机器学习鉴定KDELR3作为骨关节炎缺氧特征基因的实验验证

背景:缺氧与骨关节炎软骨细胞损伤的发生、发展密切相关,但具体作用靶点及调控机制尚不清楚。目的:运用机器学习方法鉴定KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)受体3(KDELR3)作为骨关节炎缺氧的特征基因及免疫浸润分析,以期为骨关节炎的治疗提供新的思路与方法。方法:从GEO数据库下载骨关节炎相关的数据集和GSEA网站中获取缺氧相关基因;采用R语言对骨关节炎数据集进行批次校正及免疫浸润分析,并提取骨关节炎缺氧基因进行差异分析,对差异表达基因进行GO功能及KEGG信号通路分析;同时运用加权基因共表达网络分析(Weighted correlation network analysis,WGCNA)及机器学习筛选骨关节炎缺氧的特征基因,并进行体外细胞实验,运用数据集及qPCR验证表达并行相关免疫浸润分析。结果与结论:①经批次校正及主成分分析获得骨关节炎基因8492个,主要与Macrophages M2和Mast cells resting等免疫细胞密切相关;同时获得缺氧基因200个,进而得到41个骨关节炎缺氧差异表达基因。②GO分析主要涉及对营养水平、糖皮质激素反应等生物过程;涉及溶酶体腔、高尔基内腔等细胞组分;涉及14-3-3蛋白结合、DNA结合转录激活剂活性等分子功能。③KEGG分析骨关节炎缺氧差异表达基因与PI3K-Akt、FoxO及癌症中的微小RNA等信号通路有关。④运用WGCNA分析及机器学习筛选后获得特征基因KDELR3。⑤通过基因芯片验证后发现KDELR3基因在滑膜中实验组基因表达高于对照组(P=0.014),而半月板中实验组基因的表达却低于对照组(P=0.024)。⑥体外软骨细胞实验显示KDELR3基因在软骨中实验组表达高于对照组(P=0.005),同时KDELR3基因与Macrophages M0(P=0.014),T cells follicular helper(P=0.014)等密切相关。运用机器学习方法证实KDELR3可作为骨关节炎缺氧特征基因,可能通过改善缺氧来干预骨关节炎发病,期待能为更好地治疗骨关节炎提供新方向。

弱精子症患者精子锌稳态蛋白、GPR39和ANO1 mRNA的表达变化及其临床意义

目的:探究锌稳态相关蛋白、G蛋白偶联受体39(GPR39)及ANO1 mRNA在弱精子症精子中的表达变化,并分析其与精子运动能力的相关性。方法:选取2022年6月至2023年4月我中心收集的弱精子症患者精液标本(PR+NP<40%,PR<32%,精子浓度>15×10^(6)/ml)40例,正常精液标本(PR+NP≥40%,PR≥32%,精子浓度>15×10^(6)/ml)42例。通过CASA检测精液常规参数及精子活力,测量两组精浆锌的含量,运用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对两组精子锌转运蛋白(ZIP13、ZIP8、ZNT10)、金属硫蛋白(MT1G、MT1、MTF)、GPR39和钙依赖性氯离子通道蛋白(ANO1)表达进行定量检测;运用激光共聚焦检测精子中的游离锌分布;运用免疫荧光染色观察精子中GPR39、MT1蛋白的表达;进一步采用Spearman秩相关分析其与精液参数的相关性。结果:与正常组相比,弱精子症组精浆锌的浓度无明显差异(P>0.05),弱精子症组精子游离锌水平明显降低(P<0.05);RT-qPCR检测结果显示,弱精子症组精子MT1G、MTF、ZIP13、GPR39、ANO1 mRNA相对表达量低于正常组(P<0.05);两组间ZIP8、ZNT10、MT1 mRNA相对表达量无显著性差异(P>0.05);免疫荧光结果显示弱精子组GPR39蛋白表达较低(P<0.05);相关性分析结果显示MT1G、MTF、GPR39、ANO1 mRNA相对表达量与前向运动精子百分率和精子活动率呈正相关(P<0.05)。结论:弱精子症患者精子锌稳态蛋白(MT1G、MTF、ZIP13)、GPR39和ANO1 mRNA表达下调且其表达与精子运动能力呈正相关。

抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用

目的构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用。方法采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测。结果成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39。表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强。结论抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用。

