OmniLog TM微生物鉴定系统在青海高原野生型鼠疫噬菌体宿主谱检测中的应用研究

目的采用两种微量法检测青海高原野生型鼠疫噬菌体的宿主谱,为今后噬菌体生态学研究和基于宿主范围噬菌体分类研究提供科学依据。方法基于OmniLog TM微生物鉴定系统微量法和微量点滴法,检测3株鼠疫噬菌体对2株鼠疫耶尔森菌(鼠疫疫苗株EV 76、614F)和4株非鼠疫耶尔森菌(假结核耶尔森菌PTB3、PTB5、大肠杆菌V517、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2)的裂解情况。结果476号、087号和072204号鼠疫噬菌体均能成功感染鼠疫疫苗株EV 76、614F并依赖其生长繁殖,且基于OmniLog TM系统33℃培养48 h也能够观察到试验孔中四唑类染料颜色随着噬菌体数量的增加和宿主菌数量的减少而变淡。利用微量点滴法检测3株鼠疫噬菌体对4株非鼠疫耶尔森菌敏感性结果显示,28℃和37℃时476号鼠疫噬菌体对假结核耶尔森菌PTB5敏感,而087号和072204号对其不敏感;476号、087号和072204号鼠疫噬菌体对假结核耶尔森菌PTB3、大肠杆菌V517、小肠结肠炎耶尔森菌52302-2这3株非鼠疫耶尔森菌均不敏感,且基于OmniLog TM系统观察到试验孔与对照孔中细菌生长曲线和四唑类染料颜色分别呈现相似对应的结果。然而,以鼠疫疫苗株EV 76、614F为宿主菌,37℃时072204号鼠疫噬菌体微量点滴于固体培养基上不显示噬菌斑。结论基于OmniLog TM检测系统的噬菌体宿主范围测定法可以作为一种替代传统检测宿主谱的测定方法,在噬菌体与宿主菌相互作用研究中具有较好的应用价值。

鼠疫耶尔森菌低钙应答V抗原人源单克隆抗体筛选与鉴定

目的筛选抗低钙应答V抗原(LcrV)的人源单克隆抗体,分析抗体基因特点,检测抗体与抗原结合的特异性、亲和力及功能。方法使用PCR方法从鼠疫疫苗临床试验志愿者外周血细胞cDNA扩增抗体轻、重链可变区基因片段,构建ScFv噬菌体抗体文库。用LcrV对文库进行富集筛选,将获得的抗体基因表达成人IgG1后,测定抗体与LcrV抗原结合的特异性、亲和力、免疫调节功能以及保护能力。结果成功构建了鼠疫耶尔森菌人源ScFv抗体文库,库容量为7.54×10^(8)。抗体文库经LcrV筛选后获得了3株抗LcrV抗体,命名为RV-B4、RV-D1和RV-E8。3株抗体重链为VH1-46和VH3-30,轻链分别为VL1-51、VK3-20和VK1-39。3株抗体经ELISA及Western blot验证均与LcrV特异性结合,其与V抗原结合的解离常数(KD)分别为2.1 nmol/L、1.24 nmol/L和42 nmol/L。RV-D1体外降低人THP-1分泌TNF-α,动物攻毒试验中未发现抗LcrV抗体的保护效果。结论从鼠疫疫苗免疫人群获得了靶向低钙应答V抗原的人源抗体,以结合抗体为主,不能有效阻断病菌感染。所获得的单抗为鼠疫免疫基础研究、鼠疫诊断应用提供了候选材料。

鼠疫菌培养基及培养条件的优化

本试验对鼠疫菌培养基制备过程中涉及鼠疫菌生长的诸因素进行优化并作效果评价,目的在于筛选出适合鼠疫菌生长的优质培养基,从而保证鼠疫防控工作的顺利开展。

不同敏感培养基对鼠疫菌生长作用的效果评价

在赫氏培养基中分别加入4种血液添加剂,按照常规法制成不同的敏感培养基,通过活菌计数方法观察不同血制品添加剂培养基对鼠疫菌生长的作用。对几种敏感培养基的鼠疫菌进行活菌计数,通过统计学秩和检验(F=53.681,P=0.000,P<0.05)发现,由脱纤维绵羊血液和喜马拉雅旱獭血液制成的两种敏感培养基的鼠疫菌生长良好,其生长情况优于脱纤维兔溶血培养基、布氏菌专用血培养基和赫氏普通培养基的鼠疫菌。由脱纤维绵羊血液、喜马拉雅旱獭血液制成的两种敏感培养基是鼠疫菌生长较为理想的培养基。

