结核γ-干扰素释放检测、核酸扩增检测联合结核感染T细胞监测对肿瘤合并结核感染患者的指导意义

目的 探讨结核γ-干扰素释放检测(TB-IGRA)、核酸扩增检测联合结核感染T细胞监测在肿瘤合并结核感染患者检测中的应用价值,分析其诊断能力。方法 收集2023年9月至2024年6月江苏省如皋市人民医院收治的100例肿瘤患者的资料进行回顾性分析,按照是否并合并结核感染分为感染组(23例)和未感染组(77例)。分析2组患者的临床资料,比较TB-IGRA、核酸扩增检测、结核感染T细胞监测3种检测技术阳性检出率差异,比较其检出能力。结果 临床细菌学检查证实肿瘤合并结核感染23例(23%),未感染77例(77%),感染组与未感染组的性别比例、年龄分布、肿瘤分类比较,差异无统计学意义(P> 0.05)。TB-IGRA检出结核菌阳性率65.22%(15/23),核酸扩增检测为47.83%(11/23),结核感染T细胞监测为55.52%(13/23)。联合应用3种检测技术时,结核菌阳性检出率为82.61%(19/23),明显高于单独检测(P <0.05)。结论 TB-IGRA检出的肿瘤合并结核感染患者的阳性率最高,3种检测技术联合应用阳性检出率明显高于单独应用,具有较好的临床应用价值。

2022年结核分枝杆菌分子检测能力验证结果分析

目的通过组织实施能力验证了解我国实验室在结核分子检测能力方面的现状。方法在2022年组织相关实验室报名参加本次能力验证,并制备能力验证样本并发放给参加实验室。通过对参加实验室的所在地区、实验室类型、上报结果和错误类型等方面进行统计和分析,评估其结核分子检测能力和管理水平。结果共有来自于11个省份的20家实验室参加本次能力验证活动,总体满意率为89.5%。不满意的原因主要为将阴性样本错误地检测为阳性。部分实验室出现填报结果错误等实验室管理问题。结论大多数参加本次能力验证的实验室具有较好的结核分子检测能力,但部分实验室应当关注实验室核酸交叉污染和实验室质量管理问题。本能力验证有助于进一步提升我国实验室的结核分子检测能力。

结核分枝杆菌对成骨细胞中抑瘤素M表达的影响

目的探讨结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis MTB)对成骨细胞中促炎细胞因子抑瘤素M(oncostatin M,OSM)表达的影响。方法利用MTB标准株侵染成骨细胞模拟体外骨结核微环境。通过预实验筛选MTB侵染成骨细胞的最佳质量浓度和最佳作用时间。成骨细胞随机分为三组,A组为对照组,是未被MTB侵染的人成骨细胞组;B组和C组为实验组,分别是被感染复数为1:1和1:5浓度的MTB侵染的人成骨细胞,侵染时间为6小时。随后用荧光显微镜观察成骨细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附试验检测上清液中抑瘤素M的表达水平。结果1.成骨细胞经MTB侵染后,凋亡明显增加,且随着感染复数增大,凋亡情况越明显。2.MTB侵染成骨细胞后,随着成骨细胞凋亡的增加,其分泌的OSM水平亦相应增加。结论OSM与MTB诱导的成骨细胞凋亡有关,OSM可能通过参与骨结核的炎性反应过程,影响成骨细胞的增殖与分化,进而参与骨破坏进程。