抗HER-2嵌合抗体chA21对SKBR3细胞的增殖抑制及凋亡诱导作用

目的探讨抗HER-2嵌合抗体chA21在体外抑制高表达HER-2的人乳腺癌SKBR3细胞增殖并诱导其凋亡的作用。方法采用MTT比色法、HE染色、透射电镜、流式细胞术(FCM)、原位末端标记技术(TUNEL)等方法观察和检测chA21对人乳腺癌SKBR3细胞增殖的抑制和凋亡的诱导。结果chA21(0.2～5.4mg.L^(-1))可抑制SKBR3细胞的增殖并诱导其凋亡,其作用呈剂量和时间依赖性。结论chA21在体外可抑制SKBR3细胞的增殖,诱导其凋亡是其主要作用途径之一。

顺铂处理卵巢癌细胞系OVCAR3引起Survivin表达差异的研究

的 探讨顺铂(DDP)处理卵巢癌细胞系时Sur-vivin表达是否有变化,进而探讨Survivin表达与肿瘤细胞耐药之间的关系及其在肿瘤细胞获得性耐药及细胞凋亡耐受所起的重要作用。方法 以卵巢癌细胞系OVCAR3为材料,用MTT比色法检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡。RT-PCR检测Survivin mRNA表达差异,Western blot检测Survivin蛋白表达变化。结果 顺铂抑制卵巢癌细胞生长,具有时间和浓度依赖效应,即随时间延长和浓度增加,细胞生长抑制越强,细胞凋亡率也有同样的趋势,最高达31.6％。1mg·L^(-1)DDP处理卵巢癌细胞,Survivin mRNA及蛋白表达随作用时间的增长,分别在8 h和12 h达最高,随后又降低。结论 抗凋亡蛋白Survivin在卵巢癌细胞系中呈高表达,顺铂处理卵巢癌细胞,Survivin mRNA表达随作用时间延长而增加,这可能是卵巢癌细胞对化疗药物产生耐药性的重要因素之一。

日本血吸虫SjIR3 DNA疫苗诱导的抗攻击感染保护力

目的探讨日本血吸虫SjIR3核酸疫苗诱导小鼠抗日本血吸虫攻击感染的保护效果。方法用SjIR3的特异引物构建疫苗SjIR3/pC。54只昆明小鼠随机分为3组:A组(对照组)、B组(空质粒组)和C组(实验组)分别肌注生理盐水(100μl)、pcDNA3.0和SjIR3/pC(各50μg),共免疫3次,每次间隔2周。于每次免疫前和感染前尾静脉采血,ELISA检测血清IgG抗体水平。末次免疫后2周,各组剖杀其中6只小鼠取脾细胞,分别用ConA或rSjIR3重组蛋白诱导,用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测脾淋巴细胞增殖情况。各组余下小鼠分别经腹部感染日本血吸虫尾蚴40±1条,45d后宰杀,观察实验组小鼠的减虫率和肝减卵率。结果ELISA结果显示,A组与B组IgG抗体水平变化不明显(P>0.05),C组于末次免疫后2周(攻击感染前)IgG抗体水平最高为0.78±0.05,且与A、B两组比较差异有统计学意义(P<0.01);末次免疫后,实验组小鼠脾淋巴细胞分别在ConA或rSjIR3重组蛋白诱导下可增殖,分别为0.57±0.02、0.68±0.01,与A、B组相比差异有统计学意义(P<0.01)。经SjIR3/pC免疫的实验组小鼠攻击感染后可产生29.4%的减虫率和36.6%的肝减卵率。结论SjIR3/pC核酸疫苗具有较好的免疫原性,可诱导小鼠产生部分免疫保护力。

小鼠胫骨骨折愈合中FGFR3基因表达的原位定位

目的 观察成纤维细胞生长因子受体3 (FGFR3 )基因在小鼠胫骨骨折愈合中的时空表达模式,分析FGFR3在骨折愈合中可能的作用。方法 选用标准的小鼠胫骨骨折模型,常规石蜡切片,观察FGFR3mRNA在骨折愈合过程中不同时期的基因表达情况。结果 骨折后软骨痂中前软骨细胞中出现微弱的FGFR3mRNA信号。至7d ,骨痂肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中均可见FGFR3mRNA强阳性表达。到14d和2 8d ,骨痂软骨细胞被成骨细胞取代,FGFR3阳性表达信号消失。结论 FGFR3在小鼠胫骨骨折愈合中的肥大前软骨细胞和肥大软骨细胞中表达,提示参与调节胚胎骨骼发育中软骨细胞增殖的FGFR3基因,可能在成年骨折愈合中参与调节了软骨细胞的分化而影响骨折愈合。