鼠疫耶尔森菌基因组进化与生态位适应研究

目的 探索鼠疫耶尔森菌基因组进化的基本规律及其与该菌在自然界适应性演化之间的内在联系。方法 对 36株鼠疫耶尔森菌和 7株假结核耶尔森菌进行芯片比较基因组分析 ,鉴定差异区段 (DFR) ,并对 2 6 0株鼠疫耶尔森菌进行PCR验证 ,分析各DFR在这些鼠疫耶尔森菌中的分布 ,同时进行基因组岛分析。结果 在鼠疫耶尔森菌基因组中鉴定出 2 2个DFR ,基于DFR图谱 ,将鼠疫耶尔森菌中国分离株分成 14个基因组型。鼠疫耶尔森菌共有 2 1个基因组岛 ,其中 18个已存在于假结核杆菌中 ,余下 3个为鼠疫耶尔森菌独有。结论 探明了各基因组岛在鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌间的差异分布 ,探究了鼠疫耶尔森菌的起源进化 ;建立了鼠疫耶尔森菌基因组分型系统 ;建立了各基因组型别间的系统发育关系 ,初步揭示了鼠疫耶尔森菌基因组的进化规律及其与鼠疫耶尔森菌生态位适应和鼠疫疫源地扩展之间的关系 。

鼠疫耶尔森菌菌株91001全基因组序列测定及初步分析

目的 测定对人不致病的鼠疫耶尔森菌布氏田鼠疫源地菌株 910 0 1的全基因组序列 ,并通过比较基因组学研究 ,探索鼠疫耶尔森菌致病性的遗传学机制和进化路线。方法 采用全基因组鸟枪法测定 910 0 1菌株的全基因组序列 ,利用比较基因组方法对 910 0 1与另外 2株鼠疫耶尔森菌(CO92和KIM)的全基因组进行比较研究。结果 910 0 1菌株的基因组包括 1条染色体和 4个质粒 (pPCP1、pCD1、pMT1和pCRY)。pPCP1质粒长度为 96 0 9bp,与参考菌株基本一致 ;pCD1质粒是编码Ⅲ型分泌系统的质粒 ,长度为70 15 9bp,编码情况与参考菌株基本相同 ,但重排导致了质粒的结构与参考菌株存在差异 ;pMT1质粒长度为10 6 6 4 2bp,保留了较多的原始质粒片段 ,毒力相关基因与参考菌株没有差异 ;pCRY质粒是本研究中新发现的质粒 ,在国内外研究中未曾报道 ,这一质粒长度为2 174 2bp ,具有独立复制能力 ,有一群编码Ⅳ型分泌系统的基因。 910 0 1菌株的染色体长度为4 5 95 0 6 5bp,有 4 0 37个编码序列 (CDS) ,其中 14 1个是假基因 ;染色体中存在着非常丰富的插入序列 ,由于存在IS序列介导的基因组重排 ,910 0 1菌株染色体的结构与参考菌株存在较大差异。通过比较基因组学分析 ,初步确定了910 0 1菌株甘油降解阳性、硝酸盐还原阴性、阿拉?

鼠疫耶尔森菌生物型变异遗传基础的研究和新生物型——田鼠型的提出

目的 探究鼠疫耶尔森菌生物型变异的遗传基础。方法 通过全基因组序列的比较分析 ,鉴定可能与生物型变异相关的基因突变 ,采用DNA测序和位点特异性PCR的方法 ,分析基因突变在鼠疫耶尔森菌自然分离株中的分布。结果 田鼠鼠疫自然疫源地菌株在毒力、生化表型和分子特征上与其他型别鼠疫耶尔森菌相差很大。所有脱氮阴性菌株的napA基因发生了突变 ,所有甘油利用阴性菌株的 glpD基因发生了突变 ,所有阿拉伯糖利用阴性菌株的araC基因发生了突变。结论 提出了一个新的生物型———田鼠型 ;相应糖醇代谢相关基因发生突变是 4个生物型变异的遗传基础。

鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片的研制及用于比较基因组学分析

目的 研制鼠疫耶尔森菌全基因组DNA芯片 ,并将其用于比较基因组分析。方法 挑选出 4 0 0 5条鼠疫耶尔森菌基因 ,PCR扩增各基因 ,以纯化的PCR产物点样制备芯片 ,采用双色荧光杂交策略 ,进行芯片比较基因组杂交。结果 设计了若干质控杂交组合 ,芯片杂交结果与全基因组测序结果完全一致。

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的 确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列 ,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法 通过芯片比较基因组杂交和PCR验证 ,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列 ,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果 鼠疫耶尔森菌基因组中存在 3个区段 ,共 2 8条基因 ,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中 3条基因设计PCR引物 ,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌 ,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论 鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列 ,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。

中国鼠疫菌某些生化特征及流行病学意义

目的 探讨中国鼠疫菌株生化表征的遗传变异与分型地位。方法 采用平皿 -单菌落法 ,实验观察我国17个生态型共 3 3 6株鼠疫菌酵解麦芽糖、鼠李糖、阿胶糖、甘油及脱氮反应的变化。结果 发现松辽平原、滇闽居民区和滇西纵谷区 3个生态型部分菌株对甘油、阿胶糖、麦芽糖酵解有变异 ,可同时出现酵解和不酵解的单菌落 ,而且特性较稳定 ;其余 14个生态型鼠疫菌单菌落酵解能力与过去资料报道一致无明显变化 ;根据实验结果可将中国鼠疫菌分为 12个生化型。结论 我国鼠疫菌对糖酵解特性稳定 ,具有一定的分型意义 ,滇闽居民区与滇西纵谷区生态型鼠疫菌株可能源于一个祖先。

用双重式聚合酶链反应技术检测鼠疫菌的实验研究

近几年来，随着分子生物技术的迅猛发展，国内外学者对聚合酶链反应（ＰＣＲ）用于鼠疫的检测十分关注。Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ等〔１〕（１９９３）用Ｐｌａ基因序列，以特异性片段为引物，建立了检测印鼠客蚤体内鼠疫菌的ＰＣＲ方法。Ｈｉｒｏｋｏ氏等〔２〕（１９９６）...

云南鼠疫耶尔森菌基因分型研究

目的通过对来自云南省鼠疫自然疫源地155株鼠疫菌进行基因分型,了解鼠疫菌的进化规律。方法根据22个差异区段(differentregions,DFR)设计引物,PCR扩增鼠疫菌的每个DFR。结果滇西山地闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地137株鼠疫菌的基因型均为9型。滇西山地齐氏姬鼠大绒鼠鼠疫自然疫源地18株鼠疫菌,有10株菌为7型,8株菌为9型。结论滇西山地齐氏姬鼠大绒鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌的基因型为7型和9型,而滇闽广沿海居民区黄胸鼠鼠疫自然疫源地鼠疫菌的基因型主要为9型。两疫源地鼠疫菌在遗传关系上有亲缘性,后者可能由前者进化而来。

我国鼠疫耶尔森菌最大质粒的研究

目的 研究我国鼠疫菌最大质粒的特性及地理分布特征。方法 采用Kado和Liu法提取我国各鼠疫自然疫源地 2 0 2 6株鼠疫菌的质粒 ,经琼脂糖凝胶电泳进行检测分析。结果 我国鼠疫菌具有分类属性的最大质粒有 3种 ,其相对分子质量分别为 5 2× 10 6、65× 10 6和 90× 10 6,有明显的地理分布特征。 5 2× 10 6质粒分布在祁连山南、北麓和青海湖环湖地区 ,90× 10 6质粒仅分布在藏北高原的那曲地区和青海青南高原的玉树、曲麻莱、格尔木的部分地区 ,其余各鼠疫疫源地的鼠疫菌其最大质粒均为 65× 10 6。结论 我国鼠疫菌最大质粒的特点及地理分布对研究鼠疫自然疫源地空间结构和鼠疫菌的遗传学特性具有重要意义。

