烟曲霉复合体迟缓曲霉( Aspergillus lentulus )研究新进展

迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)是烟曲霉复合体中的一个新发现菌种,能对大部分感染者引起致命性的侵袭性肺曲霉病。由于其对多个抗真菌药物敏感性降低甚至耐药,因此一旦感染该菌,抗真菌治疗困难;另一方面,由于其形态学难以与烟曲霉区别而容易将其误报告为烟曲霉造成误诊误治。因此需要警惕新型真菌病原体的危害。目前由于对迟缓曲霉的认识不足,需要全面深入了解该菌的特点。该文探讨了迟缓曲霉的生物学特征、流行病学特征、致病性和耐药性。期望随着对迟缓曲霉认识的逐渐提升,积极研发针对该菌感染的新型抗真菌药物。

通过构建烟曲霉bem46过表达菌株研究其在极性生长中的作用

目的构建烟曲霉bem46基因过表达株,探究bem46基因过表达情况下对烟曲霉极性生长及与其他极性基因的相互作用关系。方法原生质体法构建烟曲霉bem46过表达株;激光共聚焦显微镜观察烟曲霉bem46过表达时的绿色荧光定位;观察记录烟曲霉Ku80、烟曲霉bem46基因缺陷株(Δbem46)和烟曲霉bem46过表达株的发芽率;记录烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株菌落径向生长情况;光学显微镜下观察乳酸酚棉蓝染色的烟曲霉bem46过表达菌落生长情况;实时荧光定量PCR方法测定烟曲霉Ku80、Δbem46和过表达株中有关极性生长的基因的相对表达量。结果利用原生质体法成功构建烟曲霉bem46的过表达株;激光共聚焦显微镜观察到bem46过表达时绿色荧光大量聚集在孢子头部位,而菌丝中几乎无荧光显示;相比于Ku80正常状态的发芽情况,bem46过表达株的发芽时间提前,而Δbem46株的发芽时间滞后;Ku80株、Δbem46和过表达株的径向生长差异无统计学意义;经过乳酸酚棉蓝染色以及显微镜下的观察,发现Ku80株、Δbem46和过表达株的孢子头形态有明显的差异,bem46过表达时可明显刺激孢子头膨大;通过测定烟曲霉Δbem46和bem46过表达株中极性生长基因的相对表达量,发现不论bem46基因在烟曲霉中缺失还是过表达,烟曲霉中cdc24、bem1、bem3、bud5、rsr1以及rasb基因的相对表达量均明显降低,cdc24表达量变化不大。结论bem46基因可以促进烟曲霉孢子萌发,影响烟曲霉极性生长过程中的孢子和菌丝形态;在相关基因的信号转导通路中,bem46基因可能参与cdc 42有关的极性生长信号转导通路。

CDC42基因的激活和抑制对烟曲霉极性生长影响的初步探究

目的构建烟曲霉CDC42基因显性激活性(dominant active,DA)和显性抑制性(dominant negative,DN)点突变菌株,初步了解这两种点突变对烟曲霉极性生长以及RAC1基因表达的影响。方法运用分子生物学方法构建CDC42基因激活性(CDC42^(G14V))和抑制性(CDC42^(T19N))菌株;光学显微镜观察点突变菌落特征;RT-PCR方法检测Ku80、DA Cdc42和DN Cdc42菌株中RAC1的表达量。结果成功构建烟曲霉CDC42显性激活性(DA)和显性抑制性(DN)点突变菌株并经测序确认;烟曲霉DA Cdc42和DN Cdc42菌株的菌落生长直径、形成分生孢子数和各时间点孢子发芽率较对照株Ku80都明显降低,且差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR结果表明DA Cdc42和DN Cdc42菌株中的RAC1的表达量均较对照株Ku80有所上升(P<0.05)。结论CDC42的激活和抑制都会对烟曲霉的极性生长产生负面影响;且会影响RAC1基因的表达。

