依托合成生物学竞赛培养创新人才的探索与实践

培养具有科研创新实践能力的人才是高校人才培养使命的重要体现。随着科教融合理念的发展,学科竞赛已成为创新型人才培养的重要支撑。本文基于合成生物学领域的顶级国际性赛事国际基因工程机器大赛(iGEM)和国内赛事合成生物学竞赛-创新赛(SynBio)对于大学生主观能动性和创造力的要求,结合南京工业大学iGEM团队连续五年的参赛历程,探索了以高水平竞赛为依托的拔尖创新人才培养模式,提出了将竞赛、科研和教学三者相结合,通过建立以兴趣为导向、学生为主体的学习模式,以创新为核心、实践为基础的科研训练,以学科交叉为特色、团队协作为基石的教育平台,促进拔尖创新人才培养的质量不断提升。

我国草原分区-分类-分级生态修复模式研究

草原是我国重要的自然资源和生态屏障,草原生态修复是我国生态文明建设的重要内容,也是提升草原生态系统服务功能和固碳潜力的重要途径。已有大量研究针对退化草原提出了多种有效的生态恢复措施,但缺乏系统性和针对性的总结。本文在系统梳理和总结国内外草原生态修复研究的基础上,基于文献计量学的研究方法,总结了我国草原生态修复经历的三个阶段。同时,针对不同区域、不同退化/受损/破坏类型和和不同退化程度的草原,探索和提出了我国草原分区-分类-分级生态修复模式,并对我国草原生态修复的未来发展提出了相关建议,以期为我国草原生态修复和可持续管理提供科学依据和参考。

CRISPR/Cas基因编辑及其新兴技术在丝状真菌研究中的系统应用

丝状真菌(filamentous fungi)具有独特的形态和细胞构造,与人类健康和工农业生产息息相关,对这类生物资源的开发和利用高度依赖高效的基因编辑平台。然而,由于丝状真菌复杂多样的遗传背景,使用传统的基因编辑技术较难实现大范围的基因编辑,极大地妨碍了丝状真菌的遗传学研究。CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein)技术的出现,打破了这一困境,促进了不同种属和不同来源的丝状真菌的基因编辑,为丝状真菌的基础和应用研究带来了革命性的突破。本文简述了CRISPR/Cas系统的作用机理、分类及基于CRISPR的各种新型技术,归纳总结了丝状真菌中现有的CRISPR/Cas9系统功能组分、多种新兴CRISPR/Cas技术在丝状真菌中的应用现状以及海洋真菌中的CRISPR/Cas技术的应用情况。最后,对CRISPR/Cas系统在丝状真菌中应用进展缓慢、编辑效率低和脱靶效应等问题以及针对这些问题的潜在解决方法进行总结和展望,以期为不同类型的丝状真菌基因编辑平台的构建提供参考。

引导编辑研究进展及其应用

引导编辑器(prime editor,PE)是继碱基编辑器(base editor,BE)之后新问世的基于CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统的基因编辑工具,可以在不造成DNA双链断裂的情况下引入碱基替换、插入和删除。PE因其全面的编辑能力,问世即受到全球学者的广泛关注,然而PE表达盒编码较长(>6 kb)、编辑效率较低等问题也亟待研究人员解决。PE的研究方向与BE有许多相似之处,本文首先梳理了学界对PE本身编辑效率和安全性的探索;然后重点介绍了PE效应蛋白、pegRNA和其他细胞因子三个方面对PE的改进手段,以及为方便PE应用而开发的自动化设计工具;最后梳理了PE在动植物以及基因治疗中的应用。方兴未艾的PE领域尽管还难称完善,但在提高编辑效率和改进安全性等方面已取得了许多重要进展。鉴于Cas9、BE等基因编辑工具已广泛应用于遗传病疗法,PE走向遗传病治疗值得期待。

转基因检测标准的方法验证工作研究

转基因检测标准为转基因食品的有效标识、科学监管、推广应用提供重要的技术支撑。方法验证工作是指实验室通过一定的科学方法,验证上述转基因检测标准在实验室现有的人员、设备、场地环境等条件下是否可得到令人满意的结果。方法验证工作直接影响到标准的实施和应用,但现有的转基因检测标准的验证方法,大部分只提供了方法验证的定义,缺乏具体的操作方案。从验证工作的仪器设备、试剂及标准物质、技术验证参数、环境要求等关键要素进行讨论,提出相应的验证工作建议,旨在为农业转基因实验室开展方法验证提供详细的技术指导,并为我国转基因标准体系的应用推广提供参考。

