裂解性多糖单加氧酶驱动不同结构甲壳素降解的研究

为实现裂解性多糖单加氧酶(Lyticpolysaccharidemonooxygenase,LPMO)高效驱动甲壳素的降解,本文分析了来源于Oceanobacillussp.J11TS1的LPMO(OsLPMO10A)与甲壳素酶协同作用于不同晶型和不同致密性甲壳素的活性差异。研究表明,OsLPMO10A对β-甲壳素的结合活性和裂解作用比对α-甲壳素更强。采用一锅法反应,OsLPMO10A与甲壳素酶协同作用于β-甲壳素的协同度(2.41)和甲壳二糖产量((2.46±0.17)mg/mL)均高于协同作用于α-甲壳素的协同度(1.94)和甲壳二糖产量((0.68±0.04)mg/mL)。此外,虽然OsLPMO10A对致密性降低的α-甲壳素仍具有结合和氧化活性,但OsLPMO10A与甲壳素酶的协同度随着α-甲壳素致密性的降低而趋向于1。上述结果表明,甲壳素结构对LPMO驱动的甲壳素生物转化有重要影响。

拟南芥At ACO3基因的表达对抵御非生物胁迫影响的研究进展

乌头酸酶(Aconitase,ACO)是参与三羧酸循环中柠檬酸可逆异构化过程的关键酶,这种酶有3种亚型(ACO1,ACO2,ACO3),其中ACO3发挥主要的作用。有研究发现,乌头酸酶基因At ACO3还对提高模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)应对非生物胁迫具有重要的生物学功能。本文着重论述了At ACO3在提高植物的抗寒性、抗旱性、抗金属胁迫、抗氧化胁迫等方面的作用,为深入研究植物ACO3基因和进一步开发植物抗逆功能基因提供参考价值。

核桃仁原位水解工艺优化及氧化稳定性研究

为延长核桃仁货架期,提高核桃仁储藏品质。以去皮核桃仁为原料,利用复配蛋白酶(胰酶)酶解核桃仁实现原位富集抗氧化肽,采用单因素实验分别研究了底物质量分数、酶质量分数、水解温度、水解时间对水解液抗氧化活性的影响。在此基础上,采用正交实验确定最优水解工艺为:酶质量分数12%、底物质量分数40%、水解温度45℃、水解时间20 min。萃取酶解处理的核桃仁(样品组)和未处理的核桃仁(空白对照组)油脂测定其氧化诱导时间,将样品组和空白对照组用铝袋分装在60℃烘箱内加速氧化。结果表明,样品组具有更长的氧化诱导时间及Q10指数,其氧化自由能从59.896 kJ/mol上升到78.103 kJ/mol;加速氧化过程对照组过氧化值始终高于样品组,以过氧化值为指标结合油脂氧化规律得到在20℃下样品组货架期相对于对照组延长了68 d。

辛酸结构大豆磷脂酶法改性工艺优化

为了改善天然磷脂的理化性质以及拓宽其应用范围,以辛酸和大豆磷脂为底物,采用酶法对大豆磷脂进行改性。筛选了改性大豆磷脂的脂肪酶,考察了反应温度、反应时间、脂肪酶用量、底物质量比对辛酸结构大豆磷脂改性工艺的影响,在此基础上,采用正交试验优化大豆磷脂的酶法改性工艺条件,并考察了脂肪酶的重复利用性。结果表明:Novozym 435脂肪酶的催化效果优于Lipozyme RM IM和Lipozyme TL IM;大豆磷脂酶法改性的最优条件为反应温度55℃、Novozym 435用量25%、底物质量比(辛酸与大豆磷脂质量比)7∶1、反应时间36 h,在此条件下辛酸结合率可达(78.79±0.81)%;Novozym 435经过4次重复利用后,辛酸结合率仍能达到(63.67±1.50)%。综上,Novozym 435可作为催化磷脂改性的优选脂肪酶。