江西省耐多药结核分枝杆菌链霉素基因突变特征

目的了解江西省耐多药结核分枝杆菌中链霉素耐药的分子特征,探究北京基因型结核与链霉素耐药基因(rpsL、rrs和gidB)突变及链霉素耐药表型之间的关系。方法收集南昌大学第一附属医院高新医院及江西省胸科医院2021年1-12月分离的非重复耐多药结核菌106例,检测其耐药表型、是否为北京基因型及与链霉素耐药基因rpsL、rrs和gidB突变的关系。χ^(2)检验rpsL、rrs和gidB基因突变与北京基因型及表型关系。结果106例耐多药结核菌中链霉素耐药76例,其中58例rpsL 43A>G突变,8例88A>G突变,5例rrs突变,3例gidB突变。任何rpsL、rrs和gidB基因突变与表型耐药的符合率为89.6%,特异度及敏感度分别为86.7%和90.8%。北京型结核菌分离率为88.7%,其耐药基因突变主要集中于rpsL和rrs,非北京型菌耐药突变则主要集中于gidB;北京型菌更容易发生基因突变(P=0.013),但表型耐药无差异。结论rpsL、rrs和gidB基因突变与表型耐药符合率较好,可采用分子生物学直接检测耐药基因预判菌株耐药性;结核菌型与链霉素耐药特征具有紧密联系。

结核分枝杆菌潜伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白的原核表达与免疫原性分析

目的原核系统表达、纯化结核分枝杆菌潜伏感染抗原Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,并检测其能否被结核感染者外周血PBMC细胞识别,通过小鼠模型判定其免疫原性。方法按照原核系统密码子特点,全基因合成Rv2628c-Rv1737c表达核酸序列,构建表达质粒pET24a-Rv2628c-Rv1737c,原核细胞内诱导表达、亲和层析纯化Rv2628c-Rv1737c蛋白;分离不同患者样本PBMC细胞,抗原刺激后,通过q-PCR分析IFN-γmRNA表达差异,判定融合蛋白能否被TB感染者识别;联合融合佐剂DMT免疫BALB/c小鼠,检测体液免疫应答水平。结果原核克隆的重组表达质粒pET24a-Rv2628c-Rv1737c测序正确,融合蛋白以包涵体表达形式存在,经复性、亲和纯化后,分子量为57 kDa,纯度90%以上。以Rv2628c-Rv1737c融合蛋白刺激TB感染者,尤其TB潜伏感染(LTBI)者,外周血PBMC细胞IFN-γmRNA水平高于健康对照者(P<0.05);同时,BCG+Rv2628c-Rv1737c/DMT诱导小鼠能产生高水平的IgG抗体。结论原核重组可获得高纯度Rv2628c-Rv1737c融合蛋白,其作为潜伏感染抗原,可被TB感染者PBMC细胞识别,具有较强的免疫原性,是具有潜力的TB候选亚单位疫苗靶抗原,可用于TB感染尤其是潜伏感染的预防及实验室诊断。

非编码RNA调控结核分枝杆菌感染巨噬细胞自噬的研究进展

结核病(tuberculosis, TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的传染病,巨噬细胞自噬对于清除MTB具有重要作用,但MTB可以通过多种机制干扰宿主自噬,逃避巨噬细胞对其“灭杀”从而在宿主细胞内长期存活繁殖。在MTB感染的巨噬细胞中存在多种差异表达的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNAs),这些ncRNAs通过调控自噬相关基因表达在自噬的多个环节影响巨噬细胞清除MTB。因此,阐明这些调控网络对开发新的抗结核药物具有重要意义。该文综述了现阶段研究中ncRNAs调控MTB感染巨噬细胞自噬的相关机制,介绍了细胞自噬的发生过程以及ncRNAs的调控作用,以期为阐明TB的发病机制以及研发抗结核药物提供新的思路。