累及多系统的播散性隐球菌1例

患者男,37岁。因劳累后右季肋部隐痛,阵发性咳嗽咳痰伴胸闷2周,近期体重下降2 kg而入院就诊。实验室检查:白细胞正常,嗜酸粒细胞9.40%,各项肿瘤指标正常,总蛋白:56.60 g/L、白蛋白:29.50 g/L,粪便真菌:阳性,痰涂片找到酵母样真菌;IgE:>2000.00 IU/ml。CT平扫(图1~4)显示右肺下叶近胸膜处见团片状高密度影,双肺见多发小结节影伴右侧肺门肿大淋巴结;脾脏增大,肝脏及脾脏见多发斑点及斑片状低密度影;肝脏门静脉周围见格利森(Glisson)鞘积液。

烟曲霉相关C型凝集素受体研究进展

烟曲霉(Aspergillus fumigatus,A.fumigatus)是最普遍的空气传播真菌病原体,可导致免疫功能低下患者发生致命的侵袭性曲霉病。对病原体与宿主免疫系统的相互作用过程的了解是理解其致病性的关键。通过保守的跨膜或可溶性的模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)识别病原体表面上的保守分子结构,称为病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)。C型凝集素受体(C-type lectin receptors,CLRs)是PRRs中主要受体家族之一,CLRs可以通过C型凝集素样结构域(Ctype lectin-like domains,CTLDs)来识别β-葡聚糖、甘露糖、几丁质等真菌细胞壁成分,从而诱导固有免疫和获得性免疫来清除病原体。目前烟曲霉中所涉及的CLRs主要为Dectin-1、Dectin-2、MelLec、DC-SIGN等,这些CLRs在宿主细胞识别烟曲霉中起着至关重要的作用,并且针对Dectin-1及Dectin-2已开发出新型抗烟曲霉药物。因此为了进一步了解与烟曲霉相关的各类CLRs的作用机制及其相关信号通路,为开发新型抗真菌药物提供一种新思路,文章对与烟曲霉相关的CLRs最新研究进展进行了综述。

烟曲霉耐药机制研究进展

烟曲霉是重要病原真菌,主要感染免疫缺陷患者,不仅引起感染和过敏症状,还诱发曲霉肿、慢性肺曲霉病及严重的哮喘,甚至导致危及生命的侵袭性曲霉病。曲霉病临床预防和治疗过程中,抗真菌药物特别是唑类药物的频繁使用导致日渐严重的烟曲霉耐药问题。该文对烟曲霉耐药形势和产生机制进行综述,为临床烟曲霉感染治疗和新型抗真菌药物研发提供参考。

免疫功能低下曲霉菌感染机制的实验研究

目的通过免疫力低下曲霉菌感染动物模型的建立,探讨免疫力低下曲霉菌感染机制。方法兔耳静脉大剂量注射甲泼尼龙造成动物免疫力低下,采用乳胶增强散射比浊法测定免疫功能;通过病理组织切片PAS染色,观察动物感染模型主要脏器的病理改变。结果给实验动物注射甲泼尼龙3d后,可使动物免疫指标下降(与用药前检测值相比);组织病理学结果,曲霉菌感染后,可使心、肺、肝、肾等多脏器发生病理改变,特别是肺脏和肾脏的病理改变,从而导致肺功能和肾功能的衰竭。结论曲霉菌感染可使免疫力低下动物造成多脏器的病理改变;加强免疫功能低下曲霉菌感染机制的研究,对曲霉菌感染的诊断、治疗、预防和控制具有重要的意义。

深圳市肉类食品空肠弯曲菌的污染情况调查

目的了解我市常见肉类食品中空肠弯曲菌的污染状况,为控制和预防空肠弯曲菌食物中毒提供科学依据。方法在食品污监测点随机抽检肉类食品样品117份,用传统国标法和荧光PCR法进行检测。结果从117份肉类食品中检出4份空肠弯曲菌,阳性检出率为3.4%。结论深圳市肉类食品中存在空肠弯曲菌的污染,如果加工、销售不当,及监督不严,会对群众健康构成潜在威胁。