酶促中药-壳聚糖复合水果保鲜膜研制

辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)有催化聚合活性强、效率高等优良特性。HRP催化的中药-壳聚糖复配膜应用于水果保鲜可减弱呼吸作用,有低失重率、高VC和可滴定酸保持率,且HRP浓度在750 U/mL时对沙糖桔保鲜效果最佳,该复配膜的施用还能影响沙糖桔可溶性蛋白和可溶性糖的含量、抗氧化性以及糖代谢不同途径。电镜表征结果提示HRP酶促聚合增强中药-壳聚糖复配物的均一性、减少了杂质。这种酶促中药-壳聚糖复配物对比普通保鲜材料具有更佳保鲜效果。

用于降解邻苯二甲酸酯的红球菌来源酰胺酶RhoⅡ突变改造

邻苯二甲酸酯(phthalate esters,PAEs)具有生理毒性,去除毒性的关键在于侧链酯键的完全水解。红球菌源酰胺酶RhoⅡ是作用于邻苯二甲酸单酯酯键的水解酶,但不能水解PAEs。采用计算机模拟和定点突变的方法,对RhoⅡ进行改造,以实现水解PAEs的目的。将RhoⅡ与邻苯二甲酸单丁酯(monobutyl phthalate,MBP)进行分子对接,结果显示,RhoⅡ以Lys200、Arg185的R基稳定MBP的羧基,MBP与RhoⅡ的两个单体均形成氢键相互作用。位点突变表明,Asp39、Lys127和Cys160构成了RhoⅡ的催化三联体,作为活性中心存在于酶的疏水凹槽内。此外,通过定点突变获得了具有水解PAEs的突变酶F44N,与原酶相比,其水解邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate,DBP)、邻苯二甲酸二异丁酯(diisobutyl phthalate,DIBP)的能力显著提升,这是由于苯丙氨酸突变为天门冬酰胺后,明显削弱了酶对底物的空间位阻作用,使酶的底物结合空腔体积增大,DBP、DIBP能够与酶进行结合,实现酯键水解。结合突变前后对接结果推测,突变影响酶的底物结合空腔,导致突变酶不能有效催化邻苯二甲酸单酯。通过验证RhoⅡ的催化活性中心,突变关键位点,实现了RhoⅡ底物谱的改变,希望可以丰富催化水解PAEs的酶资源,促进相关水解酶更好的应用。

合成染料与染料脱色过氧化物酶Il-DyP4相互作用的光谱分析

利用紫外-可见吸收光谱法和荧光光谱法,分析蒽醌类染料(reactive blue 19(RB19),reactive blue 4(RB4))、偶氮类染料(reactive violet 5(RV5),reactive black 5(RB5))及底物2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与染料脱色过氧化物酶Il-DyP4之间的相互作用.紫外-可见吸收光谱法结果表明,Il-DyP4和上述底物之间均形成了复合物;荧光光谱法结果表明,上述底物均使Il-DyP4产生了荧光淬灭效应,且淬灭类型为静态淬灭,符合紫外-可见吸收光谱的结果.根据双对数方程■,计算出RB19,RB4,RV5,RB5,ABTS与Il-DyP4相互作用的表观结合常数(Ka)分别为:9.386 2×10^(4)L·mol^(-1)(298 K),5.615 7×10^(6) L·mol^(-1)(298 K),1.926 2×10^(6) L·mol^(-1)(288 K),5.277 8×10^(5) L·mol^(-1)(298 K),2.234 6×10^(5) L·mol^(-1)(298 K).热力学参数分析结果表明,上述底物与Il-DyP4的结合依赖于疏水相互作用,是自发的吸热过程.

基于计算设计的GH11家族木聚糖酶CDBFV的热稳定性改造及潜在机制研究

【目的】瘤胃真菌Neocallimastix patriciarum GH11家族木聚糖酶CDBFV在饲料、食品等领域具有良好应用前景,提高其热稳定性对其生产应用十分重要。【方法】使用分子动力学模拟、机器学习等策略设计潜在CDBFV热稳定性突变体,在大肠杆菌和毕赤酵母中进行异源表达纯化,测定最适反应条件、比酶活和85℃孵育3 min后相对剩余活力,通过结构分析明确热稳定性提高机制。【结果】位于CDBFV N端基序~(36)GNNS~(39)具有较高柔性,对其改造设计的单突变体N37P和N38V在85℃孵育3 min后,相对活力分别降低至70.3%和55.1%,较野生型(48.7%)提升了21.6%和6.5%;进而,在相对活力提升显著的N37P基础上叠加已报道优势突变体N88G,构建双突变体N37P/N88G,其相对活力达到了73.4%,较野生型提高了24.7%;此外,将N37P/N88G在毕赤酵母中进行了分泌表达,在85℃处理3 min后,相对活力达到了88.8%;结构分析表明,N37P突变的引入使得CDBFV形成了新的氢键相互作用,降低活性位点附近柔性,并干预了糖基化形成,进而提高了热稳定性。【结论】成功得到了高耐热双突变体N37P/N88G,为提高GH11家族木聚糖酶的热稳定性改造提供了新的思路和方法,有望推动CDBFV在饲料工业等高温环境下的广泛应用。

