长期高海拔暴露对大鼠不同肠段肠道菌群组成的影响

目的探讨长期高海拔暴露对大鼠不同肠段肠道菌群组成和结构的影响,并对其关键受影响肠段进行初步探索。方法将6周龄SD大鼠随机分为对照组(Control组)与高原暴露组(HA组)。HA组暴露于模拟海拔3500~4000 m的低压氧舱中20周。20周后使用高通量16s rRNA测序对两组大鼠进行微生物组分析,并确定十二指肠、空肠、回肠与结肠菌群群落的核心变化。结果高原缺氧环境下,结肠微生物丰富度显著降低,前肠微生物丰富度和多样性无明显变化,结肠的AVD值高于其他肠段,且在高原长期暴露处理后趋向更稳定;在Bray-curtis距离下,回肠与结肠的菌群结构在Control组与HA组之间有显著差异,而十二指肠和空肠则无显著变化;所有肠段的主要菌门为厚壁菌门(Firmicutes),但优势菌属在不同肠段和处理组中有所不同,其中乳杆菌属对菌群变化有较高贡献;回肠的菌属互作网络复杂度高于其他肠段,而结肠的菌属互作关系最少;空肠与回肠主要由丰富类群组成,而结肠的丰富类群占比明显减少,主要为条件稀有类群。十二指肠在Control组与HA组中类群组成有所差异。结论高原长期暴露显著重塑了大鼠回肠及结肠中的肠道菌群组成和结构,尤其是回肠的菌群变化最为明显。回肠的菌群结构在高原缺氧条件下表现出较低的复杂度和关键菌属的突出作用,尤其是乳杆菌属的变化,暗示其具有较高的研究价值。

Fam172a基因敲除活化ERK通路加重肝细胞脂毒性损伤的研究

目的初步探讨Fam172a基因敲除加重脂毒性肝细胞损伤的作用机制。方法利用Fam172a基因敲除(Fam172a^(-/-))小鼠,检测肝功能、肝组织脂质堆积和炎症细胞因子水平。利用Fam172a基因敲减的HepG2细胞系,检测细胞内脂质堆积和炎症细胞因子水平。蛋白质印迹检测蛋白质水平。结果与对照组相比,Fam172a^(-/-)小鼠血浆ALT和AST水平明显升高;肝脏结构损伤、脂质堆积和炎症加重;pERK/ERK相对表达水平显著上调。Fam172a基因敲减后,HepG2细胞内甘油三酯含量和炎症细胞因子水平增加,且pERK/ERK相对表达水平也显著升高。然而,应用ERK抑制剂后可明显减轻Fam172a基因敲减造成的脂毒性肝细胞损伤。结论Fam172a基因敲除可通过活化ERK加重肝细胞脂毒性。

香烟烟雾提取物对破骨细胞体积及整合素αvβ3基因表达的影响

目的探讨香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)对破骨细胞体积及整合素αvβ3基因表达的影响。方法首先制作CSE溶液,实验采用7周龄C57BL/6J小鼠骨髓单个核细胞加入M-CSF和RANKL诱导生成破骨细胞,将浓度为5%的CSE加入实验组破骨细胞作用3 d,对照组不加入CSE。通过Trap染色识别对照组和实验组破骨细胞并于光镜下采图;通过甲苯胺蓝染色识别两组破骨细胞在骨片上形成的骨陷窝并于光镜下采图,均用NIH imageJ计算数量及面积。用实时荧光定量聚合酶链反应,以GAPDH作为内参,最后通过2-ΔΔCT计算,以检测Trap、CTR以及整合素αvβ3 mRNA表达水平。通过Western blot检测整合素αvβ3蛋白表达。结果破骨细胞表面积及细胞核数量的计量表明,实验组诱导形成的破骨细胞显著大于对照组(P<0.01)。实验组骨片上吸收陷窝数量及面积明显多于对照组(P<0.05),CSE处理组的TRAP mRNA水平为1.16±0.13,明显高于对照组(P<0.05),CTRmRNA水平为0.38±0.04,明显低于对照组(P<0.01)。CSE处理组的整合素αvβ3mRNA水平为1.75±0.05,显著高于对照组(P<0.01),蛋白质印迹分析结果也明显高于对照组(P<0.05)。结论CSE能显著增加破骨细胞的体积并上调整合素αvβ3的基因表达,并可能对骨吸收有促进作用。

汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑的影响及机制探讨

目的探究汉防己甲素对支气管哮喘小鼠气道重塑及高迁移率族蛋白B1(HMGB1)/Toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法构建支气管哮喘小鼠模型,将建模成功的40只小鼠随机分为模型组,汉防己甲素低(20 mg/kg)、高(40 mg/kg)剂量组和地塞米松(10 mg/kg)组,每组10只。另取10只小鼠不建模作为对照组。各组小鼠给予相应干预2周。ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-1β水平;苏木素-伊红染色观察肺组织病理学变化并进行肺损伤评分;测定小鼠支气管管壁厚度和支气管平滑肌厚度;荧光定量PCR(qPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测肺组织HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平。结果对照组小鼠肺组织支气管无病理损伤。与对照组相比,模型组小鼠支气管管壁及平滑肌增厚,黏膜上皮增生、皱襞增多,管腔缩小,气管内黏液渗出明显;血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,肺损伤评分,支气管管壁及支气管平滑肌厚度,HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。与模型组相比,汉防己甲素低、高剂量组小鼠肺组织病变程度逐渐减轻,血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平,肺损伤评分,支气管管壁及支气管平滑肌厚度,HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA和蛋白表达水平依次降低(P<0.05);汉防己甲素高剂量组和地塞米松组小鼠各项指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论汉防己甲素可减轻支气管哮喘小鼠气道重塑程度和炎性因子水平,保护肺组织,其机制可能与抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路有关。

高强度间歇运动改善骨骼肌损伤和提高大鼠运动能力的机制

背景:高强度间歇运动增强机体适应性,提高运动表现,其潜在机制可能与骨骼肌内腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的磷酸化水平有关。目的:明确高强度间歇运动减轻力竭运动诱导的骨骼肌损伤与提高运动能力的作用,并阐明此过程中AMPK介导葡萄糖转运蛋白4的变化与作用机制。方法:取45只雄性SD大鼠,采用随机数字表法分为对照组、力竭运动组、高强度间歇+力竭运动组,每组15只。对照组大鼠不进行任何干预;力竭运动组大鼠以25-28 m/min的速度在跑台上运动至力竭;高强度间歇+力竭运动组进行3 d的高强度间歇运动训练(每天以28 m/min的速度在跑台上运动4次,每次10 min,穿插10 min休息),高强度间歇运动结束后24 h复制力竭运动模型;记录大鼠运动距离。力竭运动后,检测各组大鼠血浆肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平,TUNEL染色与Western Blot检测腓肠肌细胞凋亡情况,Western Blot检测腓肠肌组织内AMPK磷酸化水平,免疫荧光染色与Western Blot检测腓肠肌组织内葡萄糖转运蛋白4表达与易位情况。结果与结论:①高强度间歇+力竭运动组大鼠的运动距离大于力竭运动组(P<0.05);与对照组比较,力竭运动组肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平升高(P<0.05);与力竭运动组比较,高强度间歇+力竭运动组肌酸激酶、超氧化物歧化酶水平降低(P<0.05);②TUNEL染色与Western Blot检测显示,力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率大于对照组(P<0.05),高强度间歇+力竭运动组腓肠肌细胞凋亡率小于竭运动组(P<0.05),3组间凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2表达无差异(P>0.05);③Western Blot检测显示,与对照组比较,力竭运动组AMPK和p-AMPK蛋白表达升高(P<0.05);与力竭运动组比较,高强度间歇+力竭运动组AMPK蛋白表达降低(P<0.05),p-AMPK蛋白表达升高(P<0.05);④免疫荧光染色与Western Blot检测显示,与对照组相比,力竭运动组骨骼肌纤维的细胞膜葡萄糖转运蛋白4表达增多,高强度间歇+力竭运动组骨骼肌纤维的质膜葡萄糖转运蛋白4表达增多;⑤结果显示,高强度间歇运动减轻力竭运动引起的肌纤维损伤,通过提高运动中AMPK磷酸化的水平与效率,促进骨骼肌中葡萄糖转运蛋白4的表达与易位,提高大鼠运动能力。

