酶催化固碳过程及其强化技术研究进展

全球范围迅猛发展的工业生产导致温室气体CO_(2)的排放,引发人们对全球气候变化的普遍关切。在发展清洁能源、工业流程再造等减少碳排放的同时,开发高效、经济的CO_(2)捕集、利用与储存(CCUS)技术显得尤为迫切。本文基于CO_(2)资源化利用的目的,对生物体外酶催化固碳过程及其强化技术的研究进展进行综述。首先,介绍了CO_(2)转化过程中涉及的关键催化酶及其优化,阐述了CO_(2)资源化利用的具体策略,涵盖了将CO_(2)催化转化为甲酸、甲醇、甲烷、淀粉以及L-乳酸、丙酮酸等特定产物分子。进而,重点阐述了辅因子的原位再生、酶的固定化、反应系统的优化设计、反应条件优化(pH、温度、底物浓度)以及产物原位分离等技术对CO_(2)生物酶催化反应过程的强化,实现CO_(2)的高效固定与资源化利用。旨在通过多方面交叉论述,为生物酶催化过程及路线设计包括固定化酶催化剂的制备、反应器选择设计与开发、酶催化过程调控、高值化产品定向合成等提供有益的启发和思考。最后,总结了酶催化固碳过程存在的问题和挑战,并对其未来值得研究的方向进行了展望。

蛋白质分子表面氨基酸突变提高植酸酶Yi APPA的活性和热稳定性

为了提高植酸酶的活性和热稳定性,增加其在食品加工领域的应用潜力,对植酸酶Yi APPA进行同源模建,结合蛋白质分子表面氨基酸突变策略,选择位于分子表面的赖氨酸和甘氨酸进行定点突变,构建单位点突变体。通过活性和热稳定性筛选,获得活性和热稳定性显著提高的突变体K216R以及热稳定性提高的突变体K189R。通过有益突变位点叠加策略,进一步构建并表征组合突变体K189R/K216R的酶活力及热稳定性。结果表明:与Yi APPA相比,K189R/K216R于80℃半衰期由14.81 min延长至23.35 min,半失活温度由55.12℃提升至62.44℃,热解折叠温度由48.36℃提升至53.18℃。并且K189R/K216R于37℃、pH 4.5的酶活力由3959.98 U/mg提高至4469.13 U/mg。分子结构建模和分子动力学模拟的结果显示:K189R/K216R中引入了新的氢键,能够提高酶部分结构单元的稳定性,使其热稳定性得到提高;同时K189R/K216R的催化口袋体积增大是其活性提高的主要原因。本研究通过蛋白质分子表面氨基酸突变策略可有效提高植酸酶Yi APPA的活性和热稳定性,为植酸酶及其他类型酶的分子改造提供参考依据。

Taq DNA聚合酶的分子改造及其在探针法qPCR直扩体系中的应用

Taq DNA聚合酶作为实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)技术的核心组分,其性能优劣直接影响qPCR技术的进一步发展。然而,野生型Taq DNA聚合酶的耐抑制剂性能差、延伸性能不足。为获得具有高性能的Taq DNA聚合酶,采用基因工程技术将双链DNA结合蛋白Sso7d或Sto7d融合在野生型Taq DNA聚合酶的N端或C端,构建了4个均可溶表达的改造体,再经过耐受性测试筛选较优的改造体,结果显示:改造体Taq-Sto的耐受性最高,其热稳定性不受影响,且在1 s/kbp的延伸条件下能成功扩增靶标,表明Taq-Sto具有增强的延伸性能,在TaqMan探针法qPCR体系中对腐殖酸、单宁酸、全血等抑制剂同样表现出良好的耐受性。EMSA实验发现:Taq-Sto对DNA模板的结合亲和力有所提高,有利于增强Taq-Sto对模板的竞争力;将Taq-Sto应用于非洲猪瘟病毒(ASFV)的TaqMan探针法qPCR检测,与商品化试剂相比,Taq-Sto具有更低的ASFV检出限,且在体积分数为2%~6%的猪粪便样本或猪肉样本中的检测灵敏度分别为100.0%和85.4%,说明Taq-Sto在直扩qPCR检测领域更具有优势。

