细胞信号通路调控间充质干细胞成骨分化机制的研究进展

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)自被发现以来,因其多向分化潜能而备受医学工作者关注。MSCs的成骨分化以及多种信号通路及其激活的下游网络参与了骨缺损和骨丢失的再生修复过程。本文通过系统分析MSCs成骨分化的分子机制,综述几种重要信号通路在MSCs成骨分化的调控因素,为MSCs在骨组织修复工程中提供理论基础。

抑制转化生长因子β和Notch信号通路诱导人胆囊上皮细胞分化为功能性肝细胞样细胞

目的通过小分子化合物改变细胞命运,诱导人胆囊上皮细胞(hGBEC)分化为具有功能的肝细胞样细胞。方法在基质胶中对原代hGBEC进行三维培养,生长培养基中添加B27添加剂、N2添加剂、N-乙酰半胱氨酸、表皮生长因子、肝细胞生长因子等。添加小分子化合物/蛋白因子对细胞进行诱导分化,筛选出关键作用因子。采用PCR、qPCR和免疫荧光染色检测干细胞标志物及肝细胞相关标志物的表达情况,通过脂肪BODIPY-493染色、糖原过碘酸希夫染色和白蛋白ELISA检测评估细胞的肝样功能。结果三维培养的hGBEC表达造血干细胞抗原CD133、上皮细胞黏附分子、肝细胞核因子4α等肝脏干细胞和肝前体细胞标志物。TGF-β信号通路抑制剂和Notch信号通路抑制剂是诱导hGBEC分化的关键作用因子。分化条件下所得细胞表达肝细胞功能标志物α1-抗胰蛋白酶、细胞色素P4503A4、白蛋白和延胡索酰乙酰乙酸水解酶,可以贮存糖原,具有合成脂肪的能力,能够分泌白蛋白。结论hGBEC可在体外长期培养,通过抑制TGF-β和Notch信号通路可初步诱导其分化为具有部分肝功能的肝细胞样细胞。

电穿孔法转染人原代成纤维细胞条件的优化

目的通过优化电穿孔转染条件,探讨影响人原代成纤维细胞电转染效率和转染后细胞存活率的因素,筛选出人原代成纤维细胞的最佳电转染条件。方法通过改变脉冲电压、脉冲次数和质粒浓度等条件,将含有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGFP-N1电穿孔转染入人原代成纤维细胞。利用锥虫蓝染色检测细胞存活情况,采用流式细胞术检测转染24h后的转染效率。结果在低电压模式下,脉冲电压320V、质粒浓度为20μg/mL、脉冲1次时,人原代成纤维细胞的电转染效果最理想,转染效率达到(42.53±0.63)%,细胞存活率为(74.30±3.01)%。结论优化了人原代成纤维细胞的电转染条件,在保证细胞较高存活率的前提下提高了人原代成纤维细胞的电转染效率,为后续基因功能的研究打下基础。

脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用及其细胞内信号传递

目的:观察体外培养大鼠胚脑皮质神经元对缺氧耐受的时间窗,探讨外源性脑源性神经营养因子对缺氧神经元保护作用的时效-量效关系,及该保护作用可能的细胞内信号传递途径。方法:实验于2004-02/2005-02在四川大学华西医院移植工程及移植免疫实验室完成。体外培养孕17～19dSD大鼠皮质神经元,随机数字法分为基线对照组、单纯缺氧组及缺氧+脑源性神经营养因子组,7d后作缺氧培养,采用四氮唑盐比色法检测0～10h段各时间点单纯缺氧组和缺氧+脑源性神经营养因子组(分别在缺氧前24h及缺氧前即刻加入25～100μg/L脑源性神经营养因子)存活率的差别,并用Westernblotting检测两组神经元在Akt/磷酸化Akt及CREB/磷酸化CREB表达的差别。结果:①脑源性神经营养因子对缺氧神经元的保护作用是相对的,该保护作用具有时效-量效关系,缺氧前24h加入大剂量脑源性神经营养因子组(100μg/L)优于缺氧即刻加入小剂量(25μg/L)组,缺氧损伤到一定程度后(>10h)脑源性神经营养因子的保护作用将明显减弱犤缺氧前24h加入100μg/L脑源性神经营养因子在1,2,4,8,10h细胞活性分别为基线对照组的(133.85±3.72)%,(109.83±5.43)%,(86.15±0.68)%,(53.78±1.71)%,(33.41±1.64)%,而缺氧前即刻加入25μg/L脑源性神经营养因子组在以上时点细胞活性分别为基线对照组的(81.55±1.07)%,(92.10±4.89)%,(78.75±1.87)%,(43.58±2.42)%,(33.13±0.94)%,单纯缺氧组的细胞活性分别为基线对照组的(82.12±3.15)%,(81.79±2.61)%,(64.5±4.56)%,(45.9±1.74)%,(35.45±1.25)%犦。②加入脑源性神经营养因子可使磷酸化Akt表达增加,磷酸化CREB表达提前并维持较长时间。结论:脑源性神经营养因子可减轻缺氧对神经元的损害,而Akt表达上调可能是脑源性神经营养因子发挥其对缺氧神经元保护作用的重要途径之一。

富血小板血浆与血小板裂解液对大鼠骨髓间充质干细胞增殖影响的比较

目的通过对比分析富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)与血小板裂解液(platelet lysate,PL)对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)生长增殖、细胞周期的作用,探讨二者对大鼠BMSCs生长增殖的影响。方法取20只4周龄SD大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,并采用流式细胞仪鉴定;另取30只12周龄SD大鼠心内采血,梯度离心法获得PRP,采用3次离心结合反复冻融法制备PL。取生长状态良好的第3代BMSCs进行实验,根据培养基成分不同将实验分为7组,普通完全培养基组(A组)、1%PRP条件培养基组(B组)、1%PL条件培养基组(C组)、5%PRP条件培养基组(D组)、5%PL条件培养基组(E组)、10%PRP条件培养基组(F组)及10%PL条件培养基组(G组)。MTT检测BMSCs增殖情况;免疫荧光检测BMSCs中增殖细胞核抗原(PCNA)的表达情况;流式细胞仪检测BMSCs细胞周期的变化;蛋白质印迹检测CyclinD1和p27Kip1蛋白表达。结果培养24、48、72h时,1%、5%、10%PRP与1%、5%、10%PL条件培养基组均可以促进BMSCs的增殖,并具有时间、剂量依赖性(P<0.05);相同浓度的PRP与PL对BMSCs增殖作用的差异均无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测显示,PRP与PL均可以促进PCNA蛋白表达(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.01)。流式细胞仪检测显示,不同浓度PRP及PL条件培养基组与普通完全培养基组比较,G0/G1期细胞比例逐渐减少,S、G2/M期细胞比例逐渐增多,增殖指数(PI)升高,差异具有统计学意义(P<0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05);然而,相同浓度的PRP及PL对BMSCs细胞周期的影响相似,差异均无统计学意义(P>0.05)。蛋白质印迹检测结果显示,5%PRP与5%PL能促进CyclinD1表达上调和p27Kip1表达下调。结论不同浓度PRP与PL能够通过上调CyclinD1以及抑制p27Kip1蛋白的表达,加快体外培养的大鼠BMSCs的细胞周期进程,促进BMSCs增殖,并呈现显著的时间、剂量依赖性;BMSCs增殖过程中,相同浓度PL与PRP的促增殖效果相同,PL可能代替PRP促进骨缺损修复。