CXCR2基因敲除HeLa细胞株构建及转录组测序分析

目的通过基因敲除和转录组测序探究CXCR2相关功能基因及信号通路,揭示其在宫颈癌中的分子作用。方法设计构建靶向CXCR2基因的CRISPR-Cas9敲除质粒载体,转染HeLa细胞并筛选获得CXCR2基因敲除的细胞株。转录组测序分析差异表达基因,并进行基因本体(GO)分类富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析筛选信号通路和重要差异表达基因,差异表达基因经实时荧光定量PCR方法验证。结果成功构建了CXCR2基因敲除细胞株,转录组测序获得1519个差异表达基因,其中上调表达基因428个,下调表达基因1091个。GO富集分析显示了细胞组分、生物学过程、分子功能方面富集量前20的条目;KEGG信号通路富集分析显示,富集基因最多的为肿瘤相关通路,其次为PI3K-Akt信号通路和HPV感染信号通路。通过韦恩图分析获得了7个共同差异表达基因:EGF、FN1、ITGA2B、CCND3、PIK3CD、PDGFRB、CDKN1A,其中前6个基因表达显著下调,CDKN1A表达显著上调。结论转录组测序分析结果进一步提示CXCR2在宫颈癌中发挥作用,并初步确定了与其相关的信号通路和关键功能基因,为宫颈癌的分子机制和临床研究提供了理论基础。

微藻油脂合成的转录调控研究进展

生物燃料是传统化石燃料的理想替代品,微藻是生产生物燃料的优良原料,通过对微藻油脂合成和调控的了解,能够有效提高微藻生产生物柴油的效率。转录因子是一种具有特殊功能结构、行使调控基因表达功能的蛋白质分子,在复杂的油脂合成代谢过程中,转录因子能对代谢过程中多个酶系进行集体调控,从而促进藻细胞中油脂积累。从微藻油脂的合成途径出发,简要介绍了合成途径中的关键酶,重点综述了bZIP、MYB、Dof、bHLH转录因子对于微藻油脂合成的调控影响。微藻油脂合成涉及多个亚细胞单位的多条途径,是一个十分复杂的代谢网络过程,通过基因工程手段改变合成途径中相关酶的表达可以增加微藻中油脂积累。

植物SWEET基因及其糖转运功能研究进展

SWEET(sugars will eventually be exported transporter)是一类介导蔗糖或己糖通过顺浓度梯度被动扩散跨细胞膜转运的新型糖转运蛋白。植物SWEET蛋白包括7个跨膜结构域,其中包含2个MtN3/Saliva结构域,可分为4个进化分支。SWEET转运蛋白在多种生理和生化过程中发挥着关键作用,包括韧皮部装载、激素运输、营养和生殖生长等。结合当前SWEET转运蛋白的研究进展,重点总结了SWEET的发现、蛋白结构及其在糖转运中的生物学功能,指出目前植物SWEET基因研究面临的问题,并对未来SWEET蛋白的研究重点进行了展望:1)探究SWEET蛋白的底物识别机制;2)挖掘提高作物产量和品质的关键SWEET基因;3)利用SWEET基因编辑和磷酸化等策略改良作物产量和品质。

贻贝足蛋白fp-5在大肠杆菌中的表达、修饰与功能分析

将地中海贻贝足蛋白fp-5与不同细菌来源的酪氨酸酶在大肠杆菌中共表达,通过体内修饰获得性能改善的贻贝足蛋白。在对序列分析和密码子优化的基础上,分别构建包含酪氨酸酶与贻贝足蛋白基因的单载体和双载体共表达系统,以实现其在大肠杆菌中表达。纯化后的蛋白通过NBT/Gly染色试验和酸-硼酸盐差异光谱法分析,表明fp-5发生了不同程度的羟基化修饰,其中fp-5与来源于多刺疣微菌(Verrucomicrobium spinosum)的酪氨酸酶(TyrVs)共表达得到的5-Vs质量浓度为18.6 mg/L,修饰率达到55.20%,黏附力约为未修饰fp-5的4.6倍。与体外修饰贻贝足蛋白相比,TyrVs体内修饰得到的5-Vs具有广泛的羟基化水平以及优秀的附着力和黏附力,为生物医药等领域提供了一种有潜力的生物胶材料。