丁酸通过激活G蛋白偶联受体41/43通路降低高血压大鼠血压

目的探讨丁酸通过激活G蛋白偶联受体41/43(GPR41/43)通路降低高血压模型大鼠血压的机制。方法75只雄性SD大鼠随机分为假手术组(15只)和造模组(60只),采用两肾一夹方法建立高血压大鼠模型,将成模鼠随机分为对照组(超纯水0.1 mL/kg)、丁酸高剂量组(220 mg/kg)、丁酸低剂量组(110 mg/kg)和缬沙坦组(30 mg/kg),每组15只,连续灌胃给药4周。分别在给药前后测量大鼠尾动脉收缩压(SBP)及心率(HR)。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量;实时荧光定量PCR(qPCR)检测大鼠胸主动脉组织中IL-6、TNF-α、eNOS的mRNA表达水平。免疫组织化学染色检测大鼠胸主动脉GPR41/43表达量。结果给药2周,对照组大鼠SBP较假手术组显著升高(P<0.05),丁酸高剂量组、丁酸低剂量组、缬沙坦组SBP较对照组降低,且丁酸高剂量组低于低剂量组(P<0.05)。给药4周,丁酸高剂量组较丁酸低剂量组SBP明显降低(P<0.05);给药前后各组大鼠HR差异均无统计学意义(P>0.05)。给药后丁酸高剂量组、丁酸低剂量组eNOS蛋白和mRNA表达量较对照组增加,IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表达量均降低(P<0.05)。免疫组织化学染色显示,大鼠胸主动脉组织的GPR41/43表达较对照组增加,且高于缬沙坦组(P<0.05)。结论丁酸对高血压大鼠有明显的降压作用,可能与激活GPR41/43通路增加血管舒张,抑制炎性因子表达有关。

肌苷对脂多糖诱导的急性肺损伤大鼠的肺保护作用及机制探讨

目的探讨肌苷对急性肺损伤(ALI)大鼠的肺保护作用及其相关机制。方法20只SD大鼠随机分为4组:空白(NC)组、模型(LPS)组、肌苷低剂量干预(IN-L)组、肌苷高剂量干预(IN-H)组,每组5只。气管内滴入脂多糖(LPS)完成建模的大鼠在1、6、12 h后采用腹腔注射法给予100 mg/kg肌苷(IN-L组),200 mg/kg肌苷(IN-H组)和生理盐水(LPS组)。NC组在建模和干预阶段均使用等体积生理盐水。在诱导ALI 24 h后采集动脉血测定氧分压(PaO2);取肺组织,计算湿/干质量比(W/D)并进行病理检查;取血清和支气管肺泡灌洗液(BALF)测定多聚ADP核糖聚合酶(PARP)-1、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β含量。制备肺组织匀浆,检测Toll样受体4(TLR4)、髓样分化蛋白88(MYD88)、核因子κB(NF-κB)蛋白表达。结果LPS诱导大鼠肺组织损伤,造成严重的低氧血症,PARP-1、iNOS水平升高,促进炎性因子TNF-α和IL-1β分泌,肺组织中TLR4、MYD88、p-NF-κB p65蛋白表达上调(P<0.05)。肌苷干预后可使肺组织TLR4、MYD88和p-NF-κB p65蛋白表达下降,PARP-1、iNOS、TNF-α和IL-1β的产生减少,肺组织损伤程度减轻,大鼠低氧血症得到改善(P<0.05)。IN-H组上述改变较IN-L组更加明显(均P<0.05)。结论肌苷可减轻LPS诱导的肺部炎症,减少炎性细胞因子的产生,其机制可能与肌苷下调TLR4/MYD88/NF-κB信号通路,抑制PARP-1活性,减少NF-κB核易位有关。

Wnt/β-catenin通路与NF-kB通路的交叉调控对间充质干细胞分化的影响

Wnt/β-catenin信号通路与NF-kB信号通路都是高度保守的通路,调节多种生物学过程,二者之间的交叉影响已在多个生物和医学研究领域引起重视。该文将就Wnt/β-catenin信号通路与NF-kB信号通路的相互作用及对间充质干细胞多向分化的影响进行综述。