海门地区黄曲霉毒素暴露与肝癌危险流行病学研究

对１９９６年在江苏海门进行的以人群为基础的肝癌病例与对照研究对象血清各６４份，并从海门肝癌队列研究对象中采集１９８７年、１９９２年一般人群的血清６２份和７４份。应用夹心ＥＬＩＳＡ法测定黄曲霉毒素血清清蛋白加合物水平。结果表明：ＡＦＴ－ＨＳＡ水平与肝癌危险明显相关（ＯＲ＝２．４０，９５％ＣＩ１．５０～３．８３，Ｐ＜０．０００１），且肝癌危险度随加合物水平升高而明显增高（χ２＝１５．１４２，Ｐ＝０．０００１）。比较１９８７年、１９９２年和１９９６年当地居民加合物水平发现，１９９２年和１９９６年加合物水平较１９８７年有明显下降。说明改食大米为主粮虽使得当地居民摄入黄曲霉毒素量有所下降。

侵袭性肺曲霉病的临床特征分析

目的分析侵袭性肺曲霉病(IPA)的临床特征,以期为早期诊断、合理治疗及预防提供依据。方法对解放军454医院经病理检查确诊的14例IPA患者,结合文献分析其基础疾病、症状、体征、X线胸片和CT、病理检查、治疗方案以及疗效等。结果14例患者均合并有基础疾病,其中肺癌5例(35.7%),慢性阻塞性肺疾病3例(21.4%),肺脓肿2例(14.3%),白血病化疗后2例(14.3%),肺结核1例(7.1%);糖尿病1例(7.1%);所有病例均有发热及咳嗽、咯痰,其他常见的症状还有咯血(71.4%)、呼吸急促(57.1%)、盗汗(57.1%)、胸痛(42.9%)等;X线胸片及CT可表现为空气新月征、全肺弥漫性片状或团片状阴影、单发或多发肿块或结节影等;抗真菌药物治疗10例,顺利出院4例,病情进展并死亡4例,自动出院2例,手术治疗4例患者均顺利出院。结论IPA好发于免疫缺陷患者,其临床表现无特异性,X线胸片及CT可见相应征象,确诊有赖病理检查,药物治疗效果欠佳,病程迁延或反复咯血以及不能与肿瘤鉴别者可以考虑手术治疗。

烟曲霉菌中抗真菌活性肽类物质的分离与纯化

目的从烟曲霉菌培养上清液中分离纯化具有抗真菌活性的肽类物质 (FIP)。方法用离子交换柱层析法分离 ,用反相高效液相色谱法进一步纯化 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定相对分子质量。结果从烟曲霉菌培养上清液中分离出一种具有抗真菌活性的FIP。纯化后得到高活性的精制FIP ,其相对分子质量约为 8kD ,MTT法测定结果表明 ,FIP对 5种真菌均具有明显的抗真菌效应。结论烟曲霉菌培养上清液中含有抗真菌活性的肽类物质。

Sensititre YeastOne显色药敏板与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性研究

目的评估显色药敏板Sensititre YeastOne与微量肉汤稀释法检测曲霉体外抗真菌药物敏感性的一致性。方法使用同样的孢子悬液按照CLSI M38-A2微量肉汤稀释法和Sensititre YeastOne YO10对307株曲霉进行体外抗真菌药物敏感性试验,计算两种药敏方法结果间的基本一致性、分类一致性以及错误率。结果CLSI M38-A2药敏试验显示98.4%(302/307)曲霉菌株对测试的6种抗真菌药物持野生型状态,Sensititre YeastOne则检出97.1%(298/307)菌株为野生型。除伊曲康唑外,其余5种抗真菌药物在Sensititre YeastOne与CLSI M38-A2间的基本一致性均>90%。两种方法在曲霉药物敏感性检测的分类一致性为98.1%(301/307),极显著错误率为0.3%(1/307),显著错误率为1.6%(5/307)。结论Sensititre YeastOne在检测曲霉体外药物敏感性方面与CLSI方法一致性良好,可用于临床实验室曲霉体外药敏检测。

