革兰氏阴性菌引起的严重感染方面起着重要作用 ,但是耐药菌株的出现较大地限制了此类抗生素的发展 ,因此 ,如何控制耐药性已经成为一项迫切需要解决的任务。细菌对氨基糖苷类抗生素产生抗性的机制很多 ,目前普遍接受的主要有三种 :1 通过减少对氨基糖苷类抗生素的摄取或减少药物在体内的累积而产生抗性。 2 通过改变核糖体结合位点而产生抗性。 3 通过表达氨基糖苷类抗生素修饰酶而产生抗性。目前细菌耐药性的控制主要集中在对原有氨基糖苷类抗生素进行改造或合成新的抗生素 ,开发氨基糖苷类抗生素修饰酶抑制剂。

位点选择对核酶体外切割活性的影响

应用计算机对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ二级结构进行模拟，设计针对ｍｄｒ１ｍＲＮＡ１９５９位ＧＵＣ和ｍｄｒ１ｍＲ－ＮＡ１７０５位ＧＵＵ的锤头状（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）核酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ）基因，定点克隆于质粒ｐＧＥＭＥＸ－１的ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ位点上；将ｍｄｒ１ｃＤＮＡ１３８３ｂｐ的片段亚克隆于ｐＧＥＭＥＸ－１的ＥｃｏＲⅠ位点上，在Ｔ３起动子作用下体外转录成ＲＺ１、ＲＺ２和１４３０ｎｔ的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ，比较ＲＺ１和ＲＺ２对１４３０ｎｔ的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ的切割活性的差异，结果ＲＺ１对１４３０ｎｔ的ｍｄｒ１ｍＲＮＡ切割活性较ＲＺ２高得多。上述结果表明：在应用核酶技术进行基因治疗时，应选择有效的核酶切割位点，以达到有效的治疗目的。

大肠癌PARP与微血管形成的关系

目的:探讨大肠癌PARP与微血管形成的关系及其可能机制.方法:应用SP免疫组化染色观察30例大肠癌中PAR的表达和微血管密度的变化,流式细胞计数和明胶酶谱观察5-AIQ抑制CT26细胞后MMP-9阳性细胞数和活性的变化.结果:在PAR强表达的大肠癌中,微血管密度高,弱表达则密度低,其差异具有统计学意义(P=0.0001,P<0.01);流式细胞计数中,与未处理组相比,用500μmol/L5-AIQ处理后,MMP-9阳性细胞的百分比降低;明胶酶谱显示,MMP-9的活性在500μmol/L5-AIQ处理组和未处理组中差异有统计学意义(P=0.0013,P<0.01).结论:大肠癌PARP的表达可能和微血管形成相关,PARP活性增强可能促进了肿瘤血管的形成.

CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒提取食用菌DNA

目的:为探索从食用菌子实体中快速分离和纯化DNA的方法。方法:以三种栽培的食用菌为材料,采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒进行基因组DNA的分离和纯化。结果:与对照相比,结合法提取DNA样品的电泳条带更规则、清晰,并且DNA的酶切效率显著高于对照。结论:该结合法是一种快捷、高效提取纯化食用菌子实体DNA的方法。

切割bcl─2RNA核酶的逆转录病毒载体的构建与鉴定

目的：构建逆转录病毒载体介导的切割ｂｃｌ－２ＲＮＡ的核酶（ＲＺ）基因真核细胞表达载体．方法：合成带有和表达载体克隆位点相匹配酶切位点的ＲＺ基因，先克隆于ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（－）的ＨｉｎｃⅡ位点，命名为３ＺＲＺ（＋）／（－），用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法进行测序，体外转录，进行体外切割反应．ＲＺ基因酶切回收后，定向克隆于逆转录病毒载体ｐＤＯＲ－ｎｅｏ中．结果：ＲＺ基因序列正确，具有切割活性，经酶切鉴定ＲＺ基因已被克隆于ｐＤＯＲ－ｎｅｏ的ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ位点，重组逆转录病毒载体命名为ｐＤＲＺ－ＲＺ．结论：体外合成ＲＺ基因后，可定向克隆逆转录病毒载体。

专一切割苹果锈果类病毒多体自切割核酶的克隆和转录物的体外活性测定

将苹果锈果类病毒的 1个 14nt的靶序列连接在锤头型核酶的 3′末端 ,构成自切割核酶。经人工合成和PCR扩增 ,克隆在转录载体pGEM7zf(+)的XhoⅠ HindⅢ位点。利用限制酶XhoI与SalI的连接 ,消失其识别位点序列 ,将自切割核酶片段插入到重组质粒中 ,经连续 5次亚克隆 ,分别获得 2、4、6、8、10和 12拷贝的多体自切割核酶。在T7RNA聚合酶作用下 ,线性化重组质粒转录的多体自切割核酶通过内部的顺式切割释放出较多数量的核酶分子 ,提示在转录水平能够提高核酶转录物的浓度。用相同摩尔浓度的单体和 12体自切割核酶分别对3 2 P标记的靶ASSVd进行反式切割 ,核酶与靶RNA摩尔浓度比为 1:1。放射自显影结果表明 :多体自切割核酶对靶ASSVd的切割效率明显高于单体自切割核酶。

耐热性碱性磷酸酯酶作为非放射性标记物的研究

通过生物素与亲和素－酶复合物系统或地高辛与抗地高辛－酶复合物系统可把酶间接标记到探针上．Ｒｅｎｚ等通过不同的化学方法直接把酶标记到探针上［１～３］．耐热性碱性磷酸酯酶ＦＤ－ＴＡＰ（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）具有耐...