细胞色素P450CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢动力学的影响

目的研究细胞色素P450CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢动力学的影响。方法用基因芯片对137名健康志愿者进行CYP2C9基因多态性检测,将受试者分为CYP2C9野生型、杂合突变型和纯合突变型3组,用高效液相色谱法检测甲苯磺丁脲在受试者体内的药物代谢动力学参数,统计分析各组间药代动力学性质差异。结果在137名受试者中发现了9个CYP2C91/3杂合型突变体和1个CYP2C93/3纯合型突变体,其余为野生型个体。将9名CYP2C91/3,1名CYP2C93/3以及随机抽取的10名野生型个体分组,以甲苯磺丁脲为探药进行药物代谢动力学研究。结果在杂合型突变个体组以及纯合型突变个体组中,甲苯磺丁脲的代谢率显著低于对照的野生型个体组。结论CYP2C9基因多态性对甲苯磺丁脲代谢具有显著影响并呈基因剂量效应,检测突变型个体对指导临床合理用药和个体化医疗具有重要意义。

Kartagener综合征合并分泌性中耳炎患者的基因诊断

目的应用基因筛查技术进行kartagener综合征合并慢性分泌性中耳炎患者的基因诊断。方法将2010年1月至2013年12月就诊于解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科的8例kartagener综合征合并慢性分泌性中耳炎患者作为研究对象。采集病史、绘制家系图,进行纯音测听、声导纳检查;应用sanger测序进行热点基因筛查,并对1例患者及其父母应用全外显子组测序进行基因筛查,应用Pomol软件对候选基因编码蛋白进行3D-蛋白结构模拟。结果 8例患者均伴有慢性分泌性中耳炎。应用sanger测序进行热点基因筛查的患者,均未发现所筛查位点基因突变;应用全外显子组测序的1例患者发现c.8030G>A(p.R2677Q)突变,位于基因DNAH5。结论慢性分泌性中耳炎患者应考虑kartagener综合征的可能性,以免漏诊误诊,基因筛查为该病提供了分子遗传学诊断证据。

遗传性耳聋家庭康复与预防模式的探讨

目的通过耳聋产前诊断对先证者为人工耳蜗植入者的遗传性耳聋家庭的生育指导，探讨遗传性耳聋家庭康复与预防的理想模式。方法58个耳聋家庭参与了此研究，这些耳聋家庭均育有一子，为先天性耳聋患者并植入了人工耳蜗，父母均为听力正常者，计划生育听力健康后代。先证者接受详细的体格检查、听力学及影像学检查后，先证者及其父母均采集外周血并提取DNA，进行GJB2序列分析、SLC26A4常见突变外显子分析和线粒体基因（mtDNA）12SrRNA检测，明确了分子病因和后代再发风险。接受产前诊断时，母亲妊娠11，26周，根据母亲的妊娠时间，行适当的产前诊断取材并提取胎儿DNA，测定胎儿基因型，预测胎儿听力状态。结果35个耳聋家庭的先证者为GJB2纯合或复合突变，父母均为GJB2突变携带者；23个耳聋家庭的先证者为SLC26A4纯合或复合突变，父母均为SLC26A4突变携带者。此58个耳聋家庭再发风险均为25％，共行产前诊断64例次（6个家庭母亲怀孕2次，进行了2次产前诊断），44例次检测结果显示胎儿仅携带一个父系或母系突变，或未携带任何已知突变，随访胎儿出生后听力均正常；20例次检测结果显示胎儿与先证者基因型相同，父母自愿选择终止妊娠。结论对于分子病因明确的遗传性耳聋家庭，先证者接受人工耳蜗植入获得最佳听力语言康复效果，再生育时通过耳聋基因诊断结合产前诊断预防聋儿出生，是最理想的耳聋康复与预防模式。

