穿心莲糖苷水解酶基因ApGH的克隆、生物信息学分析及表达研究

目的:对穿心莲糖苷水解酶(ApGH)基因进行克隆、生物信息学分析、原核表达和相对表达量分析。方法:取穿心莲新鲜叶片,提取RNA并反转录为互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为模板,以穿心莲转录组中筛选到的糖苷水解酶ApGH基因开放阅读框(ORF)设计特异性引物,进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,经测序后获得的基因序列利用生物信息学软件预测基因编码蛋白特征,构建原核表达载体在大肠埃希菌中诱导表达目的蛋白质,并利用实时荧光定量PCR分析ApGH基因的表达模式。结果:克隆所得ApGH基因的ORF全长1734 bp,编码577个氨基酸(GenBank登录号:OR887606)。ApGH为稳定亲水蛋白质,无信号肽和跨膜结构域,属于糖苷水解酶家族;系统进化分析表明,ApGH归属于GH1家族。将ApGH基因构建到原核表达载体HIS-MBP-pET28a上,在大肠埃希菌Transetta(DE3)中成功表达出重组蛋白质。实时荧光定量PCR检测结果表明,ApGH基因在叶中表达量最高,茎和根中表达量较低。结论:克隆得到穿心莲ApGH基因并对其蛋白质序列特征进行了系统分析,证明其在大肠埃希菌中成功表达重组蛋白质,且主要在穿心莲叶中表达。研究结果为进一步探索穿心莲糖苷水解酶的催化功能提供了依据。

基于转录组的瑶药半枫荷根和叶的差异分析

【目的】瑶药半枫荷(Semiliquidambar cathayensis)的根和叶均具有祛风通络等功效,但其黄酮类等活性成分存在差异。对半枫荷进行转录组测序,以期获得其根和叶的转录组信息和差异表达基因,对探究半枫荷根和叶的差异表达基因在活性成分合成通路中的表达规律具有重要意义。【方法】利用Illumina对半枫荷根和叶进行转录组测序,并进行生物信息分析以挖掘两者萜类和黄酮类等关键次生代谢产物合成通路的基因表达差异。【结果】59378个差异表达基因归类到GO分类的3个大类中,主要与生物学过程有关(50.59%)。185个差异表达基因注释KOG数据库的24个分类中。81个差异表达基因参与苯丙烷类化合物的生物合成,30个差异表达基因参与黄酮类化合物的生物合成,86个差异表达基因参与萜类化合物的生物合成。【结论】参与黄酮类化合物合成途径的关键酶CHS等均为上调表达,导致根的黄酮类成分多于叶,而CMS、HMGS等关键酶都可能影响半枫荷不同组织中萜类化合物的积累模式。文章获得了半枫荷根和叶的转录组信息特征,为今后半枫荷基因功能鉴定、次生代谢途径解析及调控机制研究提供依据。

基于ITS2序列及二级结构的维吾尔族药材孜然及其混伪品鉴别

目的:应用DNA条形码技术,建立维吾尔族药材孜然及其混伪品小茴香、芫荽子的分子鉴别方法。方法:提取38批孜然及其混伪品的基因组总DNA,聚合酶链式反应(PCR)扩增内转录间隔区2 (ITS2)序列并双向测序,测序结果经CodonCode Aligner软件进行序列拼接,利用MEGA软件分析序列特征,计算种内、属间遗传距离,构建邻接(neighbor-joining,NJ)系统聚类树,预测其ITS2二级结构。结果:孜然药材ITS2序列中主体单倍型为A1,序列长度均为226 bp,鸟嘌呤(G)+胞嘧啶(C)占比为47.79%~48.23%;小茴香ITS2序列中,主体单倍型为B1,序列长度均为224~227 bp,G+C占比为53.30%~55.36%;芫荽子ITS2序列中,主体单倍型为C1,序列长度均为220~227 bp,G+C占比为56.82%~56.83%。孜然的种内遗传距离明显小于属间遗传距离。二级结构表明,孜然及其混伪品螺旋区的茎环大小、数目、位置及螺旋角度均有明显差异。结论:ITS2序列作为DNA条形码能稳定、准确地鉴别孜然及其混伪品药材,为保障孜然临床安全用药提供了有效技术手段。