异源合成的δ变形细菌壳聚糖酶酶学性质研究

为获得高反应温度的壳聚糖酶,本文挖掘了来源于δ变形细菌的壳聚糖酶基因(GenBank:MBN2801850.1)并将其在大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中成功异源表达得到新的壳聚糖酶Csn(Db)-1-WSY(Csn1)。Csn1是属于GH8家族的壳聚糖酶,蛋白分子量大小约为52 kDa,比酶活为135.81 U/mg,是典型的内切型壳聚糖酶,其在60℃、pH=10.0的Gly-NaOH缓冲液中表现出最高活性。Csn1的米氏常数Km为1.30 mmol/L,显示其与底物较好的亲和性。在5 mmol/L Cu^(2+)溶液中Csn1的活性增强至初始的131.36%;而Fe^(2+)、Co^(2+)、Mn^(2+)等金属离子均对Csn1表现出活性抑制作用。Csn1水解壳聚糖的主要产物为(GlcN)2至(GlcN)4。研究结果表明,Csn1可为工业制备壳寡糖提供有效的生产工具酶。

重组枯草芽孢杆菌全细胞催化生成L-酪氨酸

目的:本研究构建一株重组枯草芽孢杆菌工程菌,实现以苯酚、丙酮酸和氨为底物全细胞生成L-酪氨酸(L-tyrosine,L-Tyr),并优化其细胞培养条件和催化反应条件,以期提高L-Tyr的产量。方法:将来源于Pantoea agglomerans的酪氨酸酚裂解酶(Tyrosine Phenol-Lyase,TPL)经密码子优化后在枯草芽孢杆菌中异源表达,通过单因素实验优化了重组菌诱导表达条件和全细胞转化条件,旨在提高L-Tyr产量。结果:重组枯草芽孢杆菌在20℃,2.0 g/L木糖诱导培养36 h时TPL活性最高达到4.65±0.15 U·g^(−1),在75 mmol/L苯酚、75 mmol/L丙酮酸钠、487 mmol/L氯化铵、2.0 g/L亚硫酸钠、2.0 g/L EDTA、0.08 g/L磷酸吡哆醛(Pyridoxal Phosphat,PLP)、湿菌体50 g/L、pH=8.0、35℃的全细胞转化条件下,L-Tyr达到9.38 g/L,转化率为73.24%。为了进一步改善高浓度苯酚导致TPL酶活力下降问题,在全细胞转化环节采用分批补料方式,20 h后得到15.12 g/L L-Tyr,转化率为75.51%。结论:研究结果表明重组枯草芽孢杆菌可以成功转化苯酚、丙酮酸钠合成L-酪氨酸,为全细胞生物制备食品级L-酪氨酸提供了理论和技术基础,具有良好的应用前景。

黑水虻酶解液美拉德反应及其风味化合物分析

为了开发新的宠物诱食剂,以黑水虻幼虫为原料,对酶解黑水虻幼虫后的酶解液在不同温度下进行美拉德反应,通过测定类黑精含量和小分子中间产物含量来考察反应温度对美拉德反应的影响,使用气相色谱质谱(GC MS)结合主成分分析法对美拉德反应产物的风味化合物进行分析,探讨不同温度下美拉德反应产物的差异及特征成分。结果表明:在设定的90~130℃条件下,温度越高,美拉德反应的褐变程度越高;当温度为110℃时,美拉德反应产物中风味化合物的总含量最高,为2.373μg/g。通过主成分分析可知,在110℃时美拉德反应产生主要特征化合物最多,分别为甲酸乙酯、乙酸、庚醛、仲辛酮、苯甲醇、丁酸、2庚酮、正辛醇、苯酚、己醇、己醛和壬酸。可见,在美拉德反应温度为110℃时,得到的产物具有最佳风味。