茶黄素对人骨髓基质干细胞的成骨诱导作用

目的探讨茶黄素对体外培养人骨髓基质干细胞(BMSCs)的成骨诱导作用及其能力。方法将第二代人BMSCs分为茶黄素组、对照组,茶黄素组加入浓度为10 mmol/L茶黄素,对照组不干预。对比观察两组干预后细胞形态,钙结节、碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原及骨钙素(OCN)免疫组化染色结果,并检测各组4、8、12、16 d各时点ALP、OCN活性。结果茶黄素组钙结节、ALP、Ⅰ型胶原及OCN免疫组化染色均呈阳性,对照组均为阴性;茶黄素组各时点ALP、OCN活性均高于对照组(P均<0.05)。结论茶黄素可促进人BMSCs向成骨细胞分化。

脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSCS),并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞(MSCs),经流式细胞仪检测,细胞表面标志CD29和CD44表达阳性,但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3.1-IGF-1转染MSCs,对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞(MSCs);脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs,Western blot鉴定转染成功,转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞,转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。

干细胞基础研究和临床研究的现状分析

目的了解近5年干细胞领域基础研究与临床转化现状,为相关领域学科发展提供参考。方法干细胞基础研究部分,于2020年5月15日检索Web of Science核心合集数据库中2015年至2020年干细胞相关文献,选择该领域的高被引论文及热点论文共计1954篇,通过CiteSpace软件进行关键词分析和聚类分析。干细胞临床研究部分,于2020年5月23日检索美国临床试验数据库(ClinicalTrials.gov)及国家药品监督管理局药品审评中心、中国医药生物技术协会官方网站公布的数据,利用Excel 2007进行汇总整理。结果在基础研究方面,“表达”“分化”“多能干细胞”“T细胞”和“祖细胞”为干细胞研究的热点,并聚类为“胚胎干细胞”“肿瘤干细胞”“抗宿主病”“细胞来源外泌体”“骨组织工程”“克隆性造血”和“创伤性脑损伤”7个主题。在临床研究方面,检索到全球有5506项干细胞相关临床试验,其中我国有482项。全球已批准上市的干细胞产品有18个,以间充质干细胞为主,国内干细胞产品尚处于临床试验阶段。国内已完成备案的73项干细胞临床研究项目中约2/3(49项)为间充质干细胞相关项目,33项(45.2%)涉及脐带来源间充质干细胞,研究疾病类型主要有银屑病、狼疮性肾炎、急性心肌梗死、骨关节炎等。结论对于干细胞研究热点和7个热点主题领域应予以关注。无论是全球已上市的干细胞产品,还是国内开展的干细胞临床研究均以间充质干细胞居多。

人主动脉瓣间质细胞原代培养及体外钙化模型的建立

目的原代培养人主动脉瓣间质细胞并建立体外瓣膜细胞钙化模型,诱导人主动脉瓣间质细胞向成骨细胞分化,并观察其表型变化。方法采用胶原酶两次消化法原代培养人主动脉瓣间质细胞,取传代3～7代间质细胞,随机分为2组,实验组以钙化诱导培养基培养,对照组以标准培养基培养。1周后,行von Kossa染色观察钙化结节形成情况,分光光度计测定碱性磷酸酶活性,免疫荧光染色检测瓣膜间质细胞表型蛋白,real-time PCR及蛋白质印迹分析检测成骨相关因子的表达,评价模型建立情况。结果培养1周后实验组出现钙化结节,每孔钙化结节数量[(51.20±14.31)个]高于对照组[(3.60±1.82)个],差异有统计学意义(P<0.05),同时实验组碱性磷酸酶活性较对照组升高(约上升4倍,P<0.05),细胞收缩表型平滑肌肌动蛋白(α-SMA)增高。Real-time PCR及蛋白质印迹分析提示,实验组中成骨相关因子Runx2、osteocalcin及osteopontin在mRNA及蛋白水平均较对照组升高,磷酸化Smad1/5/8蛋白表达也同时升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立了人主动脉瓣间质细胞体外诱导钙化模型,诱导后间质细胞呈现相对激活状态,表型向收缩表型和成骨表型转化,为今后实验提供了可靠的细胞模型。