外周全血细胞IFN-γ和IL-2双因子检测在儿童结核诊断中的研究

目的探索儿童外周全血细胞γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白细胞介素2(interleukin-2,IL-2)双因子检测在儿童结核病中的辅助诊断价值。方法选取2022年6月至2023年12月苏州大学附属儿童医院高度疑似结核感染患儿89例,利用10kD培养滤液蛋白(culture filtrate protein 10,CFP10)和6kD早期分泌性抗原靶蛋白(early secretary antigenic target-6 kD,ESAT6)刺激受试者全血18~24h,收集培养物上清,采用ELISA法(迪澳双因子试剂盒)检测上清中IFN-γ、IL-2水平,并对检测结果进行分析。结果结核感染患儿比例随着年龄增高而增加,在活动性结核组中,以大于6岁和小于2岁患儿为主,潜伏性结核感组中,以大于6岁年龄段患儿为主;迪澳双因子试剂盒诊断结核感染与安图试剂盒诊断结果Kappa值为0.785,表明两种方法的一致性较好;活动性结核与潜伏性结核感染患儿组IFN-γ、IL-2检测结果相比,差异均有统计学意义(P<0.001);根据迪澳双因子结果的ROC曲线表明,IFN-γ和IL-2双因子联合诊断的灵敏度为91.0%,特异性为81.8%,AUC为0.880。结论外周全血细胞IFN-γ和IL-2双因子联合检测在儿童结核病中具有较高的辅助诊断价值,对于ATB和LTBI的鉴别诊断也有一定的临床意义。

结核分枝杆菌蛋白Rv0037c的结构和功能特征

目的揭示结核分枝杆菌易化子超家族(MFS)蛋白Rv0037c的结构和功能特征。方法应用TMHMM Server v.2.0、Swiss-model、DNAMAN等对Rv0037c蛋白进行生物信息学分析,在耻垢分枝杆菌中构建PMV261-Rv0037c过表达菌株,获取pMV261/Msm对照菌株,分析其生物学功能。结果Rv0037c蛋白具有11个跨膜结构域(TMDs),C/N域由“3+2”螺旋束组成,在分枝杆菌属中非常保守。过表达菌株和对照菌株的生长动力学曲线几乎完全重合,过表达菌株与对照菌株的生长量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。对照菌株的OD_(600)为2.567±0.162,过表达菌株的OD_(600)为2.419±0.456,二者的生物膜生长量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。过表达菌株的溴化乙锭(EB)累积量较对照菌株低,差异有统计学意义(P<0.001)。两种菌株对各种药物的最低抑菌浓度(MIC)比较,差异无统计学意义(均P>0.05)。结论Rv0037c蛋白为分枝杆菌MFS家族蛋白的特殊成员且结构非常保守,Rv0037c过表达对耻垢分枝杆菌生长、菌落形态、滑动能力、生物膜形成和MIC均无影响,但可使EB的累积量显著减少。

钙结合蛋白S100A4对BCG感染THP-1细胞自噬的调控作用

本研究旨在探究牛结核分枝杆菌减毒株卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核巨噬细胞THP-1后,钙结合蛋白S100A4对细胞自噬的调控作用。以感染复数为10∶1的BCG感染THP-1细胞不同时间,用Western blot检测S100A4和LC3Ⅱ的表达,以确定最佳感染时间,并采用透射电镜观察自噬体数量变化。在BCG单独感染或与S100A4小干扰RNA共处理THP-1细胞12 h后,采用qRT-PCR检测S100A4及自噬相关因子--微管相关蛋白轻链3II (microtubule-associated protein light chain 3Ⅱ, LC3Ⅱ)、自噬相关蛋白7(autophagy-related gene 7, Atg7)、Beclin-1在mRNA水平上的表达,采用Western blot检测S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在蛋白水平的表达。利用mRFP-GFP-LC3检测自噬流,激光共聚焦显微镜观察细胞中mRFP-LC3和mRFP-GFP-LC3点状聚集。结果显示:在BCG感染THP-1细胞不同时间后,S100A4和LC3Ⅱ在蛋白表达水平随感染时间的延长先上升后下降,在12 h时表达最高(P<0.001),且自噬体数量明显增多。在mRNA水平上,与siNC组相比,siNC+BCG感染组S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的mRNA表达水平显著上调(P<0.05),当BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1在mRNA水平的表达显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,P<0.001)下调;在蛋白水平上,与未感染组相比,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量显著增多(P<0.05),BCG和siS100A4共处理后,S100A4、LC3Ⅱ、Atg7、Beclin-1的蛋白表达量均极显著减少(P<0.001);与未感染组相比,BCG组自噬体的数量极显著增多(P<0.01),siS100A4+BCG组与siNC+BCG组相比,自噬体的数量显著减少(P<0.05)。S100A4对BCG感染巨噬细胞诱导的自噬具有调控作用,S100A4能够促进BCG诱导的THP-1细胞自噬。