醋龟甲配方颗粒的位点特异性PCR鉴别

目的:建立一种醋龟甲配方颗粒特异性位点聚合酶链式反应(PCR)鉴别方法。方法:根据乌龟Chinemys reevesii(Gray)及其混伪品的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列上的单核苷酸多态性位点设计醋龟甲的特异性鉴别引物,经过优化反应体系,确定最佳的PCR反应条件,并对该方法进行耐受性和适用性考察。结果:当退火温度为62℃、循环数为34时,醋龟甲饮片、标准汤剂冻干粉和配方颗粒均可在约92 bp处得到清晰单一的特异性条带,其混伪品及阴性对照均无条带。结论:建立的位点特异性PCR鉴别方法可快速、准确地鉴别醋龟甲饮片、标准汤剂冻干粉和配方颗粒的真伪,为醋龟甲配方颗粒质量标准研究提供了参考。

半夏多倍体复合体基因组DNA甲基化状态的MSAP分析

目的分析半夏多倍体复合体DNA甲基化状态的变化(甲基化水平和甲基化差异模式)。方法应用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,采用34对引物进行选择性扩增。结果扩增共得到7708条带,其中5636条带为甲基化多态性带在半夏7倍、8倍、9倍、10倍体值株间DNA甲基化水平变化不大。总扩增位点甲基化水平在54%～58%,全甲基化率为24.1%～24.3%,高倍性植株甲基化程序相应比较高。除甲基化水平稍有变化外,半夏不同倍性株间的DNA甲基化模式也形式各异,检测到的带型分为两大类(和型)。其中,不同倍性间DNA甲基化状态保持不变的位点占52.5%,归为型;少部分检测位点(占47.5%,归为型)的DNA甲基化模式在不同倍性间存在显著差异。结论半夏多倍体复合体各倍性植株间存在大量的胞嘧啶甲基化变异且整体甲基化水平较高。

电子舌技术鉴别黄连及其炮制品

目的采用电子舌技术鉴别生黄连、酒黄连、姜黄连及萸黄连。方法从四川、重庆、湖北和云南收集10批黄连,炮制并提取后得到40批水提液,然后采用软独立建模分析(SIMCA)、主成分分析(PCA)、判别因子分析(DFA)、线性判别分析(LDA)及反向传播人工神经网络模型(BP-ANN)对该技术进行评价。结果黄连饮片电子舌的响应味觉特征存在显著差异,其中SIMCA模型能区分黄连炮制品与生品;PCA模型显示黄连及其不同炮制品有明显区别;DFA模型对黄连及其不同炮制品区分识别的正确率达100%;LDA模型的初始判别率以及交叉验证识别率也均为100%;BP-ANN模型对测试集未知样品的判别率为91.7%;所有样本的综合判别率为99.4%。结论电子舌技术能实现黄连及其炮制品的味觉特征客观化,从而对它们进行鉴别区分。

人RANTES基因在转基因青蒿植株中表达的测定

目的 为了增强青蒿的特异药理活性,探讨人β-趋化因子RANTES基因在青蒿细胞中表达的可能性。方法 将克隆的RANTES基因经Ti质粒衍生的双元表达载体pROKII导入根癌农杆菌LBA4404菌株,通过叶盘共培养法已获得一批表现卡那霉素抗性的转基因青蒿植株。结果 PCR和Southern印迹杂交分析表明,RANTES基因已导入并整合到青蒿基因组中;RT-PCR、Northern印迹、Western印迹杂交结果证实,RANTES基因已在转基因青蒿植株中成功表达。结论 首次报道了RANTES基因在转基因青蒿植株中的表达,为基因工程改造青蒿打下了良好的基础。

基于ITS2序列的建泽泻及其混伪品鉴定研究

目的利用ITS2条形码鉴别建泽泻及其混伪品。方法提取28份建泽泻及其混伪品基因组DNA,PCR扩增ITS2序列并进行双向测序,测序结果提交至GenBank,同时从GenBank下载泽泻科植物及其混伪品10种17条ITS2序列,对提交与下载的45条序列,应用MEGA 5.1软件进行序列比对,计算种内和种间距离,采用相似性搜索法、最近距离法进行鉴定分析,并构建NJ系统进化树直观反映鉴定结果。结果建泽泻、川泽泻ITS2序列长度均为311bp,存在1个变异位点;建泽泻与泽泻科泽泻属物种距离较近,与泽泻科其他属及其混伪品之间遗传距离较远;NJ树结果显示建泽泻及其混伪品均可明显区分,表现出良好的单系性。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以准确快捷地鉴别建泽泻及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了新的技术手段。