抗ErbB2嵌合抗体chA21对SKBR3细胞的增殖抑制以及对PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响

目的检测抗ErbB2嵌合抗体chA21对高表达ErbB2乳腺癌细胞SKBR3的增殖抑制作用,并分析抗体对细胞膜上ErbB2分布以及对细胞PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响,探讨chA21的抑癌机制。方法采用MTT检测chA21对SKBR3的增殖抑制作用,流式细胞术检测经chA21处理后细胞膜上ErbB2抗原的分布变化,Western blot检测抗体作用后对细胞PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的影响。结果chA21可抑制SKBR3细胞的增殖,其作用呈剂量和时间依赖性。抗体作用后可下调细胞膜上ErbB2含量,并不同程度下调细胞的PI3K/Akt和Erk1/2的活化水平。结论chA21可抑制SKBR3细胞增殖,可能通过下调细胞膜上ErbB2分布而减少其介导的PI3K/Akt和Erk1/2信号转导途径的活化来实现的。

GM-CSF诱导人脐血CD34^+造血干细胞上CXCR3的表达

目的 研究GM CSF诱导人脐血CD34 + 造血干细胞上CXCR3的表达。方法 采用流式细胞仪 ,实时定量逆转录PCR(RT PCR)分析 ,及其配体γIP 10和Mig诱导的趋化和粘附作用分析。结果 CXCR3也表达在受GM CSF刺激后的CD34 + 造血干细胞上 ,但它在新鲜分离的CD34 + 造血干细胞上不表达。应用实时定量逆转录PCR技术检测新鲜分离的CD34 + 造血干细胞有较低水平的CXCR3mRNA表达 ,而GM CSF能上调CXCR3的表达。用抗CXCR3单克隆抗体 (mAb)能阻断γIP 10和Mig诱导的造血干细胞趋化作用 ,证实γIP 10和Mig是通过CXCR3而发挥作用的。γIP 10和Mig通过CXCR3不仅可诱导趋化作用而且还可诱导GM CSF刺激后的CD34 + 造血干细胞粘附和聚集作用 ,而抗CXCR3mAb能阻断γIP 10和Mig这些功能 ,但不能阻断SDF 1α的作用。γIP 10和Mig能提高整合素(CD49a和CD49b)的表达 ,这在GM CSF刺激后CD34 + 造血干细胞的粘附作用中发挥重要作用。结论 在细胞因子 /趋化因子微环境中 ,CXCR3 γIP 10和 Mig受体配体复合物及GM CSF对CD34 + 造血干细胞分化成淋巴干细胞和髓系干细胞以及后来的免疫 /炎症细胞的生理和病理过程起特别重要作用。这些过程包括CD34 + 造血干细胞的迁移、再定位、分化和成熟。

FGFR3在骨骼发育和疾病中作用的研究进展

FGFR3是成纤维细胞生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptors,FGFRs)家族成员之一,在骨骼发育中起重要作用。FGFR3的激活突变引起一系列骨骼发育缺陷性疾病,如软骨发育不全(achondroplasia,ACH)、季肋发育不全(hypochondroplasia,HCH)和致死性骨发育不全(thanatophoricdysplasia,TD)。目前研究认为,FGFR3在骨骼发育中抑制软骨形成的作用是明确的,但其对骨形成的作用尚不明确,需要进一步研究。

新型雌激素受体GPR30的研究进展

雌激素作为一类重要的性激素．在女性一生的正常生长发育和病理状况中起着至关重要的作用。从女性的周期性子宫内膜脱落到乳腺癌、子宫内膜癌等恶性肿瘤的产生均有它的参与。长期以来，可溶性细胞内雌激素受体ERα／β（ER）一直被认为是其作用的唯一受体。该类受体通过与雌激素结合，发生构象变化，继而与细胞核内DNA结合，作为转录因子，