联合单层培养和三维培养的两步法培养软骨细胞

目的联合单层培养和三维培养方法,探讨软骨细胞培养的理想方法。方法第一步先将软骨细胞进行常规单层培养扩增,第二步再将单层培养第4代软骨细胞包裹于海藻酸钠水凝胶中进行三维培养。通过倒置显微镜定期观察软骨细胞的形态变化;应用锥虫蓝染色和LIVE/DEAD○RKit试剂盒检测软骨细胞的活力和细胞增殖;通过组织化学甲苯胺蓝特异性染色检测细胞外基质的形成变化。结果单层培养3代之前软骨细胞能保持正常的组织学形态,三维培养能使去分化的4代软骨细胞逐渐恢复并持续维持正常的软骨组织表型。单层培养的软骨细胞的4代以前的细胞活力保持在90%左右,第4代以后开始下降;三维培养的软骨细胞活力都保持在90%以上。在细胞增殖率方面,单层培养6代软骨细胞(28d)总的倍增率是同期三维培养的44倍。单层培养的软骨细胞4代之后,其细胞外基质平均染色强度降低(P<0.05);三维培养21d和28d后的软骨细胞外基质表达强度与7d时相比升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论先通过单层培养使软骨细胞适宜扩增,然后将其转入水凝胶中三维培养恢复退变的软骨组织表型,可达到既扩增自体软骨细胞数目同时又保持正常组织表型的目的,两步培养法是一种较理想的软骨细胞培养方法。

肝癌患者脂肪干细胞重编程为诱导多潜能干细胞

目的重编程肝癌患者来源的脂肪干细胞为诱导多潜能干细胞。方法包装携带Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因的反转录病毒,将病毒感染脂肪干细胞并培养诱导后的细胞,采用碱性磷酸酶染色、定量PCR和原位免疫荧光实验鉴定诱导的克隆样细胞。结果诱导的克隆样细胞表达碱性磷酸酶,定量PCR证实克隆样细胞表达胚胎干细胞多能性基因,免疫荧光实验证实其表达Oct4和Sox2。结论肝癌患者来源的脂肪干细胞可高效重编程为诱导多潜能干细胞,且脂肪干细胞可作为培养诱导多潜能干细胞的滋养细胞,为提高成体细胞重编程效率和建立基于诱导多潜能干细胞的肝癌模型研究提供了平台。

非接触式共培养体系对脐带间充质干细胞向类髓核细胞的诱导分化效应

目的探讨人脐带间充质干细胞向类髓核细胞的分化潜能,为椎间盘退变性疾病的生物学治疗探索新的细胞来源。方法取人正常足月产婴儿脐带及成人椎间盘,分离消化华通胶组织和髓核组织,收集培养脐带间充质干细胞及成人髓核细胞。利用带有插入层的Transwell 6孔培养板进行细胞非接触式共培养,细胞比例为1∶1,以脐带间充质干细胞单独培养作为对照组。共培养1周后,提取脐带间充质干细胞总RNA,利用Real-Time PCR检测其Ⅱ型胶原、蛋白多糖及SOX9基因的相对表达改变。结果成功分离提取脐带间充质干细胞;Real-Time PCR检测结果显示实验组脐带间充质干细胞Ⅱ型胶原、蛋白多糖和SOX9基因相对表达较对照组显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论人脐带间充质干细胞能够被髓核细胞诱导分化为类髓核细胞,有可能为椎间盘退变性疾病的生物学治疗提供一种新的细胞来源。