ITS2序列分析在白花蛇舌草鉴定中的应用研究

目的对白花蛇舌草和它的混伪品进行分子生物鉴定,保证该药材的临床药效和使用安全。方法提取白花蛇舌草及其混伪品的DNA,使用引物进行PCR扩增,获取ITS2序列的片段,将扩增得到的产物进行双向测序,运用Condon Code Aligner软件进行校对拼接,去除低质量区。用HMMer注释法保留ITS2序列全长。运用MEGA5.1软件对真伪品序列进行分析,计算真伪品的遗传距离,构建邻接(NJ)树评估真伪品之间的亲缘关系。采用ITS2数据库预测ITS2二级结构。结果白花蛇舌草与混伪品的ITS2序列存在明显差异。结论运用ITS2序列能准确有效鉴别出白花蛇舌草和混淆品。

植物中药功能基因研究

中药功能基因研究主要是探寻中药活性成分相关功能基因及表达规律,确定药用成分合成的调控机制,获得中药药用成分关键代谢途径和其中的关键调控因子,为中药现代化奠定基础。从模式植物(水稻、拟南芥等)、主要技术策略(基因表达差异、基因表达序列标签、基因芯片技术和基因表达序列分析)和生物信息学方法(比较基因组学等)等3方面对国内外植物功能基因研究作了介绍。还介绍了黄酮类化合物与紫杉醇生物合成基因及植物P450基因研究现状。并对本研究室石斛碱相关功能基因研究情况作了介绍。

栀子栽培品种与近缘种的ITS2序列分析

【目的】栀子属植物是重要的观赏、药用、色素和油用资源植物,有着悠久的栽培历史。由于生长环境的不同,以及长期的人工栽培和选育,使其习性、叶的形状、花的形态、果实的形状及大小等发生诸多变异,使得栀子栽培群体的变异类型丰富,并形成了一些较为稳定的品种类型。开展栀子栽培品种和近缘种核糖体DNA内部转录间隔区2(nrDNA ITS2)序列变异程度、遗传距离和亲缘关系研究,为栀子属植物品种鉴定、遗传育种及多样性保护提供科学依据。【方法】以保存于江西省林业科学院中药资源圃内的栀子18个栽培品种和3个近缘种共38个样品为试验材料,进行聚合酶链式反应(PCR)直接测序法,对样品进行ITS2片段扩增和双向测序,所得序列用Codon Code Aligner v6.0.1软件拼接后,采用Lasergene Edit Seq 11.1软件进行平均碱基组成百分比统计,用MEGA7.0软件进行分析比对,获得序列长度、GC含量以及变异位点,基于K2P模型分析遗传距离,用UPGMA法构建系统聚类树。【结果】序列变异程度分析显示,狭叶栀子和栀子的ITS2序列长度均为347 bp,GC含量为66.86%,大黄栀子序列长度为355 bp,GC含量为67.61%,栀子栽培品种序列长度除‘燃叶’、‘金福水栀’为348 bp外,其他品种序列长度和栀子一致,均为347 bp,栀子栽培品种与近缘种间的平均GC含量相差不明显,GC含量为66.28%~67.15%,其中‘白蟾’GC含量最低,‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’GC含量最高。所有样本ITS2序列比对共产生12个变异位点,10个碱基插入,其中8个碱基插入是大黄栀子所独有的,且存在5个特异的变异位点,一部分表型特征有共性的品种之间有共同的变异位点,如植株矮小、叶片小而窄长的品种‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’在50 bp处,果实相对较大的品种‘分关1号’、‘金福水栀’和‘金元’在84 bp处等。一些品种具有特异的变异位点,如‘白蟾’(133 bp处)、‘小白蟾’(229 bp处)等。序列遗传距离分析显示,栀子属种间遗传距离普遍小于近缘种和品种间的遗传距离,大于栀子栽培品种之间的遗传距离,所有样本平均遗传距离为0.0055,大黄栀子和‘白蟾’间遗传距离最大,为0.0206。聚类分析结果显示,栀子属乔木树种大黄栀子单独成一支,与栀子属其它种和栀子栽培品种亲缘关系最远,狭叶栀子和野生栀子所有个体总体表现出较近的亲缘关系。【结论】分析结果表明,3种栀子属植物在ITS2序列长度和GC含量上表现出较高的保守性,研究发现的部分品种共同变异位点以及部分品种特异变异位点将对栀子品种鉴定有较大的应用价值。部分聚类结果和以表型数据为基础的数量分类结果类似,但并没有像数量分类结果那样以花重瓣、大果、小果等性状形成明显的系统分枝,研究结果对栀子品种起源、资源保护和种质创新等方面有重要的指导价值。