HPV16/18E6、TLR3蛋白和血清CRP水平在乳腺浸润性导管癌中的表达

目的探讨乳腺浸润性导管癌组织中人乳头瘤病毒16/18E6(HPV16/18E6)、Toll样受体3(TLR3)蛋白及血清C反应蛋白(CRP)水平表达之间的关系及其临床意义。方法采用免疫组化染色和电化学发光分析技术检测柳州女性50例乳腺浸润性导管癌、30例乳腺导管原位癌(DCIS)、30例乳腺导管上皮非典型增生(ADH)和30例正常乳腺对照组组织中HPV16/18E6、TLR3蛋白表达和血清CRP水平,比较分析癌组、DCIS组、ADH组及对照组中HPV16/18E6、TLR3蛋白及血清CRP表达之间的相互关系,评价癌组中HPV16/18E6、TLR3蛋白及血清CRP阳性表达与临床病理特征之间的关系及其与ER、PR、HER2、Ki-67表达的相关性。结果癌组、DCIS组、ADH组及对照组中HPV16/18E6、TLR3蛋白及血清CRP阳性表达率差异均有统计学意义(P<0.01)。癌组及DCIS组HPV16/18E6蛋白和TLR3蛋白的阳性表达率均显著高于对照组(均P<0.01),且癌组、DCIS组和ADH组中血清CRP阳性率均显著高于对照组(均P<0.01)。HPV16/18E6阳性癌组中TLR3蛋白及血清CRP的阳性率均显著高于HPV16/18E6阴性组(均P<0.05);癌组、DCIS组及ADH组中HPV16/18E6与TLR3蛋白和血清CRP表达之间均呈正相关(P<0.01),TLR3蛋白与血清CRP表达亦呈正相关(P<0.01);癌组中HPV16/18E6、TLR3蛋白和血清CRP水平均与HER2和Ki-67的表达呈正相关(P<0.001);HPV16/18E6、TLR3蛋白及血清CRP阳性表达与组织学分级、淋巴结转移和pTNM分期相关(P<0.05)。此外,HPV16/18E6和TLR3蛋白的阳性表达均与肿瘤直径大小有关(P<0.05)。结论HPV16/18感染介导的TLR3蛋白阳性表达和血清CRP高水平可能涉及了HPV16/18感染后乳腺癌的发生、发展过程,TLR3蛋白和血清CRP水平可作为临床监测、评估HPV16/18相关乳腺癌患者疾病进展和预后影响因素的指标。

CD34^+造血祖细胞的聚集、CXCR3 mRNA的检测及CXCR3极化的研究

目的 研究新鲜分离的和粒细胞单核细胞 集落刺激因子 (granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM CSF)刺激的CD34+ 造血祖细胞上CXC趋化性细胞因子受体 3(CXCchemokinereceptor 3 ,CXCR3)mRNA水平表达的区别 ,以及在γ 干扰素诱导蛋白 10 (IFN γinducibleprotein10 ,γIP 10 )和γ 干扰素诱导的单核因子 (monokineinducedbyIFN γ ,Mig)的作用下 ,GM CSF刺激的CD34+ 造血祖细胞的聚集作用和CXCR3分布的变化。方法 采用Northernblotting检测CXCR3mRNA水平的表达 ;2 4孔板细胞培养法观察细胞聚集作用 ;荧光标记抗体染色CXCR3后 ,以共聚焦免疫荧光显微镜观察CXCR3的极化现象。结果 GM CSF刺激的CD34+ 造血祖细胞上CXCR3mRNA表达水平明显高于新鲜分离的细胞 ;γIP 10和Mig能够诱导GM CSF刺激的CD34+ 造血祖细胞发生聚集现象和CXCR3重新分布现象 ,CXCR3聚集成束 ,并指向特定的方向。结论 GM CSF的刺激作用能够显著性提高CXCR3在CD34+ 造血祖细胞上的表达 ;γIP 10和Mig能够诱导GM CSF刺激的CD34+ 造血祖细胞的聚集作用和CXCR3的极化现象。