北京地区耳聋残疾人群大前庭水管相关SLC26A4基因热点突变分子流行病学调查

目的分析北京耳聋残疾人群中SLC26A4基因热点突变IVS7-2A>G和2168A>G发生频率,初步探讨SLC26A4基因热点突变在北京地区耳聋残疾人群中的分子诊断意义。方法抽查北京地区持耳聋残疾证患者6247例,均抽取外周静脉血并提取DNA,以博奥生物有限公司提供的晶芯九项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片)对SLC26A4基因的热点突变IVS7-2A>G和2168A>G进行检测,并对其发生频率进行分析。结果在6247名受检耳聋残疾人群中,携带SLC26A4基因IVS7-2A>G和2168A>G突变的例数共计177例,总阳性检出率为2.83%(177/6247)。IVS7-2A>G突变携带者141例(纯合27例,单杂合突变114例),2168A>G突变携带者26例(纯合4例,单杂合突变22例),SLC26A4基因2168A>G/IVS7-2A>G复合杂合突变携带者10例。针对IVS7-2A>G和2168A>G突变的SLC26A4基因双等位基因突变例数为41例,双等位基因突变率为0.66%(41/6247)。结论 1、在6247例耳聋残疾人中,通过SLC26A4基因热点突变IVS7-2A>G和2168A>G检测能够明确分子学诊断的占总体的0.46%(41/6247);2、在北京地区持证聋人群体中,SLC26A4基因热点突变检出率较我院门诊就诊的耳聋患者低,此项课题的开展,有助于了解北京地区残疾人群中与大前庭水管综合征密切相关的SLC26A4基因热点突变分布情况,在分子水平上为耳聋残疾人群明确诊断或指导进一步诊断,并对IVS7-2A>G和2168A>G突变检测阳性患者的婚配、生育具有一定的指导意义。

日本脑炎病毒非结构蛋白NS5对IFN-α介导的信号转导通路的抑制作用

目的探讨日本脑炎病毒抑制IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路过程中发挥关键作用的病毒特异蛋白,为阐明日本脑炎病毒抑制Ⅰ型IFN介导的JAK-STAT信号转导通路的作用机制奠定基础。方法分别构建日本脑炎病毒编码的7种非结构蛋白基因(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)的重组真核表达载体。采用间接免疫荧光法和Western blotting观察它们在细胞内的表达及定位情况。利用含萤火虫荧光素酶(Luc)报告基因的重组载体pISRE-Luc,观察表达病毒不同非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的JAK-STAT信号转导通路的活化程度。构建融合表达红色荧光蛋白的STAT1重组真核表达载体pRed-STAT1,利用该重组载体在表达病毒非结构蛋白的细胞内观察融合蛋白Red-STAT1在IFN-α作用下的细胞内定位情况。同时,对表达病毒非结构蛋白的细胞内IFN-α介导的STAT1分子的磷酸化水平进行检测。结果日本脑炎病毒的7种非结构蛋白均可在哺乳动物细胞内正确表达,而且表达蛋白均位于细胞质中。在这7种非结构蛋白中,NS5可阻断STAT1分子的核转运及抑制STAT1分子的磷酸化水平,从而抑制IFN-α介导的细胞内JAK-STAT信号转导通路的活化。结论日本脑炎病毒的非结构蛋白NS5对Ⅰ型IFN系统的信号转导通路具有显著的抑制作用,可能是一种Ⅰ型IFN系统的拮抗蛋白。

Smad3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究

目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)信号转导通路下游信号分子Smad2、Smad3在TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)成骨分化中的作用。方法采用RT-PCR、Western blot检测TGF-β1促MSCs成骨分化过程中Smad2、Smad3mRNA和蛋白表达的变化;脂质体介导稳定转染Smad3ΔC,间接免疫荧光试验鉴定;采用RT-PCR检测转染细胞中碱性磷酸酶(ALP)和核心结合因子(cbfa1)mRNA的表达,用对硝基苯磷酸盐(PNP)法检测细胞ALP活性,用茜素红染色法检测细胞矿化能力,观察Smad3ΔC对MSCs成骨分化的影响。结果在TGF-β1刺激后24h,MSCs中Smad3的mRNA和蛋白表达量明显减少(P<0.01),而整个刺激过程中,Smad2的mRNA和蛋白表达量无明显变化(P>0.05);稳定转染细胞中c-Myc抗原阳性表达;受TGF-β1刺激后,MSCs和V-MSCs(空载体转染组)中ALP、cbfa1mRNA的表达水平、矿化能力明显高于Smad3ΔC-MSCs;随TGF-β1刺激时间延长,Smad3ΔC-MSCs中ALP活性增加缓慢,仅于48h有明显增加(P<0.05),但与同时段MSCs和V-MSCs中ALP活性相比,差异有极显著性意义(P<0.01)。结论TGF-β1促进MSCs成骨分化这一生物学效应的输出受Smad3特异性和选择性的调节。