生物表面活性剂及其复配体系在三次采油中的应用

表面活性剂具有良好的驱油效果,是应用最广泛的化学驱油剂之一,但在应用中存在不足:表面活性剂在地层中的降解和吸附损失较大,导致使用成本高;表面活性剂在高温高盐条件下会失去活性。与不可降解的化学表面活性剂相比,生物表面活性剂因具有低毒或无毒、可生物降解、表面活性优异、环境相容性及稳定性好等优点,在三次采油中有良好的应用潜力。本文首先对生物表面活性剂进行分类并简述常用生物表面活性剂的性能;其次详细阐述了单一生物表面活性剂、多种生物表面活性剂、生物表面活性剂与化学表面活性剂复配、生物表面活性剂与纳米材料复配驱油在三次采油应用方面的研究进展;最后对生物表面活性剂在三次采油中的发展趋势进行展望。

嗜热毛壳菌甘露聚糖酶Ct Man26的性质及其在甘露寡糖制备中的应用

旨在实现嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)中的甘露聚糖酶Ct Man26在毕赤酵母(Pichia pastoris)中高效表达,探究重组酶Ct Man26的酶学性质及在甘露寡糖(mannooligosaccharides,MOS)制备中的潜力。甘露聚糖酶Ct Man26共含448个氨基酸,由碳水化合物结合模块CBM35、Linker及GH26家族的催化域模块组成,催化结构域上的Asp-395、Leu-396和CBM35辅助模块上的Leu-100受到多个疏水作用力,并可与Linker上氨基酸形成多个氢键。重组酶Ct Man26经P.pastoris表达后,存在N-糖基化修饰,蛋白表观分子质量约为55 kDa。重组酶Ct Man26的最适温度为55℃,最适pH值为5.0,50、60℃处理1 h后酶活力仍保持在90%以上,在pH 4.0~12.0范围表现出良好的稳定性。以魔芋甘露聚糖为底物时,重组酶Ct Man26的比活力为23.15 U/mg,米氏常数为4.75 mg/mL,最大反应速度为27.17μmol/(min·mg)。重组酶Ct Man26制备的MOS主要为甘露糖(14.2 mg/L)、甘露二糖(20.1 mg/L)、甘露三糖(6.1 mg/L)和甘露四糖(2.5 mg/L)。进一步研究发现,制备的MOS表现出较好的抗氧化能力,当样品质量浓度为2.4 mg/mL时,对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除率、2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除率、羟自由基清除率以及超氧阴离子自由基清除率分别为(90.80±0.65)%、(80.7±1.07)%、(69.10±1.10)%和(76.7±3.14)%。同时,MOS具有明显的益生元特性,能够抑制大肠杆菌(Escherichia coli)的生长,促进有益菌戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)和植物乳杆菌(Lactobacillu plantarum)的生长,且随着MOS添加量增加及培养时间的延长越发明显。综上所述,重组甘露聚糖酶Ct Man26具有较好的酶学特性,在MOS的制备中具有潜在的应用价值。

蛋白质工程提升糖酶热稳定性研究进展

糖酶是制糖工业中不可或缺的一种酶制剂。天然糖酶在长时间高温转化制糖时难以保持较好的稳定性,制约了其在工业生产中的应用。大量研究表明蛋白质工程手段是提升糖酶热稳定性的重要手段和策略。本文系统地综述利用蛋白质工程手段提高糖酶热稳定性的最新进展,详尽分析蛋白质工程中的定向进化、理性设计和半理性设计策略。同时评估这些策略在提高糖酶热稳定性方面的效果及其潜在的工业应用价值,并指出各策略的优势、不足和面临的挑战。最后提出应结合多种方法策略提高糖酶热稳定性的建议,并展望未来研究的方向,以期实现糖酶热稳定性和酶活性的协同提高。

裂解性多糖单加氧酶驱动不同结构甲壳素降解的研究

为实现裂解性多糖单加氧酶(Lyticpolysaccharidemonooxygenase,LPMO)高效驱动甲壳素的降解,本文分析了来源于Oceanobacillussp.J11TS1的LPMO(OsLPMO10A)与甲壳素酶协同作用于不同晶型和不同致密性甲壳素的活性差异。研究表明,OsLPMO10A对β-甲壳素的结合活性和裂解作用比对α-甲壳素更强。采用一锅法反应,OsLPMO10A与甲壳素酶协同作用于β-甲壳素的协同度(2.41)和甲壳二糖产量((2.46±0.17)mg/mL)均高于协同作用于α-甲壳素的协同度(1.94)和甲壳二糖产量((0.68±0.04)mg/mL)。此外,虽然OsLPMO10A对致密性降低的α-甲壳素仍具有结合和氧化活性,但OsLPMO10A与甲壳素酶的协同度随着α-甲壳素致密性的降低而趋向于1。上述结果表明,甲壳素结构对LPMO驱动的甲壳素生物转化有重要影响。