植物Ⅲ型聚酮合酶的研究进展

综述了近10年来从植物中克隆、鉴定的型聚酮合酶(PKS)的研究进展。型PKS即查耳酮合酶超家族,能催化生成一系列结构各异、具有不同生理活性、具有查耳酮合酶(CHS)基本骨架的植物次生代谢产物,对这些PKS的基因进行调控可用于合成一些难以化学合成的新型天然化合物。目前,国内对Ⅲ型PKS在药学领域的应用研究甚少,此研究对于活性成分的生物合成具有重要意义。

RNA干扰及其在药用植物代谢工程中的应用

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是把双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)导入某些生物和细胞而引起同源mRNA降解的现象,是一种转录后基因沉默机制。dsRNA在体内被Dicer二聚体切割成21～25bp的小干涉RNA(smallinterfering RNA,siRNA),然后在siRNA引导下,由RNA诱导沉默复合体(RN Ainduced silencing complex,RISC)降解靶mRNA。RNA干扰作为一种新型反义技术可以有效的抑制特异基因的表达,因此可用于对药用植物次生代谢产物的生物合成途径进行调控,达到调控天然产物生物合成的目的。现将RNAi机制研究的最新进展及RNAi在药用植物代谢工程方面的应用进行综述。

广藿香α-淀粉酶PcAMY1基因克隆和序列分析

为了解广藿香对淀粉的利用,克隆了广藿香(Pogostemon cablin)的α-淀粉酶(alpha-amylase,AMY)基因,对其进行相关生物信息学分析。搜索本课题组建立的广藿香转录组数据库,获得AMY基因全长序列,并设计全长引物进行PCR验证;利用生物信息学软件对AMY基因进行生物信息学分析。本研究获得的广藿香AMY基因命名为PcAMY1基因(GenBank登录号为KC862311),该基因全长1 420 bp,编码422个氨基酸。基于生物信息软件分析了PcAMY1基因编码蛋白的理化特性。系统进化树分析结果表明,PcAMY1基因与牵牛(Ipomoea nil)的AMY序列同源性最高,与赤豆(Vigna angularis)、菜豆(haseolus vulgaris)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)等植物次之,与自然进化关系保持一致。PcAMY1基因在广藿香嫩茎、成熟茎、老茎、嫩叶、成熟叶、老叶中均有表达,但在老茎中表达量最高。成功克隆到广藿香PcAMY1基因,并对其进行相关生物信息学与基因表达分析。

浙南忍冬属药材rbcL基因序列分析

目的:分析浙南忍冬属药用植物叶绿体rbcL基因序列,探讨其差异。方法:Primer Premier5.0设计引物,用于rbcL基因PCR扩增,ClustalX1.83进行序列全比对。MEGA 4.0分析转换值、颠换值等;以七子花Heptacodium miconioides为外类群,邻接法(Neighbor-Joining,NJ)和最大简约法(Maximun Parsimony,MP)进行聚类分析(models:p-distance);自展法(Bootstrap)检验各分支可信度。结果:5种忍冬属药材rbcL基因片段长度在1 143～1 167 bp之间,手工校正后长度为1 137 bp,保守位点1 126个,变异位点11个,简约信息位点6个,碱基转换和颠换分别为3和2,比值为1.6;MP和NJ两种方法所得结果几乎一致,均将5种忍冬属药材分为两大支,黄褐毛忍冬与忍冬为第一大支,红腺忍冬、华南忍冬和灰毡毛忍冬为第二大支。结论:rbcL基因能够从分子水平揭示5种忍冬属药材的差异,为忍冬属药材鉴定以及系统发育提供重要参考依据。