腺相关病毒在脂代谢研究和降脂基因治疗中的应用

动脉粥样硬化性心脑血管疾病是当前全球死亡率最高的疾病,而脂代谢紊乱是动脉粥样硬化性心脑血管疾病的主要病因,其既可以导致心肌梗死、脑卒中、急性胰腺炎等急性病,也可以导致慢性肾脏疾病。近年来基因治疗技术的快速发展,为脂代谢机制研究提供了有效的手段,特别是使先天性脂代谢异常患者的治愈成为可能。腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)宿主范围广、安全性高、免疫原性低、表达长期稳定,是当前单基因遗传病基因治疗首选的递送工具。以AAV为载体的多种降脂基因治疗药物目前已经得到临床应用或正在进行临床试验。本文综述了AAV载体在脂质代谢机制研究的新进展及其在降脂基因治疗中的应用和前景。

毛叶悬钩子和云南悬钩子叶绿体基因组比较分析

毛叶悬钩子(Rubus poliophyllus)和云南悬钩子(Rubus yunanicus)隶属于蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)的尖叶亚组(Subsect.Acuminati),二者的形态特征和地理分布较为相似,因此难以分辨。通过Illumina高通量测序技术得到了二者的叶绿体基因组序列,并对序列进行过滤、组装、注释和分析,构建了基于叶绿体基因组序列的系统发育树。结果表明,毛叶悬钩子和云南悬钩子的基因组全长分别为156298 bp和156299 bp,基因组序列总GC含量均为37.2%。均检测到159个叶绿体基因,其中蛋白质编码基因104个,tRNA基因45个,rRNA基因10个。毛叶悬钩子和云南悬钩子均含有17个回文重复序列,正向重复序列个数分别为19、17,反向重复序列分别为4、3。二者的同义密码子使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)>1.00的密码子均有32个,密码子偏好以A/U结尾,有效密码子数均大于45。根据叶绿体全基因组及筛选到的rpoC1-rpoB基因序列所构建的系统发育树显示,毛叶悬钩子和云南悬钩子均聚为同一个分支,表明二者具有较近的亲缘关系。研究结果可为毛叶悬钩子和云南悬钩子的物种分子鉴定、遗传多样性研究及其系统发育关系提供理论依据。

酿酒酵母转座子介导外源基因的整合效率

为了比较分析酿酒酵母不同转座子对外源基因整合效率的影响,构建了转座子Ty1、Ty2和Ty4介导的G418表达盒及酿酒酵母BY4741重组菌BY-Ty1、BY-Ty2、BY-Ty4。研究发现,Ty2介导的整合型表达G418的BY4741重组菌转化平均菌落数为122,整合效率为93.33%,均高于Ty1和Ty4。Ty2介导的G418抗性重组菌BY-Ty2,比BY-Ty1和BY-Ty4对G418抗耐受性更强,基因拷贝数更高。结果表明,转座子Ty2更适合在酿酒酵母中介导外源基因整合。

鸡的FETUB基因真核表达载体的构建及其在LMH细胞中的表达

胎球蛋白B(FETUB)是一种新型的脂肪因子/肝因子,是由肝脏产生并释放入血液的半胱氨酸蛋白酶抑制剂,其在糖脂代谢中起重要作用.本研究目的是构建鸡的FETUB基因真核表达载体,在LMH细胞过表达FETUB后研究其对其他脂类相关基因表达的影响.采用荧光定量PCR检测FETUB基因在鸡各种不同组织中的表达量,以肝脏组织总RNA为模板,RT-PCR扩增鸡FETUB基因编码区,并构建真核表达重组载体,转染LMH细胞后分别提取总蛋白和总RNA,Western Blot检测重组蛋白表达,荧光定量PCR检测脂类代谢相关基因的表达.结果显示,FETUB基因在鸡11种不同组织中有表达,其中在肝脏中表达量极高,小肠和肾脏中表达较高,而在肌胃、脾脏、脂肪中表达量较低.通过RT-PCR获得鸡FETUB基因CDS,构建真核表达载体pCMV-3Tag-9-ggaFETUB,在LMH中成功融合表达FETUB-MYC.FETUB基因过表达使LMH细胞LPL和ITIH2基因表达均显著下调,而对APOA4、DGAT2、FASN、ACACA四个基因的表达没有显著影响.研究结果表明FETUB基因通过抑制LPL和ITIH2基因表达来影响脂类代谢,为进一步分析鸡的FETUB基因的功能奠定基础.