定向引入N⁃糖基化位点促进芳基醇氧化酶热稳定性及底物亲和力

芳基醇氧化酶在木质素降解过程中发挥重要作用,N-糖基化修饰影响其酶学性质。该文旨在通过研究刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)来源的芳基醇氧化酶N-糖基化,来提高其热稳定性和底物亲和力。利用毕赤酵母GS115表达系统和定点突变技术,构建表达6种芳基醇氧化酶突变体蛋白,并对纯化后的野生型和突变体酶进行酶学性质和热稳定性分析。结果表明,芳基醇氧化酶N89和N249糖基化位点突变导致最适温度和70℃时酶热稳定性降低;在这个过程中,将其引入新的糖基化位点后的突变体,其最适酸碱度没有变化,最适温度以及70℃下的热稳定程度都明显优于野生型;以藜芦醇为底物时,突变体[AAO(F-X-N-X-T)]与底物亲和力最高。N-糖基化主要影响芳醇氧化酶的热稳定性,其中N89和N249位点的N-糖基化对酶的热稳定性起重要作用;引入N-糖基化位点[AAO(F-X-N-X-T)]能获得具有高活力和高稳定性的芳醇氧化酶。

产纤维素酶工程菌株的构建及其在醇化烟叶中的应用

烟叶中过高的纤维素含量使烟叶组织容易破碎,影响加工过程中烟叶的可塑性,使烟叶杂气变重等。为了获得产纤维素酶的优良菌株,实现醇化烟叶纤维素的有效降解,利用同源重组法成功构建了10株纤维素降解的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)工程菌株。通过刚果红平板筛选、羧甲基纤维素钠酶活、滤纸酶活及滤纸崩解率等检测,共筛选出C36、CM、KF和GH54株产纤维素酶能力较强的重组菌株。将醇化烟叶作为底物进行纤维素降解,发现重组菌株CM的产纤维酶效率最高,其羧甲基纤维素钠酶活和滤纸酶活分别为39.55和23.52 U·mL-1。结果表明,构建的重组菌株能够利用醇化烟叶中的纤维素产生纤维素酶,可为工业生产中醇化烟叶纤维素降解提供理论支撑。

酵母细胞催化合成18α-甘草酸

18α-甘草酸(18α-GL)是一种齐墩果烷型皂苷,比其差向异构体18β-GL极性小、亲脂性好,更强的抗毒抗炎作用和更高的肝脏靶向性使18α-GL成为保肝护肝领域的主要药物成分。但目前18α-GL的制备方法污染大、效率低,亟需开发一种绿色简单地合成18α-GL的方法。利用酵母细胞异源表达糖基转移酶,通过全细胞催化方式鉴定出可催化18α-甘草次酸(18α-GA)特异性合成18α-单葡萄糖醛酸甘草次酸(18α-GAMG)的糖基转移酶cGuCSyGT和催化18α-GAMG特异性合成18α-GL的糖基转移酶GgUGT1。进一步运用蛋白质结构预测和分子动力学模拟探究cGuCSyGT对18α-GA的催化活性比18β-GA低的原因。最后采用优化底物添加浓度、底盘细胞、底物添加时间、反应时间、培养基成分补加和底物溶剂的策略构建了酵母催化合成18α-GAMG和18α-GL的最优工艺,使18α-GAMG和18α-GL的产量分别达到(36.38±1.87)mg/L和(39.32±0.75)mg/L。本研究实现了18α-GAMG和18α-GL的微生物催化合成,可为18α-GL的微生物全合成提供理论基础和技术支撑。

定点饱和突变提高赭曲霉11α羟化酶的催化性能

【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法】在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216和M488基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟。【结果】突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度0.5 g/L时,生产强度为431.66 mg/(L·d),较野生型提高了2.12倍,这可能是因为当118位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性。分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密。【结论】通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导。