RA和SHH体外联合诱导骨髓基质干细胞转化为神经细胞

目的研究体外使用全反式维甲酸(RA)和音猬因子(SHH)联合诱导人骨髓基质干细胞(BMSCs)转化为神经细胞的可行性。方法从健康志愿者髂骨处抽取骨髓5ml,体外分离、纯化、扩增到第三代后分别接种于A组[RA0.5μg/ml]、B组[SHH500ng/ml+碱性成纤维生长因子-8(FGF-8)100ng/ml]和C组[RA0.5μg/ml+SHH500ng/ml+FGF-8100ng/ml]诱导液中,诱导BMSCs分化为神经样细胞。使用倒置相差显微镜及免疫荧光技术观察诱导前后细胞改变。结果诱导7d后,各组均有部分BMSCs胞体收缩,折光性增强,突起伸出,表现出神经细胞的形态。免疫荧光表现神经元烯醇化酶(NSE)、微管相关蛋白(MAP-2)和β微管蛋白(β-tubulin)阳性。C组的各种分化细胞数均高于A组和B组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论SHH联合RA可以在体外有效诱导人BMSCs转化为神经细胞,两者之间具有协同作用。

牙髓干细胞的研究进展

牙髓干细胞是牙髓组织中具有高度增殖、自我更新的能力并可多向分化的一类成体干细胞,在牙髓修复和牙齿再生以及骨组织工程相关研究中发挥重要作用。本文就牙髓干细胞的研究现状作一综述,并讨论其应用前景以及目前存在的问题。

不同冻融条件对同种异体面神经许旺细胞活性的影响

目的探索一种可简单准确地调控离体面神经许旺细胞(SchwannCells,SC)活性的方法并观察含不同活性SC的面神经在同种异体移植中的效果。方法(1)将动物分为新鲜神经组(F组)、冻融一次组(FTⅠ组)和冻融五次组(FTⅤ组),定量测定冻融法对面神经SC活性的影响,每组3条面神经用钙黄绿素-乙酰羟甲基酯(Calcein-AM)染色,以共聚焦显微镜测定荧光强度,反映SC活性。(2)每组9只大鼠接受单侧同种异体面神经移植,术后2、4、8周各取3只大鼠的面神经移植物中段行髓鞘锇酸染色,观察轴突再生情况。结果平均荧光强度:F组为140.93±17.55/μm2,FTⅠ组56.99±7.10/μm2,FTⅤ组28.46±4.11/μm2;术后第8周F组、FTⅠ组和FTⅤ组中段的轴突计数分别为225±41、357±76和303±51;术后第8周,FTⅠ组神经新生轴突分布较FTⅤ组和F组更为均匀,髓鞘厚度和轴突横截面积更大,髓鞘更为成熟。结论快速冻融法可以有效和准确地调控面神经SC的活性,冻融一次可以将神经SC活性降低到新鲜面神经的40%,而反复冻融五次可降低到20%;调控SC的数目可能影响同种异体面神经移植的效果。

三磷酸胞苷二钠对局灶性脑缺血大鼠海马CA3区脑源性神经生长因子表达的影响

目的:观察三磷酸胞苷二钠(CTP)对缺血神经元修复、再生及结构重建的影响及其作用机制。方法:实验于2002-03/10在河北医科大学组胚教研室及河北医科大学第三医院中心实验室进行。选取SD大鼠60只,随机分为脑缺血自然恢复组、药物干预组和假手术对照组,每组20只。采用线栓法建立大脑中动脉脑缺血大鼠模型,药物干预组大鼠术后立即将三磷酸胞苷二钠(70mg/kg体质量)经1mL生理盐水溶解后给予腹腔注射,此后以相同剂量每日一次腹腔注射;自然恢复组及假手术组大鼠给予生理盐水1mL每日一次腹腔注射,分别于术后7、14、21及30d时各取5只大鼠处死,应用苏木精-伊红染色、免疫组化技术观察海马CA3区脑源性神经生长因子的表达,比较各组脑缺血后脑源性神经生长因子阳性细胞吸光度值。结果:实验选取的各组大鼠全部进入结果分析。①各组大鼠脑缺血后细胞形态观察结果:假手术组大鼠顶叶及海马区神经元排列整齐,形态完整,细胞数量较多,细胞核圆大且核仁明显。缺血组可见梗死灶,表现为正常结构消失,排列紊乱,细胞数量减少,胞核浓缩呈梭形或三角形,细胞质深染。②免疫组化染色及图像分析结果:光镜下观察,假手术组海马CA3区脑源性神经生长因子免疫组化染色阳性细胞神经元的胞浆内充满弥漫性的棕黄色颗粒,但其表达数量较少、染色较浅,自然恢复组脑源性神经生长因子表达与假手术组相比逐渐增多,第21天时达到高峰,并且免疫反应产物染色较深,部分神经元可见长的轴突,三磷酸胞苷二钠干预组脑源性神经生长因子阳性表达同自然恢复组相比均明显增加。③脑缺血后各组脑源性神经生长因子阳性细胞吸光度值的比较:与假手术组相比,自然恢复组脑源性神经生长因子吸光度值明显升高且差异有显著性(P<0.01),与自然恢复组相比,三磷酸胞苷二钠干预组各时间点吸光度值均升高,而且7d和14d时同自然恢复组比较差异有显著性(P<0.01)。结论:脑缺血损伤可诱导海马CA3区脑源性神经生长因子表达增多。三磷酸胞苷二钠可上调脑缺血后脑源性神经生长因子的表达,具有促进缺血神经元的修复、再生及结构重建的作用。