鼠尾静脉流体力学转染技术对绿色荧光蛋白表达质粒器官靶向分布的影响

目的:观察流体力学尾静脉注射对绿色荧光蛋白基因器官靶向性的影响,为今后质粒载体的基因治疗和功能研究寻找潜在的靶器官。方法:实验于2005-12/2006-04在江西省分子医学重点实验室完成。选用健康雄性昆明鼠40只,将32只小鼠按随机数字表法分为流体力学注射和常规注射两大组,每大组再分为转染组和对照组两个小组(n=8),并设正常对照组(n=8)。①流体力学转染组将100μg/只绿色荧光蛋白表达质粒溶液2mL在5s内快速注入尾静脉;对照组仅在5s内注入林格氏液2mL。②常规注射组则将2mL林格氏液或绿色荧光蛋白表达质粒溶液在30s左右注入尾静脉。注射结束后24h采集各组小鼠血清检测转氨酶,并采集肝、脾、心、肾、肺和脑组织进行冰冻切片,部分肝组织采用多聚甲醛固定后切片,荧光显微镜下观察。结果:40只小鼠全部进入结果分析,无脱失。①流体力学注射组和常规注射组小鼠血清转氨酶与正常对照组比较差异均无显著性意义(P>0.05)。②常规尾静脉注射引起少数肾小球细胞表达绿色荧光蛋白,而肝、脾、心、肺及脑等组织未见明显绿色荧光蛋白表达。③流体力学注射引起肝内绿色荧光蛋白高水平表达,肝细胞表达率接近45%,其他组织则无绿色荧光蛋白表达。结论:流体力学方法是肝靶向性的活体基因转染方法,绿色荧光蛋白可作为该方法进行目的基因研究的一个可靠和方便的示踪剂。

重庆市永川地区青少年耳聋患者耳聋基因热点突变筛查分析

目的筛查重庆市永川地区非综合征型青少年耳聋患者中我国耳聋基因热点突变,初步了解该地区耳聋基因热点突变谱系及发生频率。方法收集重庆市永川区特殊教育学校的永川籍非综合征型青少年耳聋患者60例,经监护人知情同意,抽取外周静脉全血并提取基因组DNA,应用晶芯R九项遗传性耳聋检测试剂盒(微阵列芯片)检测中国人群中常见的4个耳聋基因的9个突变位点,包括GJB2(235delC、176del16、299delAT和35delG)、SLC26A4(IVS7-2A>G、2168A>G)、线粒体12SrRNA(1494C>T、1555A>G)、GJB3(538C>T)。结果 60例受检者全部为重度或极重度非综合征型耳聋,共检出耳聋基因突变22例,其中GJB2235delC纯合突变型2例;GJB2235delC/176del16复合杂合突变型1例;GJB2235delC/299delAT复合杂合突变型1例;GJB2235delC杂合突变型8例;GJB2299delAT纯合突变型1例;GJB235delG/SLC26A4IVS7-2A>G复合杂合突变型1例;SLC26A4IVS7-2A>G杂合突变型2例;线粒体12SrRNA1555A>G均质型突变型6例。60例受检者中47号与55号为亲兄妹,后续统计仅纳入先证者,所以只将47号纳入统计,样本总量计为59例。59例耳聋患者中我国耳聋基因热点突变的携带率是37.29%(22/59),其中GJB2基因突变是该人群首要的致病因素,携带率为23.73%(14/59),线粒体12SrRNA基因突变检出率为10.17%(6/59),高于SLC26A4基因的5.08%(3/59),未检出GJB3基因突变。结论重庆市永川地区非综合征型青少年耳聋患者耳聋基因突变携带率较高,对该地区耳聋患者及高危人群进行耳聋基因突变的筛查是防控永川地区遗传性耳聋的首要步骤,在此基因诊断的基础上再结合用药指导、产前诊断、临床干预可有效减少该地区耳聋的发生。