兰花分子育种技术研究进展

兰花具有很高的观赏、药用、食用、生态和文化价值,因其丰富的种类、独特多样的花型、迷人的花色、怡人的香气和神秘的起源受到各国人民的喜爱。分子育种是兰花育种的发展方向,本文对近年来兰花基因组测序、主要育种目标性状的分子遗传基础和基因克隆以及转基因、基因编辑、分子标记辅助选择育种技术等方面的研究进展进行了综述,并对未来兰花分子育种技术研究的重点和品种创新进行了展望。

结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠的构建及初步表型分析

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建Retnlb基因的floxp敲入小鼠Retnlbflox/+,进一步根据Cre-LoxP重组酶系统,构建肠道上皮Retnlb基因敲除小鼠(Retnlb-CKO),为后续探究Retnlb基因在炎性肠病中的发病机制提供动物模型。方法:选取8周龄基因型均为Retnlbflox/+的雌、雄C57BL/6N小鼠合笼杂交,筛选出基因型为Retnlb^(flox/flox)的小鼠,将该基因型的小鼠与肠道上皮细胞特异性表达Cre重组酶(Vil1-Cre)工具鼠进行杂交繁育,筛选获得基因型为Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠;再将Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠与Retnlb^(flox/flox)小鼠杂交获得Retnlb^(flox/flox),Cre+目的小鼠(Retnlb-CKO)。选取8周龄Retnlb^(flox/flox),Cre+小鼠与同窝Retnlb^(flox/flox)小鼠各6只进行后续实验。采用RT-qPCR和免疫组化分别检测结肠上皮Retnlb mRNA和蛋白水平。观察每组小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力等表型,计算其各组织重量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况。检测小鼠的肠道屏障完整性和结肠免疫炎症因子的表达情况。结果:通过基因鉴定、mRNA及蛋白水平证实肠道上皮细胞特异性条件敲除小鼠构建成功。与对照组小鼠相比,Retnlb-CKO小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力均未发生明显的变化,心、肝、脾、肺、肾和结肠的重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。检测Retnlb-CKO小鼠结肠组织的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin3的mRNA表达显著降低(P<0.01),PAS染色和免疫组化结果分别显示Retnlb-CKO小鼠结肠组织的杯状细胞数量和溶菌酶阳性细胞数量均显著减少(P<0.01)。HE染色观察Retnlb-CKO小鼠的结肠组织显示没有明显的炎症细胞浸润,RT-qPCR进一步显示结肠组织的促炎因子NLRP3、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达显著下调(P<0.01),同时,炎症信号通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB表达也显著下调(P<0.01)。结论:成功构建并验证了条件性结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠模型。结肠细胞缺失Retnlb会导致肠道屏障受损,结肠组织促炎因子mRNA表达显著降低,炎症通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达显著下调。

β_(1)-肾上腺素能受体基因多态性对STEMI患者室性心律失常和短期预后的影响

目的:分析β_(1)-肾上腺素能受体基因多态性对急性ST段抬高型心肌梗死(STEMI)患者室性心律失常以及6个月预后的影响。方法:采用回顾性队列研究方式,按照纳入与排除标准选择云浮市人民医院2021年1月至2023年2月间收治的STEMI患者为研究对象,采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析患者β_(1)-肾上腺素能受体Arg389Gly基因型多态性,并根据β_(1)-肾上腺素能受体Arg389Gly基因型多态性类别分为CC组(Arg389Arg,87例)、CG组(Arg389Gly,73例)和GG组(Gly389Gly,18例)三组。对比三组患者收集的入院临床资料[包括Killip分级、心率、收缩压、舒张压、左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末径(LVDD),以及血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、N末端B型利钠肽前体(NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、超敏C反应蛋白(hs-CRP)等]和出院后通过门诊或电话对其进行6个月随访的结果(包括心率、NT-proBNP、CK-MB、LVEF、LVDD及主要心脏不良事件)的差异。结果:研究共纳入178例STEMI合并室性心律失常的患者,其中CC组有87例(48.9%),CG组有73例(41.0%),GG组有18例(10.1%);三组患者的年龄、性别、体重、BMI、吸烟史、饮酒史、合并疾病、收缩压、舒张压、心率、Killip分级(Ⅲ和Ⅳ级)以及血清TNF-α、NT-proBNP、CK-MB、hs-CRP及LVEF和LVDD均没有显著差异(P>0.05);随访6个月GG组和CG组心功能各项指标结果均显著优于CC组(P<0.05),而GG组的NT-proBNP和CK-MB结果显著低于CG组(P<0.05);统计三组患者随访期间主要心脏不良事件的发生情况,显示CC组的总发生数为17例(19.5%),CG组的总发生数为5例(6.9%),GG组的总发生数为1例(5.6%),组间差异显著(χ^(2)=6.887,P<0.05)。结论:β_(1)-肾上腺素能受体Arg389Gly基因多态性与STEMI合并室性心律失常患者的病情严重程度无关,但与治疗后心功能改善情况以及短期预后有关。