广州地区食品分离空肠弯曲菌的病原及分子分型分析

目的了解广州地区食品中空肠弯曲菌的污染状况及菌株分子型别特征。方法采用传统生化鉴定、荧光免疫分析及PCR方法分离和鉴定所分离的菌株,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)对菌株进行分子分型分析。结果从100份检材中分离到10株空肠弯曲菌,不同方法得到一致的鉴定结果。10株菌经PFGE分析共得到3个聚类群。结论传统生化鉴定与PCR方法相结合能有效地从食品中进行空肠弯曲菌的分离和鉴定,食品分离的空肠弯曲菌中存在PFGE型的多态性。

NOD相关蛋白在烟曲霉感染小鼠肺组织中的表达

目的:研究核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)相关蛋白在烟曲霉(Af)感染小鼠肺组织中的表达。方法:通过经鼻气道滴人Af孢子的方法建立小鼠感染Af的模型,对照组小鼠经鼻气道内滴人等量的生理盐水。分别在不同时间点观察肺部Af负荷及病理学改变,采用RT-PCR方法检测各时间点的NOD1、NOD2及受体相互作用蛋白2(receptor- interacting protein 2,RIP2)mRNA在肺组织中的表达。结果:1)感染组小鼠肺部Af负荷24h达最高峰,48h迅速下降。2)两组小鼠均表现为支气管周围炎症为主的病理改变,感染组小鼠24 h炎症细胞浸润最显著,48 h炎症细胞浸润减轻。对照组小鼠病理损害明显轻于感染组。3)NOD1、NOD2、RIP2 mRNA表达在接种Af后12 h、24 h、48 h显著升高(P<0．05)。对照组各时间点NOD1、 NOD2、RIP2 mRNA表达无显著差异。结论:NOD蛋白可能为Af的胞浆内模式识别受体(pattern。recognition receptors,PRRs),在抗 Af肺部感染的免疫反应中发挥一定作用。

核酸序列依赖扩增联合分子信标对曲霉菌感染的检测效果

目的建立快速、灵敏、特异的定量检测曲霉菌感染的诊断方法。方法以烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌的孢子配制菌液,提取RNA后,采用核酸序列依赖扩增(nucleic acid sequence-based amplification,NASBA)联合分子信标(molecular beacon,MB)技术进行荧光检测,并对该方法进行灵敏度和特异性分析。结果扩增过程中累计荧光量达到设定的荧光阈值所需循环数与标本中霉菌孢子量的对数存在线性相关关系(y=-10.7x+81.6,r=0.988)。将含有梯度数量霉菌孢子的标本提取总RNA后进行检测,可建立相应标准曲线。该方法的灵敏度可达到1个孢子;对照菌株(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、热带念珠菌、新型隐球菌)与曲霉菌提取总RNA经扩增后的产物进行电泳分析,发现仅曲霉菌出现特异性条带。结论 NASBA结合分子信标检测曲霉菌具有灵敏度高、特异性强的特点,具有潜在利用价值,有望成为曲霉菌感染的临床诊断方法。

纤连蛋白与烟曲霉分生孢子相互黏附作用的初步研究

目的:初步探讨纤连蛋白(fibronectin,Fn)与烟曲霉分生孢子的相互黏附作用,以及孢子相互黏附作用的关系。方法:利用流式细胞仪检测不同浓度的Fn与烟曲霉分生孢子的黏附率及经不同胰蛋白酶处理后分生孢子与Fn的黏附率的变化;通过共聚焦免疫荧光显微镜观察Fn受体与分生孢子的相互作用及表面形态学变化;通过扫描电镜和透射电镜观察分生孢子静止期细胞壁最外层的形态及孢子在生发膨胀过程中形态学的变化。结果:随着Fn浓度的增加,与分生孢子的黏附率也增加;当用胰蛋白酶预先处理过烟曲霉分生孢子后,定量的Fn与烟曲霉分生孢子的黏附率随着胰蛋白酶浓度的增加而降低;含有荧光的Fn的配体-受体均匀分布在烟曲霉分生孢子表面;静止期和生发膨胀期分生孢子细胞的表面和内部均有特征性的变化。结论:Fn与烟曲霉分生孢子的黏附作用有浓度依赖性和饱和性。静止期分生孢子的表面可表达高水平Fn受体;膨胀过程中表面小棘状突起逐渐脱落;胞壁内没有受体存在;蛋白质破坏性试剂可除去分生孢子小棘状突起。