TAT-N24穿膜融合多肽的表达与鉴定

目的表达并纯化TAT-N24穿膜融合多肽,初步探讨其生物学活性。方法构建pTAT-HA-N24原核表达载体,在BL21大肠埃希菌中表达并纯化TAT-N24融合多肽,利用SDS凝胶电泳检测纯化蛋白的纯度,利用免疫细胞化学和流式细胞术检测TAT-N24融合蛋白的穿膜能力和生物学活性。结果在原核表达系统中成功构建并表达纯化了TAT-N24穿膜融合多肽,其在6 mol/L尿素和DMSO中均具有较好的溶解性,纯化的融合多肽经SDS凝胶电泳分析未见明显杂蛋白混入,利用免疫细胞化学染色可见TAT-N24处理结肠HT29细胞12 h后90%以上的细胞中可检测到TAT-N24,流式细胞术检测细胞周期可见TAT-N24能够有效地诱导细胞周期阻滞,抑制结肠癌细胞生长。结论TAT-N24具有高效的穿膜能力,并能有效抑制结肠癌细胞增殖,可望开发成为有效的肿瘤分子治疗药物。

GJB2基因听力学表型与基因型关系分析

目的分析GJB2基因的听力学表型与基因型关系。方法2007年4月-2011年3月在解放军总医院就诊的具有完整听力学资料的1481名非综合征性耳聋患者，均进行GJB2编码区测序，并对其GJB2基因突变检出阳性率及与听力学表型关系进行统计学分析。结果1481例患者GJB2基因阳性突变率为20．05％，双耳感音神经性聋组阳性突变率为20．66％，高于单耳耳聋组（2．08％）（P〈0．01）。在双耳感音神经性聋组中，极重度聋组中的GJB2阳性检出率最高（26．07％），其次是重度（18．12％）、中度（17．4％），轻度组为11．54％，各组间阳性检出率差异有统计学意义（P〈0．01）。对297例GJB2基因突变阳性患者听力曲线分型分析中，发现了10例上升型听力曲线（14．93％），但GJB2耳聋听力图仍以残余型（26．27％）、平坦型（25．16％）常见，各组阳性检出率差异有统计学意义（P〈0．01）。结论GJB2基因突变者听力学表型呈多样性，在进行基因检测时，除重视双耳重度、极重度感音神经性聋或听力图为残余型和平坦型的人群外，也应该对单耳耳聋、双耳轻度听力损失或听力图为上升型感音神经性聋患者进行常规耳聋基因检测。

某航校飞行学员高频听力损失研究

目的跟踪某航校飞行学员人群连续两年的高频听力变化,根据结果判断其变化趋势并进行基因组学筛查,探讨mtDNA4977缺失与噪声性听力损失关系。方法随机抽取某航校2009级140名飞行学员进行听力学检测,连续跟踪调研两年,着重观察个体两年间左右耳高频频段4000、6000、8000Hz之间的听阈值及高频听力累加值的变化情况,针对筛查出的听力下降学员进行mtDNA4977片段缺失情况诊断,应用SPSS19.0统计软件进行同一人群配对样本T检验以验证是否具有统计学意义,以X2检验进行组间基因缺失频率的比较。结果在调查的飞行学员人群中,两年间右耳4000Hz频段有明显变化(p<0.05),其他各高频频段及高频听力累加值无明显统计学意义(p>0.05)。两组mtD-NA4977缺失率差异有统计学意义(P<0.05)。结论在高年级飞行学员人群中存在噪声性听力损失,携带mtDNA4977缺失基因型的个体对噪声性听力损失易感。

遗传性耳聋相关基因SLC26A4新突变致病性分析

目的验证SLC26A4基因ivs16+10C>T变异与遗传性耳聋的相关性,确定其是否致病。方法我们采集了一个聋-聋婚配家庭中的2例样本(编号7518)、200例大前庭水管散发病例及200例正常听力对照的血液样本及临床资料,分析该变异在人群的携带情况。采用在线软件预测(Fruitfly)及RT-PCR法验证SLC26A4基因ivs16+10C>T变异是否对剪切位点的识别产生影响。结果 SLC26A4 ivs16+10C>T变异在中国人群中携带率低。在200例EVAS散发患者及200例正常人中检测,均未发现携带该变异。Fruitfly结果显示SLC26A4 ivs16+10C>T对剪切位点的识别没有影响,RT-PCR证实SLC26A4编码cDNA长度没有改变。结论 SLC26A4 ivs16+10C>T变异是非致病的核苷酸多态,推测7518家庭的后代不会复制父母的听力。