GDF15对成血管和成骨/破骨作用的影响及机制的研究进展

生长分化因子15作为转化生长因子-β超家族中的一员,在人体组织中广泛表达。GDF15可被多种因素(比如缺氧、炎症、射线、急性损伤或癌变)诱导表达,通过SMAD通路和非SMAD通路发挥作用。最新的研究表明,在不同微环境下,GDF15对于血管生成,骨代谢具有不同的调节作用。本文就GDF15在不同生物背景下对成骨/成血管作用的影响及其相关信号通路作一综述。

bFGF-胶原蛋白缓释系统促进兔下颌骨缺损修复的研究

目的观察评估bFGF-胶原蛋白缓释系统作为骨修复材料的可能性。方法 60只日本大耳白兔随机分成3组:bFGF胶原海绵组,胶原海绵组及空白对照组。手术建立兔双侧下颌骨洞穿性骨缺损模型并植入相应生物材料。分别在2、6、8、12周对造模部位取材,行大体观察、CT影像学检测和组织学观察。结果大体观察和CT影像学检测显示实验组骨创愈合速度较快。组织学观察可见实验组成骨情况优于同期对照组,胶原蛋白在体内作用时间持续至6周以前,其持续释放的bFGF颗粒对骨缺损修复有明显的促进作用,但发挥作用时间主要在12周前。结论 bFGF-胶原蛋白缓释系统对兔下颌骨缺损具有良好的修复效果,其发挥作用时间主要在骨缺损修复早期。此外,胶原蛋白海绵本身对骨缺损修复早期亦具有一定促进作用。

自撑式石墨烯水凝胶诱导人脂肪干细胞成骨分化的体外研究

目的通过体外实验评价本课题组制备的自撑式石墨烯水凝胶(self-sustaining graphene hydrogel,SGH)的骨诱导性能。方法 (1)将人脂肪干细胞(hADSC)接种于SGH和玻片表面,采用荧光显微镜图像计数检测ADSC在材料表面粘附能力;通过扫描电镜观察材料本身的表征及细胞在SGH表面生长的形态;(2)SGH组加入普通培养液作为实验组,玻片组加入成骨培养基作为诱导组,玻片组加入普通培养液作为对照;通过实时定量荧光PCR、ALP活性检测和茜素红半定量测定钙沉积评价各组hADSC的分化及成骨能力。结果 hADSC能以等同于在玻片表面的粘附效率和正常的形态在SGH表面生长。实验组细胞在不同时间点成骨相关基因的表达水平、ALP活性以及钙盐沉积量均显著高于对照组而略低于诱导组(P<0.05)。结论自撑式石墨烯水凝胶作为一种生物相容性材料,具有较强的诱导人脂肪干细胞成骨分化的能力。