扩张型心肌病动物模型及治疗的研究进展

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)是一类以一侧或双侧心室扩张和收缩功能障碍为特征的心血管疾病,发病原因包括遗传性的基因突变及多种继发因素。人类DCM动物模型涉及小鼠、大鼠、斑马鱼、猪等多种实验动物,一般通过基因编辑、药物诱导、自身免疫缺陷诱导、病毒感染等方法构建。借助DCM动物模型,研究者对该病的致病机制和治疗靶点进行了深入的研究。本文简述了人类DCM的病理特征、临床症状和流行病学特征,对近年来DCM动物模型的种类和构建方法进行了综述,并对优化造模方法与推动治疗研究提出了新的展望。基于DCM动物模型的治疗研究可以帮助我们更好地理解DCM的发生机制,为开发新的治疗方法提供依据。

胰腺多肽纳米抗体的制备及结合活性分析

胰腺多肽(pancreatic polypeptide,PP)是一种含36个氨基酸的胰腺激素,在评估胰腺功能和辅助诊断相关疾病中发挥重要作用。以PP为靶点,筛选特异性的PP纳米抗体,评估其与PP抗原是否具有结合活性。利用原核表达系统制备了高纯度的PP抗原,经免疫羊驼后构建了高库容和高丰度的胰腺多肽免疫的纳米抗体噬菌体文库,并通过噬菌体展示技术进行文库筛选,获得8株胰腺多肽纳米抗体。选取1株纳米抗体(PP-VHH)构建原核表达体系,经IPTG诱导表达、纯化与鉴定,通过间接ELISA和双抗夹心ELISA分别检测和评价抗原抗体的结合活性和血清中PP含量,结果显示,PP-VHH与PP具有结合活性,且PP-VHH可用于检测鸡和人血清中的PP。建立的双抗夹心ELISA法拟合曲线R^(2)为0.9868,可检测不同个体鸡血清中PP浓度为48~55 pg/mL。而人血清中PP浓度范围波动较大。综上所述,本研究筛选到的1株纳米抗体PP-VHH,可用于检测鸡和人血清中的PP含量,为评估胰腺功能异常或诊断相关疾病提供基础。

CRISPR/Cas9编辑系统在微生物天然产物研究中的应用

微生物作为天然产物的巨大宝库,一直以来都是研究人员挖掘和开发新的活性化合物的重要来源。目前,利用基因编辑工具发现、生物合成和代谢调控天然产物的研究方法受到该领域研究者的广泛关注。CRISPR/Cas9遗传编辑系统以其独特的灵活靶向优势克服了其他遗传编辑方法常见的对序列同源或位点限制,简化了实验步骤,提高了实验效率,促进了天然产物研究领域的发展。本文主要介绍CRISPR/Cas9系统在微生物天然产物发现、生物合成和工程改造方面的应用,分别从CRISPR/Cas9系统的发展、天然产物生物合成基因簇的克隆和遗传编辑、天然产物结构衍生化和代谢调节、沉默天然产物基因簇的激活这几个方面阐述CRISPR/Cas9系统在微生物天然产物研究领域的优势。最后,针对CRISPR/Cas9系统无法克服的重组效率和宿主适应性问题提供了可行的解决思路。相信随着合成生物学和信息技术的发展,越来越多的与CRISPR/Cas9系统相关的遗传操作工具和方法会被开发,将不断推动天然产物领域的发展进步。

腺嘌呤碱基编辑器及其临床应用

人类遗传病致病基因一半以上是点突变,对其进行精确、高效的原位修复是遗传病治疗最理想的方式。鉴于点突变中大部分为鸟嘌呤(G)与腺嘌呤(A)之间的转换,而基于CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)系统的腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)通过将A转换为G,从而修复这些突变,因此该种碱基编辑在人类遗传病治疗中特别重要。近年来,ABE不断被优化,特别是碱基编辑器的活性和保真性均被提高。本文总结了有关ABE的研究进展,特别是ABE研发过程中重要的突变体,同时对现有ABE仍然存在的缺陷进行了思考。另外,对ABE在临床(含临床前研究)方面的相关应用也进行了回顾。本文为发现和优化新型ABE及其应用提供参考。