大肠杆菌CodA基因表达赋予转基因青蒿负选择表型

目的为了验证CodA基因是否适宜作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。方法用PCR法扩增大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因CodA,经克隆和测序后插入植物基因表达载体pROK,并导入根癌农杆菌LBA4404(pAL4404)中。以共培养法转化青蒿叶盘,在添加25μg/mL卡那霉素(Kan)的N6培养基上选择青蒿转化愈伤组织并再生绿芽。将Kan抗性转基因青蒿芽转植到含有500μg/mL5-氟胞嘧啶(5-FC)和25μg/mLKan的MS培养基上继续培养2周。结果转基因青蒿芽全部死亡,而未转化青蒿芽仍正常生长,表明导入CodA基因的青蒿细胞已赋予其预期的负选择表型。经RT-PCR检测,转基因青蒿芽显示CodA阳性扩增带,而未转化青蒿芽无此特异扩增带。这一结果显示,CodA基因已在青蒿细胞中转录生成相应的mRNA,从而进一步印证了表型检测结果。结论CodA基因可作为有效的青蒿基因打靶负选择标记。

药用动物基因组及EST研究

以生物信息学数据库GenBank的生物信息为基础,对包括《中国药典》2000年版一部、《新编中药志》第4卷、《中国大百科全书》(中国传统医学分册)、《中药大辞典》及《天然药物化学》第3版中所涉及的450多种重要的药用动物的基因组、蛋白质及表达序列标签(EST)的注册情况进行了初步统计,就相关进展进行了综述。到2004年10月底截止的数据分析表明,所统计的药用动物中42%以上没有DNA报道;48%以上没有蛋白序列的报道。除模式动物和一些与人们日常生活密切相关的动物外,在GenBank数据库中仅能找到27种药用动物的EST数据,而药用动物基因组方面的数据也十分有限。并对这一领域的研究现状与展望进行了讨论。

利用SSR标记鉴定当归的真实性

采集当归及近缘属种材料,从文献中搜集SSR引物,及从NCBI中下载当归EST序列并设计若干引物,采用SSR标记技术筛选可用于鉴定当归真实性的特异标记。结果表明,共合成引物75对,利用2个当归模板进行引物筛选,能够扩增出清晰条带的引物有21对,有效引物扩增率为28%,筛选出多态性引物5对,多态引物扩增率为6.7%。5对引物在36份当归及近缘属种间共检测到41个位点,平均为8.2个;多态性位点41个,多态性比率(PPB)为100%;多态信息含量为0.1187~0.3101,平均为0.2588。遗传距离和相似度分析表明,当归与独活的遗传距离最近,与红柴胡遗传距离最远。当归与近缘属种间的遗传距离最小值明显大于4个产地的当归种内遗传距离最大值,因此,SSR标记可有效地鉴定区分当归与其它近缘属药材。

两种农药对核桃腐烂病伴生病原菌的抑菌作用研究

腐生细菌泛菌(Pantoea sp)是核桃腐烂病发生中的一种重要的伴生细菌,对核桃腐烂病的发生发展具有重要的促进作用.通过滤纸片法研究了两种常见的农药石硫合剂和农用链霉素对泛菌的抑制作用,结果表明,石硫合剂和农用链霉素对该菌的抑制作用较强,且具较好的剂量效应.

雪峰虫草子座不同生长发育时期的转录组研究

目的:挖掘调控雪峰虫草生长发育的相关通路和基因,揭示其子座生长发育的内在分子机制。方法:采用转录组测序技术(RNA-Seq)对雪峰虫草子座菌丝体(MD1)、子座原基(PD2)和子座(SD3)生长发育3个不同阶段进行测序;数据通过非冗余蛋白(NR)、Swiss-Prot、Pfam、京都基因与基因组百科全书(KEGG)、真核生物相邻类的聚簇(KOG)、基因本体(GO)数据库进行功能注释。利用EdgeR软件进行差异表达基因分析,挖掘调控雪峰虫草子座生长发育的相关通路和基因。结果:测序结果显示,MD1、PD2、SD3分别获得了8.15、7.51、6.87GB分析数据,拼接分析数据共获得34218个转录本,平均长度为5502bp,组装及去冗余后获得10511条unigenes,平均长度为2470bp。KOG功能注释和GO富集分析显示,细胞和细胞组分、新陈代谢过程、信号转导及碳代谢是雪峰虫草子座发育过程中的关键基因类别。对子座不同生长发育时期的基因进行差异表达分析发现,PD2和SD3相比差异表达基因最多,其中上调基因1073个,下调基因1036个,MD1和SD3相比差异表达基因最少,上调基因533个,下调基因578个。差异表达基因的KEGG通路富集结果显示,细胞外信号调节激酶(MAPK)信号通路是参与调节雪峰虫草子座生长发育的关键信号通路。结论:Ste2和Gpd1及其所在途径可能分别调控雪峰虫草子座原基的形成和子座的生长。