结核分枝杆菌膜囊泡RNA表达谱分析及功能研究

目的 描绘结核分枝杆菌膜囊泡(mycobacterium tuberculosis membrane vesicles,MVs)的RNA特征表达谱,分析其主要的生物功能,初步探索其诱导巨噬细胞凋亡的作用。方法 分离结核分枝杆菌MVs,提取总RNA,采用illumina Hiseq 2500-SE50平台进行双端测序。使用BWA软件进行序列比对,通过COG数据库对基因进行功能注释。通过MTT试验检测细胞存活率,采用Annexin-V联合PI染色法检测细胞凋亡。结果 本研究通过RNA测序及生物信息学分析描绘了结核分枝杆菌MVs中RNA的种类及含量,COG数据库功能注释结果显示这些RNA主要富集的生物学功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。生物分析显示富集的主要功能包括脂质转运代谢、氨基酸转运代谢、能量产生与转化、次级代谢物合成转运与代谢和转录等。功能实验表明,结核分枝杆菌MVs可以降低THP-1源巨噬细胞的存活率,促进细胞凋亡。结论 结核分枝杆菌MVs中含有丰富的短片段RNA,具有诱发细胞凋亡的作用。然而其具体作用机制仍需要更深入细致的研究。

融合蛋白RAP的免疫原性分析

目的结核病(Tuberculosis,TB)目前是全球单一感染源造成死亡的主要原因之一,且广泛接种的卡介苗对于不同人的效果不一且有一定的副作用,甚至在某些成年人身上效果甚微,为了获得效果更好、安全性更好的结核疫苗对融合蛋白RAP进行了分析验证。方法将融合蛋白RAP连接到pET30b原核表达载体上通过双酶切鉴定构建重组质粒、用热休克法和诱导剂诱导蛋白表并通过Ni-NTA纯化蛋白;全血干扰素释放测定法(WBIA)检测RAP刺激的人外周血中IFN-γ的水平;ELISA法检测小鼠特异性IgG、IgG1和IgG2a以及IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-4的分泌水平。结果成功构建pET30b-RAP重组质粒并表达纯化RAP蛋白;RAP及其各组成蛋白能明显导致国内M.tb感染者分泌高水平的IFN-γ;小鼠经过RAP/MTO免疫后会发生Th1型反应产生特异性高滴度IgG抗体且使抗原特异性Th1型细胞因子分泌能力明显增强。结论根据得到的实验结果推断出RAP具有强大且特异性的免疫能力,所以有希望成为一种有前景的结核病候选疫苗。

自噬与结核病相关性的研究进展

结核病是结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)感染机体导致的慢性传染性疾病。结核病的发病与宿主免疫状态密切相关。自噬(autophagy)是真核生物一种高度保守的保护性机制,对维持细胞稳态具有重作用。越来越多的证据表明自噬参与了结核病的发生发展,自噬相关基因的多态性与结核病易感性密切相关。自噬有助于机体限制MTB的存活,然而MTB又可以通过多种机制免疫逃避自噬。同时,基于自噬机制的宿主导向治疗(host directed therapy,HDT)在抗结核治疗中表现出乐观的前景。本文就近年自噬在结核病中的研究作一综述,以期从自噬角度为结核病的防治提供新参考。