生物酶在制浆造纸中的低碳应用

过去传统造纸工业是耗能和环境污染大户,而生物酶在造纸工业方面的深入研究与逐步应用,不但能解决原料短缺、污染严重和能源紧张问题,而且会带来良好的经济效益,对造纸工业的发展和环境保护都具有重要的现实意义,实现造纸工业的清洁生产。因此,生物酶在制浆造纸工业上的应用技术一定会有广阔的发展前景。

尿素包合法富集裂壶藻油中多不饱和脂肪酸的工艺

将冬化裂壶藻油转化为乙酯型藻油,以此为原料研究了尿包合法富集多不饱和脂肪酸的工艺.通过单因素试验比较不同的后处理方式、冷却结晶温度、时间、乙醇浓度、脲酯比,以及醇脲比对尿素包合的影响,并通过正交试验获得较优的工艺条件.结果表明,采用优选的后处理方式可提高参与包合作用的尿素比例,从而使非尿素包合组分中含有更高的多不饱和脂肪酸,在较优的工艺条件下,乙酯型藻油的二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸含量可由47.17%、13.93%分别提高到73.20%、19.87%.

特异性丁酰胆碱酯酶探针的研究进展

哺乳动物体内的丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase,BChE)能够将学习记忆相关的神经递质乙酰胆碱降解为胆碱和乙酸,以维持胆碱能系统的稳态。由肝脏产生的BChE经血液循环分布于全身多种组织中,具有多种药理相关活性,并且能够作为反映肝脏健康或疾病状况的生物标志物。因此,检测BChE的活性以及了解其在体内的分布和表达情况是开展相关研究基础,本综述简要概述了最近报道的用于定量检测和实时监测BChE的特异性荧光或化学发光探针。

类可可脂的酶法制备工艺优化及性质分析

为制备性质与天然可可脂接近的类可可脂,以LipozymeRMIM为催化剂,棕榈油中熔点分提产物和硬脂酸为原料,在无溶剂条件下进行酶法酯交换反应,并通过分子蒸馏和溶剂结晶纯化制备类可可脂。对酶法酯交换制备工艺及分子蒸馏和溶剂结晶纯化工艺进行单因素试验优化。同时以天然可可脂为对照,对制备的类可可脂进行理化性质及结晶性能分析。结果表明:酶法酯交换工艺的最优条件为底物质量比1∶1、酶添加量8%(以底物总质量计)、反应温度70℃、反应时间2h;分子蒸馏纯化工艺的最优条件为蒸馏温度210℃、进料速度2mL/min、刮板速度150r/min;以正己烷为溶剂结晶纯化工艺的最优条件为结晶温度15℃、结晶时间18h。在最优条件下制备的类可可脂各项指标与天然可可脂基本一致,且二者经调温后均表现出稳定的β结晶趋势。综上,该工艺适用于性质接近天然可可脂的类可可脂的工业化生产。

磁性壳聚糖固定化皱褶假丝酵母脂肪酶催化酸化油生产脂肪酸

为了探索和建立生物催化在油脂副产品利用中的应用策略,将皱褶假丝酵母脂肪酶(CRL)固定在磁性壳聚糖(Fe_(3)O_(4)@CS)载体上制备磁性固定化脂肪酶(Fe_(3)O_(4)@CS-CRL)。采用X射线衍射仪(XRD)、扫描电子显微镜(SEM)和振动样品磁强计(VSM)对Fe_(3)O_(4)@CS-CRL进行了表征,测定了Fe_(3)O_(4)@CS-CRL的脂肪酶负载量、比活性及酶学稳定性,并将其用于催化水解大豆酸化油生产脂肪酸,通过单因素实验研究了催化反应条件对水解率的影响,考察了催化剂的重复使用性。结果表明:制备的Fe_(3)O_(4)@CS-CRL保留了Fe_(3)O_(4)的磁性晶型,呈球形颗粒状,饱和磁化强度为61.1emu/g,脂肪酶负载量为5.53mg/g,比活性为7.70U/g;相比游离CRL,Fe_(3)O_(4)@CS-CRL具有较好的热稳定性、pH稳定性、有机溶剂稳定性及储存稳定性;Fe_(3)O_(4)@CS-CRL催化水解大豆酸化油生产脂肪酸最佳反应条件为反应温度40℃、水油比2∶1(PBS与大豆酸化油体积比)、催化剂用量15%(以大豆酸化油质量计)、反应时间36h,在该条件下大豆酸化油的水解率达到84.93%;Fe_(3)O_(4)@CS-CRL经过5次重复使用后保持了61.4%的初始水解活性。综上,Fe_(3)O_(4)@CS-CRL在酸化油中进行催化反应拓宽了固定化CRL的应用范围,该催化反应体系是一种油脂精炼行业副产品的可持续高效利用方式,在代替传统高能耗工业反应中具有良好的前景。