单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究进展

低分子量右旋糖酐(Dextran)是以蔗糖为底物,由右旋糖酐蔗糖酶(Dextransucrase, DSR)催化合成葡萄糖聚合物后,再经酸水解/酶水解形成的化合物,其分子量为10 000-20 000 Da,可广泛应用于医药、食品等行业。本文综述了单酶法合成右旋糖酐的研究进展,包括微生物法/酶法生产右旋糖酐的优缺点,DSR的高效表达,单酶法合成右旋糖酐的过程调控,DSR的固定化技术、结构和催化机理,以及单酶法合成低分子量右旋糖酐的研究现状,并在此基础上提出DSR单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐的思路。借助人工智能技术可获得更详细的DSR结构信息,在进一步解析DSR的结构、功能和催化机理的基础上,对其进行合理的设计和改进,优化酶学性质,实现单酶一步法直接合成低分子量右旋糖酐,可为生产低分子量右旋糖酐提供了新的理论支持。

一种新型褐藻胶裂解酶及其截短体对酶学性质的影响

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组中克隆表达出褐藻胶裂解酶,考察酶的催化特性。结果发现:从Paenibacillus lautus A2中鉴定出的一种新颖的褐藻胶内切酶AlgC2m,含有439个氨基酸,与PL7家族的AlgL仅有38%的最高序列一致性,其N端的碳水化合物结合模块(CBM32)和C端催化域(CD)通过一个连接子连接。AlgC2m和其截短体AlgC2m-CD降解褐藻酸钠的酶活分别为331.05和82.47 U/μmol,最适温度分别为45和30℃。另外,AlgC2m-CD对聚α-L-古罗糖醛酸(polyG)具有更明显的偏好性,酶解产物除二糖和三糖外,还有聚合度更高的四糖。

嘌呤核苷磷酸化酶/嘧啶核苷磷酸化酶共表达及固定化催化合成阿糖核苷

将嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)和尿苷磷酸化酶(UP)进行共表达和双酶固定化,提高生物法合成阿糖核苷过程中底物转化率和催化剂稳定性。首先,构建大肠杆菌内源(PNP)和(UP)过表达工程菌,考察工程菌催化不同阿糖核苷之间转化的效率。将PNP和UP双酶固定化,并对固定化双酶进行回收利用,考察重复使用过程中固定化双酶的催化效率。结果表明:工程菌催化阿糖尿苷和腺嘌呤生成阿糖腺苷的反应最高转化率可达93.6%。固定化双酶催化合成阿糖2,6-二氨基嘌呤核苷的最高转化率可达99.8%。重复回收使用固定化双酶19次后对底物的转化率达到60.6%,累计有效催化时长可达684 h。PNP和UP的双酶耦合体系能高效催化阿糖核苷之间的转化,固定化修饰有利于延长酶的使用寿命,为生物法生产核苷类似物提供重要科学参考。

基于生物信息学的角蛋白酶分析

通过生物信息学分析预测拟蕈状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌4种微生物角蛋白酶的结构性质。结果显示,所有酶都具有稳定性和亲水性,其二级结构特征相似,主要由无规则卷曲、β–折叠和α–螺旋构成。信号肽分析揭示了潜在的分泌蛋白特征,其中拟蕈状芽孢杆菌可能分泌信号肽。此外,拟蕈状芽孢杆菌的磷酸化位点最多。这为进一步研究角蛋白酶的降解机制及其推广应用提供了重要基础。

MOFs孔结构对固定化酶性能影响的研究进展

固定化酶是实现酶制剂产业化应用的有效途径,载体是影响固定化酶催化效果的关键因素。金属有机框架(MOFs)是结构高度有序的多孔材料,具有构效关系明确、孔结构均一、孔道性质与化学性质在原子层面可调、可设计和易化学修饰等特点,近年来,其作为酶载体方面的研究已有较大的进展。该文以MOFs孔结构对固定化酶性能的影响为主题,分析了MOFs孔结构的影响因素,总结了酶在笼型空穴与通道型孔这2种典型孔中负载的研究进展,详细论述了MOFs孔结构对酶的固定化、活性等方面的影响。最后,指出多级孔在固定化酶强化传质方面的特殊作用以及开发孔-酶匹配MOFs的重要性,展望了利用MOFs自身催化能力在纳米尺度内构建高效化学-酶级联催化剂的发展优势,以及通过调控微环境强化酶催化过程的可行性。