结核分枝杆菌GroEL1蛋白表达、纯化及结构和功能的生物信息学分析

目的:应用基因工程技术和生物信息学方法对结核分枝杆菌GroEL1进行原核表达与纯化及其结构和功能预测,分析该抗原在新型结核疫苗的应用价值。方法:采用PCR技术体外扩增GroEL1基因,并克隆至pET28a质粒中,测序筛选构建成功的pET28a-GroEL1载体,将其载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中,IPTG诱导表达重组GroEL1蛋白,利用镍亲和层析柱纯化。从UniProt数据库中获取H37Ra株GroEL1核苷酸和氨基酸序列;分别运用Protparam、TMHMM-2.0、Protscale、NetChop-3.1、Psortb、SignalP-4.1工具预测GroEL1蛋白的理化性质、跨膜螺旋、亲/疏水性、磷酸化位点、亚细胞定位,信号肽;NetNGlyc-1.0和YinOYang-1.2预测其糖基化位点;SOPMA和Swissmodel预测蛋白的二级结构和三级结构;Clustalw对同源序列进行比对。String预测相互作用蛋白,IEBD和ABCpred预测蛋白的B细胞抗原表位。结果:成功构建重组pET28a-GroEL1载体,GroEL1蛋白在大肠杆菌中部分以可溶形式表达。镍亲和层析柱纯化重组GroEL1蛋白,其纯度达90%以上。Western blot鉴定证实重组GroEL1蛋白具有良好的免疫反应性。结核分枝杆菌H37Ra株GroEL1基因全长1620 bp,编码539个氨基酸,分子量55.88 kD,等电点为4.98,预测显示该蛋白亲水性较强、性质稳定,无跨膜区,有37个可能的磷酸化修饰位点和8个O-糖基化位点,属于非分泌蛋白,定位在细胞质,二级结构显示α-螺旋占53.43%,延伸链占11.87%,β-转角占7.61%,无规则卷曲占27.09%,有多个B细胞抗原表位及多个与GroEL1蛋白相互作用蛋白。结论:成功表达并纯化重组GroEL1蛋白,运用生物信息学成功预测GroEL1蛋白的结构和功能,为结核病的预防、诊断和治疗奠定基础。

聚合酶链反应熔解曲线法检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药的临床价值分析

目的:评价荧光聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)熔解曲线法检测结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对利福平和异烟肼耐药的临床价值,为临床MTB耐药情况的快速、准确检测提供参考。方法:选取2023年10月-2024年4月苏州市第五人民医院收治的153例结核病患者作为研究对象,留取所有患者的痰液标本、纤支镜洗液标本和培养菌株标本,同时采用荧光PCR熔解曲线法、利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术(XpertMTB/RIF法)和微孔板药敏法检测MTB对异烟肼和利福平的耐药情况,分析荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平和异烟肼耐药的临床价值。结果:微孔板药敏法检测结果显示,153例结核病患者中有43例的MTB为耐药型,其中单利福平耐药的有1例(占0.65%),单异烟肼耐药的有15例(占9.80%),利福平+异烟肼耐药的有27例(占17.65%);与Xpert MTB/RIF法相比,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性分别为98.04%、90.91%、100.00%、100.00%、97.56%,而其Kappa值为0.94;与微孔板药敏法相比,荧光PCR熔解曲线法检测MTB对利福平耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性和Kappa值分别为95.42%、81.82%、99.17%、96.42%、95.20%、0.86,而其检测MTB对异烟肼耐药的符合率、阳性预测值、阴性预测值、灵敏性、特异性和Kappa值分别为94.12%、92.31%、94.74%、85.71%、97.30%、0.85。结论:对于MTB对利福平和异烟肼的耐药检测,荧光PCR熔解曲线法与Xpert MTB/RIF法、微孔板药敏法几乎完全一致,可为临床耐药结核病的早期诊断提供较为可靠的依据。