应用酵母双杂交系统筛选FGFR3相互作用的蛋白质

目的通过酵母双杂交系统从小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库中筛选与成纤维细胞生长因子受体3(FG-FR3)相互作用的蛋白质,为研究FGFR3信号通路提供新的线索。方法构建FGFR3胞内区的真核表达载体R3-PI,转化酵母菌AH109。毒性实验及自激活实验证实FGFR3胞内区蛋白对酵母细胞无毒性,不存在自激活现象。将小鼠17.5 d全胚胎cDNA质粒文库转入AH109/R3-PI酵母菌中,能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质。结果通过初步筛选得到3种能够与FGFR3胞内区相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用。结论通过筛选发现CLK4与FGFR3胞内区之间存在相互作用,提示FGFR3可能通过CLK4参与能量代谢调节,而CLK4可能通过对FGFR3的磷酸化或去磷酸化调节FGFR3的活性。

FGFR3转染小鼠骨髓间充质干细胞对CbfaⅠ和CollagenⅠ表达的影响

目的观察腺病毒载体Ad-FGFR3转染对小鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相关成骨基因CbfaⅠ与CollagenⅠ表达的影响。方法采用Ad-FGFR3与重组空载体Ad-GFP病毒上清转染小鼠MSCs,RT-PCR和Western blot等方法检测FGFR3、CbfaⅠ与CollagenⅠmRNA及蛋白的表达水平。结果RT-PCR及Western blot检测结果显示Ad-FGFR3转染组MSCs FGFR3、CbfaⅠ与CollagenⅠ的表达显著增强(P<0.05)。结论Ad-FGFR3转染显著增强MSCs相关成骨基因CbfaⅠ和CollagenⅠ的表达。

沉默Fcgr3降低SiO_(2)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S炎性因子表达

目的探讨沉默免疫球蛋白G Fc段受体Ⅲ(FcγRⅢ)对SiO_(2)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S炎性因子表达的影响。方法构建Fcgr3 shRNA的慢病毒质粒;人胚肾细胞系293T培养包装产生慢病毒;慢病毒感染沉默MH-S中的FcγRⅢ,并筛选稳定感染的细胞。定量多聚酶链反应(qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MH-S巨噬细胞系中FcγRⅢ的mRNA和蛋白表达。将MH-S细胞分为MH-S+sh-NC、MH-S+SiO_(2)+sh-NC、MH-S+sh-Fcgr3和MH-S+SiO_(2)+sh-Fcgr3,其中SiO_(2)处理条件为100 mg/L连续刺激12 h。通过qPCR检测炎性因子转录水平,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测细胞培养上清中的炎性因子的含量,包括肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)。结果包装慢病毒并感染细胞后建立稳定沉默Fcgr3的MH-S细胞系,稳定转染细胞中FcγRⅢ的转录与蛋白表达水平较对照组降低(P<0.05)。与对照组相比,SiO_(2)刺激后Tnf、Il1b和Il6的转录水平明显升高(P<0.05),沉默Fcgr3后炎症因子转录水平显著下降(P<0.05);与对照组相比,SiO_(2)刺激后TNF-α和IL-6的分泌量明显升高(P<0.05),沉默Fcgr3后炎症因子分泌水平显著下降(P<0.05)。结论沉默Fcgr3能够降低SiO_(2)诱导的肺泡巨噬细胞炎性因子的表达。

非瑟酮通过上调GPR35抑制吗啡诱导的小鼠小胶质细胞BV2活化和炎症反应

目的:探讨非瑟酮抑制吗啡诱导的小鼠小胶质细胞BV2活化和炎症的机制。方法:通过吗啡干预BV2细胞构建细胞模型,将细胞随机分为6组:对照组、吗啡组、吗啡+2μmol/L非瑟酮组、吗啡+4μmol/L非瑟酮组、吗啡+8μmol/L非瑟酮组和吗啡+10μmol/L米诺环素组,实验重复3次。CCK-8法检测细胞活力;ELISA试剂盒检测细胞上清液中炎症因子水平;Western blot检测炎症相关蛋白及BV2细胞活化标志物表达水平;RT-qPCR和Western blot检测G蛋白偶联受体35(GPR35)的表达;BV2细胞转染GPR35干扰质粒验证非瑟酮是否通过调控GPR35抑制吗啡诱导的BV2细胞活化和炎症反应。结果:与对照组相比,不同剂量非瑟酮单独处理后BV2细胞活力均无显著差异;吗啡组细胞活力升高,炎症因子[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)和IL-6]、环加氧酶2(Cox-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达增加,BV2细胞活化标志物离子钙结合接头分子1(Iba-1)和CD11b表达上调(P<0.05)。与吗啡组相比,吗啡+非瑟酮组和吗啡+米诺环素组细胞活力降低,炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、Cox-2和iNOS蛋白表达减少,BV2细胞活化标志物Iba-1和CD11b表达下调(P<0.05)。RT-qPCR和Western blot结果显示,非瑟酮剂量依赖性地增加吗啡诱导的BV2细胞中GPR35的表达(P<0.05)。干扰GPR35逆转非瑟酮对吗啡诱导的BV2细胞活化和炎症反应的抑制作用。结论:非瑟酮可能通过上调GPR35抑制吗啡诱导的小鼠小胶质细胞BV2活化和炎症。