烯还原酶不对称还原(R)-香芹酮的研究

(2R,5R)-二氢香芹酮是一种重要的手性中间体,可用于合成多种活性化合物,常采用不对称还原(R)-香芹酮的方法合成。相较于化学方法,烯还原酶催化还原(R)-香芹酮不需要危险的氢气、贵金属催化剂和高温等苛刻的条件,且来源于Corynebacterium casei的烯还原酶(CcER)能有效地还原(R)-香芹酮产生(2R,5R)-二氢香芹酮。考察了pH、反应温度、辅酶NAD~+浓度和辅底物葡萄糖浓度对反应的影响,研究表明最佳反应条件为pH 8、反应温度30℃、NAD^(+)浓度0.6 mmol/L、葡萄糖浓度30 mmol/L;反应6 h后,(R)-香芹酮的转化率可达96%,产物(2R,5R)-二氢香芹酮的光学纯度可达95%;烯还原酶催化能力强,具有生产(2R,5R)-二氢香芹酮的潜力。

酶解法提取虎杖中白藜芦醇、白藜芦醇苷、大黄素

用纤维素酶对虎杖进行了酶解,提高了虎杖中白藜芦醇的提取率,同时提取出白藜芦醇苷和大黄素。通过单因素实验考察了酶解温度、pH、酶解时间、酶用量对目标物提取率的影响,得出较佳的酶解工艺条件为:酶用量2mg/g虎杖,pH=3.0,在40℃酶解1h。酶解后用m(虎杖):m[φ(乙醇)=60%]=1:20,50℃提取2h。w(白藜芦醇)=1.50%,w(白藜芦醇苷)=0.38%,w(大黄素)=0.78%。酶解法较直接提取法更有利于虎杖中有效成分白藜芦醇、大黄素的提取。

酶解鹰嘴豆蛋白制备抗氧化肽工艺优化研究

为优化Alcalase蛋白酶酶解鹰嘴豆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件,采用响应面分析法,以还原能力、超氧阴离子捕获率为响应值,研究了酶与底物的比值([E]/[S])、酶解温度和酶解时间对制备抗氧化肽工艺的影响。综合考虑成本和工艺要求等问题,最终确定酶解鹰嘴豆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件为:底物浓度2%,pH值8.0,[E]/[S]2.72%,温度52℃,时间31 min。该条件下制备的鹰嘴豆酶解产物还原能力和超氧阴离子捕获率分别为0.667和61.55%,与理论预测值的相对误差在±1%以内,说明利用该文建立的模型在实践中进行预测是可行的。

酶与微波处理对海带多糖提取及抗氧化活性的影响

采用纤维素酶解和微波辅助方法从海带中提取多糖组分,以羟自由基和DPPH自由基清除率为衡量抗氧化活性的指标,考察不同提取方法对海带多糖抗氧化活性的影响。单因素试验考察酶用量、酶解时间、微波萃取温度和时间对多糖提取率的影响。酶解方法的最佳提取条件为:酶用量1.5%、温度40℃、pH5、时间2.5h,多糖提取率为3.46%。抗氧化活性实验表明,海带多糖对DPPH自由基和羟自由基有较好地清除效果,其清除能力与多糖质量浓度有明显的量效关系;酶解和微波处理得到的海带多糖样品比常规水浴浸提的样品抗氧化活性有所提高;随着酶用量的增加和微波萃取时间的延长,抗氧化活性呈现下降趋势。