结核分枝杆菌致病相关蛋白Rv2387的生物信息学分析

目的通过生物信息学方法预测分析结核分枝杆菌(Mtb)Rv2387基因编码蛋白的结构和功能。方法从美国国家生物信息(NCBI)数据库中获取Rv2387基因及其编码蛋白的基本信息。利用ProtParam和ProtScale工具对蛋白质进行理化性质及亲/疏水性的预测;通过TMHMM-2.0、SignalP-6.0、ProtCompB分析蛋白的跨膜区域、信号肽和亚细胞定位;运用NetPhos-3.1、NetNGlyc-1.0、YinOYang-1.2预测蛋白的磷酸化位点、N-糖基化位点和O-糖基化位点;选择SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白二、三级结构;使用IEDB数据库和SYFPEITHI预测蛋白的B细胞优势表位和T细胞优势表位;通过NCBI中自带的Blast工具对Rv2387氨基酸序列进行比对,运用MEGA 11软件构建进化树;采用STRING数据库预测分析蛋白质相互作用。结果Rv2387基因全长1254 bp,共编码417个氨基酸。预测结果显示该蛋白有8个开放阅读框。Rv2387蛋白是一种稳定的亲水性跨膜蛋白,其等电点为5.39,不含信号肽,且亚细胞定位显示在细胞膜上。该蛋白经预测具有27个氨基酸磷酸化位点,3个N-糖基化位点和41个O-糖基化位点。二级结构中α-螺旋占比为47.96%,β-转角占比为4.80%,无规则卷曲占比为35.25%,延伸链占比为11.99%;存在多个抗原表位,与Rv2423、Rv2067c、eccD2、Rv3899c和glnB多个蛋白质有相互作用。结论生物信息学预测出Rv2387为亲水性蛋白,存在多个磷酸化位点并能够与多种蛋白相互作用,该蛋白存在多个T、B细胞抗原表位,可作为Mtb的疫苗候选抗原,为Mtb治疗提供新思路。

结核分枝杆菌游离DNA检测在肺外结核诊断中的价值

目的探讨结核分枝杆菌(MTB)游离DNA(cfDNA)检测技术在肺外结核诊断中的应用价值。方法选取2021年7月至2022年12月该院收治的高度疑似肺外结核患者266例作为研究对象,根据临床诊断结果,分为肺外结核组117例和非结核组149例。所有患者均采集脑脊液、胸腔积液、尿液及血液标本,并同时进行MTB cfDNA检测、结核分枝杆菌及利福平耐药快速检测(GeneXpert MTB/RIF)、涂片抗酸染色及血液标本结核感染T细胞γ干扰素释放试验(TB-IGRA)。通过分析4种检测方法的效能指标评估MTB cfDNA检测技术在肺外结核病诊断中的临床价值。结果MTB cfDNA检测法对脑脊液、胸腔积液、尿液中MTB的检出率均显著高于涂片抗酸染色(χ^(2)=5.714、9.289、9.226,P=0.017、0.002、0.002)。虽然MTB cfDNA检测法对脑脊液、尿液中MTB的检出率高于GeneXpert MTB/RIF,但差异无统计学意义(χ^(2)=0.143,P=0.705;χ^(2)=0.648,P=0.421);MTB cfDNA检测法对胸腔积液中MTB的检出率显著高于GeneXpert MTB/RIF(χ^(2)=4.222,P=0.040)。在肺外结核组,MTB cfDNA检测法的MTB检出率为26.50%(31/117),显著高于GeneXpert MTB/RIF[15.38%(18/117)]和涂片抗酸染色[3.42%(4/117)],差异均有统计学意义(χ^(2)=4.362,P=0.037;χ^(2)=24.492,P<0.05);而TB-IGRA的MTB检出率为72.65%(85/117),显著高于MTB cfDNA检测(χ^(2)=49.850,P<0.001)。MTB cfDNA检测法的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为26.50%、100.00%、100.00%、63.40%,其灵敏度显著高于GeneXpert MTB/RIF(15.38%)和涂片抗酸染色(3.42%),但低于TB-IGRA(72.65%),差异均有统计学意义(P<0.05)。结论MTB cfDNA检测在肺外结核诊断中具有较高的灵敏度及特异度,故MTB cfDNA检测在肺外结核诊断中具有较好的应用前景。