云南省家、野两型鼠疫菌生化特性及营养需求的比较研究

目的 探讨云南家、野两型鼠疫菌株间遗传背景的关系。方法 采用固体平皿法 ,对云南省 32株家、野两型鼠疫菌 ,进行了生化特性及营养需求的研究。结果 12 1株家鼠鼠疫菌株中 ,16株为典型菌株 ,3株分别在发酵麦芽糖、甘油时出现了阴性和阳性两种发酵菌落 ,2株显现与野鼠鼠疫相似的生化特性。其中 12株为Pgm+ ,8株有 Pgm+和 Pgm-两种菌落 ,1株为 Pgm-。19株对谷氨酸半依赖 ,2株对谷氨酸不依赖 ,2 1株均为苯丙氨酸依赖 ;2 11株野鼠鼠疫菌株中 ,8株为典型菌株 ,2株分别在发酵麦芽糖、甘油时出现了阴性和阳性两种发酵菌落 ,1株发酵麦芽糖阳性。 9株为 Pgm+ ,2株有 Pgm+和 Pgm-两种菌落。 3株对谷氨酸半依赖 ,8株对谷氨酸不依赖 ,11株均为苯丙氨酸依赖。结论 云南省家、野两型鼠疫菌具有亲缘性 ,家鼠鼠疫可能是由野鼠鼠疫传入的。

鼠疫菌PCR检测方法的研究

本文采用聚合酶链反应(PCR)技术,通过扩增鼠疫菌9.5kb质粒pla基因上一个456bp片段,用于鼠疫菌的快速诊断。对4株鼠疫菌参考株PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳分析均呈现单—DNA扩增区带,其分子量大小与预期结果相符。对13株非鼠疫菌参考株作平行实验,PCR扩增后未见扩增区带。其检测的敏感性为10个cfu。全部实验可在4h内完成。对鼠疫菌的快速诊断和分子流行病学调查具有重要意义。

多重PCR快速鉴定鼠疫耶尔森氏菌

目的 建立鼠疫耶尔森氏菌多重PCR鉴定系统 ,用于鼠疫耶尔森氏菌的快速鉴定。方法 针对分别存在于pFra、pRst质粒上毒力基因caf1和pla ,以及一段 2 76bp染色体序列 3a分别设计引物。采用多重PCR技术 ,同时检测caf1、pla、3a三个靶序列。结果 应用该多重PCR反应体系 ,对我国鼠疫耶尔森氏菌 17个生态型及新发现的青海田鼠鼠疫疫源地菌株的多重PCR扩增结果表明 ,实验菌株中除 2株分别缺失pFra、pPst质粒而扩增出 2条产物带外 ,其余 5 2株均扩增出预期的 3条产物带 ,相关菌株均阴性 ,其检测灵敏度为 1× 10 -4ngDNA。 结论 该方法用于鼠疫耶尔森氏菌的鉴定简便、快捷 ,具有很高的特异性和敏感性 。

四川石渠县鼠疫耶尔森菌的分子生物学特征

目的 :对四川省石渠县鼠疫耶尔森菌的遗传特性进行分析 ,并与其他类型的鼠疫菌株相比较。方法 :特征性基因的PCR扩增、随机扩增多态性DNA、脉冲场电泳、rRNA基因指纹图分析等。结果 :石渠县的菌株为典型的鼠疫菌株 ,具有鼠疫强毒菌的典型特征。从该县青海田鼠中分离的鼠疫菌株 ,其分子生物学特征与我国其他疫源地中的鼠疫菌株明显不同。结论 :该地可能存在一种新类型的鼠疫自然疫源地 ,其鼠疫菌属于一单独型别 ;1999年该县发生的人间鼠疫 ,感染来自该疫源地之外 ;对该疫源地仍须密切监视 ,以确定其对人类的威胁。

棕形额蚤传播鼠疫媒介效能的实验研究

棕形额蚤Frontopsylla spadix是一广布蚤种,在云南剑川野鼠鼠疫疫源地种群组成中居第4位,是齐氏姬鼠、黄胸鼠、褐家鼠的重要寄生蚤之一,在该疫源地棕形额蚤的自然感染率为0.67％,1975～1994年从此蚤分离到鼠疫菌14株,仅次于方叶栉眼蚤而高于特新蚤指名亚种。为弄清云南剑川野鼠鼠疫疫源地主要蚤种的媒介地位,作者系统研究了棕形额蚤传播鼠疫的媒介效能。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 实验室 全自动恒温恒湿室,面积10m^2,温度19±0.5C,湿度80±5％。1.1.2 实验动物