玉米赤霉烯酮降解酶热稳定性及底物特异性改造策略

玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是污染范围较大的真菌毒素,广泛存在于玉米、大麦、小麦和高粱等谷物及其副产品中,对饲料行业和畜牧养殖业造成严重的经济损失。利用生物技术对ZEN及其衍生物进行降解和脱除是未来解决ZEN污染的重要途径。然而,目前发现的ZEN降解酶热稳定性差,催化效率低,难以满足工业生产中高温、酸、碱等极端条件的需求。本文综述了近年来利用蛋白质工程提升ZEN降解酶热稳定性和底物特异性的改造策略,阐明ZEN降解酶改造的研究进展及存在问题,为开发ZEN降解酶的工程改造提供参考。

糖磷酸酶的挖掘及其酶学性质研究

【目的】在以淀粉或糊精为底物合成具有高附加值的单糖的多酶级联反应中,利用糖磷酸酶催化发生不可逆的脱磷反应可以高效拉动整个反应朝产物生成的方向进行。本研究旨在挖掘新的糖磷酸酶并对酶学性质进行鉴定。【方法】通过基因挖掘的手段筛选得到一种来源于嗜热菌Thermoproteus sp.CIS_19的未知功能的基因TsPase具有糖磷酸酶活性,在E.coli BL21(DE3)中实现异源可溶性表达及纯化,进一步对其酶学性质进行表征。【结果】最终确定糖磷酸酶TsPase的最适反应温度是70℃,T_(m)值为(80.3±1.3)℃,最适反应pH为4,金属离子Mg^(2+)对TsPase有较强的促进作用。针对底物为塔格糖6磷酸盐的动力学常数K_(m)为(2.40±0.98)mmol/L,催化常数k_(cat)为(102.50±8.60)min^(-1)。将TsPase应用于体外多酶合成体系中,以10 g/L麦芽糊精为底物,一锅法生产D-塔格糖,反应平衡体系中D-塔格糖产量为(4.26±0.03)g/L,转化率可达42.6%±0.3%。【结论】TsPase不仅具有较好的热稳定性和活性,在体外多酶合成体系中也具有优势,这些特征在以后的理论研究及工业生产中具有一定的科学价值。

表面偶极离子亲水磁珠固定化异柠檬酸裂解酶及其表征

比较两种亲水磁珠固定化结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL)并优化,为天然产物中Mt ICL先导抑制剂的亲和富集筛选提供适用的固定化酶。构建6×His-pET28a-ICL,经E.coli BL21(DE3)重组表达、Ni^(2+)-NTA柱纯化和酶学性质表征获得Mt ICL(重组蛋白质)。用羧基功能化和Ni^(2+)-NTA功能化制备两种表面偶极离子亲水磁珠固定化Mt ICL,比较其固载量、酶活力、稳定性及对已知抑制剂的响应。羧基磁珠固定化酶表观保留比活显著高于Ni^(2+)-NTA固定化酶。当羧基磁珠与重组蛋白质加样质量比为60∶1时,固定化酶表观保留比活可达游离酶的85%,此时羧基磁珠对Mt ICL表观固载量为(7.2±0.2)mg/g(以磁珠质量计,n=3)。羧基磁珠固定化Mt ICL对衣康酸的亲和力与游离酶无显著差异(P>0.05),且稳定性更强。此羧基磁珠固定化Mt ICL可望作为磁分离、亲和富集筛选天然产物中Mt ICL抑制剂类抗结核先导化合物。

CRISPR技术在食品安全检测中的应用、挑战及展望

食品安全问题一直备受人们关注,而检测技术则是保障食品安全的关键手段之一。近年来,CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技术作为一项革命性的基因编辑技术已经广泛用于育种和医疗等领域,同时在食品检测领域也展现出巨大潜力。CRISPR在crRNA(CRISPR-related RNA)的引导下,会对靶标DNA进行识别,并对附近的单链DNA(ssDNA)展开非特异性切割,通过切割产生的信号变化实现对靶标的定量检测;CRISPR的强识别特异性和高效的切割特性以及可编程性使其在核酸和非核酸靶标的检测中崭露头角。同时,CRISPR的检测方法与其他技术(如电化学传感器、表面增强拉曼光谱(SERS)等)相结合也逐渐成为领域研究热点。因此,本文综述了CRISPR的基本检测原理,CRISPR技术在食品真实性溯源、食源性致病菌筛查以及食品污染物检测中的应用现状及面临的挑战,并对其未来前景进行了展望。