流式细胞术检测荧光素标记结核杆菌的方法

目的:建立流式细胞术检测荧光素标记结核杆菌(M.tb)的方法。方法:以异硫氰酸荧光素(FITC)、二乙酸荧光素(FDA)、PKH26和碘化丙啶(PI)标记M.tb,应用流式细胞仪检测M.tb标记率。结果:FITC标记M.tb,在PBS缓冲液中,不同浓度FITC(10~40μg/ml)标记率随浓度增加而增高,FITC浓度10μg/ml标记率为85%,FITC浓度增加到40μg/ml标记率可达到93%,差异具有统计学意义(P<0.05);而在CB缓冲液中,不同浓度FITC(10~40μg/ml)标记M.tb标记率均在90%左右,差异无统计学意义(P>0.05)。FDA标记M.tb标记率均达到92%以上。PKH26标记M.tb标记率均达到90%以上。PI标记M.tb,酒精作用1 min标记率在47%左右,酒精作用2 min标记率达到97%左右,且标记率随时间增加而增高(P<0.05)。结论:建立流式细胞术检测荧光素标记M.tb的方法可为结核病基础研究提供实验思路。创新性建立应用荧光素FITC、FDA、PKH26、PI标记M.tb,并利用流式细胞术检测标记率,可为结核病基础研究提供实验思路。

结核分枝杆菌对材料粘附能力的体外实验研究

目的:通过体外实验观察结核分枝杆菌对内植物材料的粘附情况,从细菌粘附角度出发探讨脊柱结核内固定术的安全性问题。方法:以表皮葡萄球菌为对照,在表皮葡萄球菌、结核分枝杆菌菌液中分别加入不同材料,扫描电镜观察,比较不同细菌对不同材料(钛合金、不锈钢)、不同表面(光滑面、粗糙面)的粘附情况。结果:结核分枝杆菌对两种材料的粘附均较表皮葡萄球菌少,粗糙表面所粘附的细菌量较光滑面多。结论:结核分枝杆菌对内植物材料的低粘附性可能是临床脊柱结核内固定术安全的原因之一。

黄芩苷对结核分枝杆菌抑菌作用的初步研究

目的:通过体外抑菌试验探讨黄芩苷对结核分枝杆菌的体外抑菌活性。方法:采用改良罗氏培养基绝对浓度法检测黄芩苷对37株结核分枝杆菌的抑菌作用。结果:黄芩苷对37株结核分枝杆菌临床分离株的最低抑菌浓度(MIC)最低为1.5g/L,最高>48g/L,MIC90为12g/L,MIC75和MIC50均为6g/L。全敏感菌株在MIC为6g/L时数量比例最大,随着MIC值向两侧递减;异烟肼(INH)低耐菌株的数量与MIC值无明显关联,乙胺丁醇(EMB)低耐菌株数量随着MIC由低到高的变化而显著增多;利福平(RFP)低耐菌株数量随着MIC由低到高的变化而逐步减少。结论:黄芩苷在体外对结核分枝杆菌具有一定的抑菌作用。

耐异烟肼结核分枝杆菌及其katG与inhA基因突变的研究

目的探讨耐异烟肼临床分离结核分枝杆菌与其katG及inhA基因突变的相关性。方法对87例临床肺结核患者痰标本进行培养、鉴定及药物敏感性试验,提取菌落DNA、PCR扩增katG和inhA基因片段,并对所有扩增片段进行序列分析。结果 87例菌株经鉴定均为结核分枝杆菌,30(34.5%)例为耐异烟肼菌株,57(65.5%)例异烟肼敏感菌株。30例耐异烟肼株中,18(60%)株出现katG和(或)inhA基因突变。在突变株中,9(50%)株为katG单基因突变,5(27.8%)株为inhA单基因突变,4(22.2%)株为katG和inhA双基因联合突变。两个新突变位点(Val230Met和Pro232Gln)为首次发现,已被美国,欧洲和日本的基因库收录。结论该研究证实结核分枝杆菌katG和inhA基因突变与耐异烟肼相关,为进一步研究异烟肼的抗菌机制奠定了基础。