非基因型雌激素膜性受体GPR30在生后雌性大鼠海马内的发育学表达与亚细胞水平定位研究

为了研究非基因型雌激素膜性受体GPR30对海马的结构和功能的调节作用,应用硫酸镍铵增强显色的免疫组化技术以及酶标免疫电镜技术,观察了生后雌性大鼠海马内GPR30表达的变化及其免疫阳性产物在神经元亚细胞水平的定位情况.结果显示,GPR30免疫阳性产物主要位于海马CA区的锥体层神经元与齿状回颗粒层的神经元内,其表达水平随发育呈增加趋势.P0时在雌性大鼠海马未发现明显GPR30免疫阳性反应,P7后免疫阳性物质开始在CA2出现,P14时见于CA1、CA2和齿状回,P30和P60主要见于CA1、CA2、CA3和齿状回.在光镜下,GPR30免疫阳性产物位于细胞核外的胞浆中,细胞核未见免疫阳性反应.在透射电镜下可见其位于神经元的胞浆内,可能主要是粗面内质网,也可见于线粒体和细胞膜.以上结果证实,GPR30是一种位于细胞核外的、非基因型作用的雌激素受体,可能参与了雌激素对海马锥体神经元突触可塑性和学习记忆等功能的调节,还可能参与了对齿状回成年神经干细胞某些活动的调节.

利用基因扫描分析TCR Vβ亚家族的CDR3长度方法检测T细胞克隆性

分析了健康人、Ｔ－ＡＬＬ外周血及Ｔ细胞株Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ中ＴＣＲＶβＴ细胞的表达和克隆性。应用ＲＴ－ＰＣＲ扩增ＴＣＲＶβ２４个亚家族的ＣＤＲ３，并经基因扫描和序列分析确定Ｔ细胞克隆性。结果表明健康人表达除Ｖβ２０外的多克隆Ｔ细胞；Ｔ－ＡＬＬ仅表达３～４个Ｖβ亚家族Ｔ细胞；部分呈寡克隆性；Ｍｏｌｔ－４和Ｊｕｒｋａｔ分别表达Ｖβ２和Ｖβ８单克隆Ｔ细胞。Ｔ－ＡＬＬ中存在克隆性生长Ｔ细胞。该方法是检测Ｔ细胞克隆性的敏感和精确的方法。

活动性肺结核患者α/βTCR基因重排及CDR3谱型分析

目的:建立多重PCR方法扩增α/βTCR全长序列,分析活动性肺结核患者病变局部T淋巴细胞α/βTCR基因重排特点及CDR3谱型。方法:分离结核患者肺泡灌洗液中的淋巴细胞,提取RNA后用SMART方法逆转录,运用根据现有文献设计的α和βTCR扩增引物,进行多重PCR扩增以获得其全长序列,构建重组质粒并测序,利用DNAstar及网上TCR资源分析序列。结果:3例患者共获得24个α链序列,13个β链序列。α链以AV1S2(54%)、AV12S3(41%)、AV12S2(5%)为主;β链以BV2(38%)、BV29S1(46%)、BV14(3%)、BV4S2(3%)为主。同一病例及不同病例之间CDR3区呈现多样性,但是标本1、标本3各有一条β链的CDR3氨基酸序列相同:SVGTGTLHQETQY;标本2和标本3的各有2条α链CDR3序列相同:AVRDWAGNMLT;标本2的一个α链和标本3的一个α链的CDR3均有:AV…DNN…RLM序列。结论:建立了TCRα和β链全长序列的多重PCR扩增方法。结核患者病变局部克隆性增殖的TCRα和β链谱型呈限制性取用,克隆增生的T淋巴细胞来自不同的亚群,但是相同的CDR3序列对于识别MTB多肽可能具有特异性。