支气管内曲霉球的临床特征分析

目的支气管曲霉球是一种新近定义少见的肺曲霉病,探讨该类型肺曲菌病的临床特点及诊疗策略,以期通过该研究提高对该病的认识水平。方法该研究通过确诊2例支气管内曲霉球及对文献发表的29例患者临床表现、影像特点、气管镜表现、诊断及治疗等进行回顾性分析。结果该疾病常见表现有咯血、咳嗽、咳痰,影像学多表现结节或实变影,气管镜表现:主要表现新生物及坏死物阻塞支气管腔,可伴有支气管内实质损伤(和/或)空腔性病变。该病诊断是经气管镜见管腔内新生的肿物或坏死组织,活检物组织病理发现特征性菌丝即可确诊。结论支气管内曲菌球是肺曲霉菌病的少见类型,气管镜是其诊断及治疗的关键措施,对于当抗真菌治疗无效、肺内病变无吸收甚至增大时,应警惕合并肺部肿瘤的可能。

两性霉素B联合阿奇霉素及其他抗真菌药对烟曲霉体外抗菌活性研究

目的探讨两性霉素B(AMB)联合阿奇霉素(AZI)及其他常用抗真菌药对临床分离的30株烟曲霉体外抗菌活性,以指导临床治疗侵袭性曲霉病合理用药。方法药敏试验采用美国临床实验室标准化研究所(CLSI)制定的M38 A方案。结果抗真菌药体外抗菌活性依次为伏立康唑(VRC)0.29μg/mL,卡泊芬净(CBF)0.45μg/mL,伊曲康唑(ICZ)0.52μg/mL,AMB 0.55μg/mL。烟曲霉对特比萘芬(TBF)、5-氟胞嘧啶(5 FC)、氟康唑(FCZ)、AZI均显示耐药。联合用药有协同作用的为:AMB+ICZ(96.67%)、AMB+VRC(90.00%)、AMB+CBF(83.33%)、AMB+5-FC(50.00%)。结论单独用药时,AMB、ICZ、VRC、CBF有很强的抗烟曲霉作用,烟曲霉对FCZ耐药,AZI无对抗烟曲霉作用;联合用药时,AMB与ICZ、VRC、CBF、5 FC有协同抗菌作用。对于侵袭性曲霉病,可选择AMB联合用药。

体外制备和增殖烟曲霉特异性T细胞的研究

目的体外制备和增殖烟曲霉特异性T淋巴细胞。方法从健康志愿者外周抗凝血中分离并体外扩增DC,利用加热灭活的烟曲霉孢子作为抗原,体外共孵育制备烟曲霉孢子负载的DC,进一步将此成熟DC与源自同一个体的去除了DC细胞的外周血细胞共培养,体外诱导并扩增烟曲霉特异性T淋巴细胞。应用ELISPOT(酶联免疫斑点)技术检测活化T细胞IFN-γ的分泌情况,流式细胞仪检测细胞因子胞内合成情况,并分析功能细胞的类型和比例。结果 ELISPOT分析显示:PBMC+DC+Conidia实验组IFN-γ分泌(87.33±1.33/4.0×105)高于其他对照组,具有统计学意义(P<0.05)。细胞因子流式细胞仪分析显示:PBMC+DC+Conidia组中,2.76%的细胞分泌IFN-γ,其中1.61%为CD4+T细胞,与各对照组相比具有统计学意义(P<0.05)。获得的烟曲霉特异性T细胞可以在体外可进行大量增殖。结论本文结果显示烟曲霉孢子在体外可以作为变应原诱导产生烟曲霉特异性CD4+T细胞介导的Th1型免疫反应,为未来制备和扩增烟曲霉特异性T细胞及过继免疫治疗侵袭性曲霉病提供实验基础。