北京再发黑热病利什曼原虫K26基因和ITS-1序列的多态性分析

目的了解北京市再发黑热病病例的病原分子遗传背景。方法使用PCR方法分别扩增其亲水性酰化表面蛋白B(K26)和核糖体DNA内转录间隔区Ⅰ(ITS-1),然后克隆测序,分析其多态性,构建系统发育树以确定患者感染原虫的虫种类型及其遗传关系。结果K26基因扩增出626 bp大小片段,其长度与国内流行株差异明显,其氨基酸序列由14个氨基酸的基序重复排列组成,但个别位置发生氨基酸替代。K26序列的系统进化树分析显示,北京病例虫株与法国和西班牙的婴儿利什曼原虫相近,但与国内新疆、四川、河北等地的婴儿利什曼原虫虫株距离较远;ITS-1序列扩增出314 bp大小的片段,其系统发育分析显示与婴儿利什曼原虫Leishmania infantum属于同一分支。结论该病例感染的为婴儿利什曼原虫L.infantum,且与国内其他流行区的虫株有一定差异。

利什曼原虫K26基因的克隆、表达及用于我国内脏利什曼病特异性抗体检测的效果评价

目的克隆并表达分离于我国3种类型的利什曼原虫K26基因,并用其检测我国内脏利什曼病特异性抗体,同时进行效果评价。方法分别将我国新疆喀什(KS-6株)、四川九寨沟县(SC6株)和新疆伽师县(JIASHI-1株)K26基因进行全基因合成并加入Bam H I与Xho I酶切位点,分别将K26基因连接至双酶切的pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)中经1 mmol/L的异丙基-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用组氨酸标签亲和纯化柱(Ni-NTA树脂)纯化重组蛋白。用制备的3种抗原分别作为包被抗原,以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测病原学确诊的内脏利什曼病患者及其它寄生虫病患者和健康者的血清中和抗体,以评价其检测的敏感性和特异性。用美国InBios公司rK39试条进行平行检测,比较3种抗原检测的敏感性。结果成功构建利什曼原虫pET32a-K26重组质粒,并在原核细胞中成功表达。以KS-6株、SC6株、JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白为包被抗原的ELISA法和rK39试条法检测黑热病患者血清的敏感性分别为90.00%(99/110)、92.73%(102/110)、90.91%(100/110)和93.64%(103/110),共检测45份其他寄生虫病患者(包括日本血吸虫病、疟疾、细粒棘球蚴病、华支睾吸虫病、卫氏并殖吸虫病和弓形虫病)的血清均无交叉反应,健康者血清(40份)也无假阳性反应,特异性均为100.00%。KS-6株、SC6株和JIASHI-1株利什曼原虫重组K26蛋白ELISA法和rK39试条法的阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2)_(KS)-6=0.97,P=0.33;χ^(2)_(SC6)=0.07,P=0.79;χ^(2)_(JIASHI)-1=0.57,P=0.45)。3种K26抗原的阳性检出率差异无统计学意义(χ^(2)=0.53,P=0.97)。结论重组K26抗原在内脏利什曼病诊断上具有潜在的应用价值。

蠊缨滴虫病的实验室诊断最新研究进展

蠊缨滴虫病(Lophomonas blattarum disease)作为一种寄生虫病,自我国首次报道病例以来,相关报道逐渐增多。仅以光学显微镜形态学检测结果作为蠊缨滴虫病的诊断依据,难以满足临床病原学诊断需求。该文对蠊缨滴虫病的实验室诊断检测进展进行综述,旨在蠊缨滴虫病的诊断能够建立更为准确、可信的病原学检测方法,为深入开展蠊缨滴虫病研究工作提供帮助。

甘肃文县婴儿利什曼原虫无症状感染犬的检测

目的评价PCR法、ELISA法和试条法检测我国婴儿利什曼原虫无症状感染犬的潜能。方法用两组PCR引物RV1-RV2和K13A-K13B检测动物源型黑热病疫区健康犬静脉血和骨髓中利什曼原虫特异DNA,以利什曼原虫可溶性抗原为包被抗原的ELISA法和rk39-dipstick试条法分别检测利什曼原虫特异抗体,并比较各种检测方法的敏感性差异。结果PCR法检测抗凝静脉血和骨髓的阳性率分别为50.63%(40/79)和69.62%(55/79),两种样本总检出率为77.21%(61/79);ELISA法检测的阳性率为22.22%(16/72),而rk39-dipstick试条检测的阳性率为33.33%(19/57)。结论我国动物源性黑热病疫区利什曼原虫无症状感染犬的比例相当高,以骨髓为样本的PCR检测法为较精确的犬无症状感染检测方法。

中国贾第虫感染流行病学现况

１９８８～１９９１年对全国３０个省（区、市）中７２６个县的１４７７７４２人进行的贾第虫感染调查，总感染率为２．５２％，呈全国性分布，以新疆（９．２６％）、西藏（８．２２％）和河南（７．１８％）为高，而吉林、辽宁、内蒙古等则甚低。人体感染率在２％以内的县占４９．８％，高于１０％的县仅占５．５％。年龄以５～９岁组（４．９７％）为最高，次之为１０～１４岁组（４．１７％）。男性（２．７９％）高于女性（２．５２％）。职业以牧民、儿童为高。新疆、广东、河北、四川、福建的感染有家庭聚集性。饮用水以涝坝水的感染率最高（１３．９４％）。

新疆喀什地区黑热病暴发的危险因素分析

目的探讨新疆喀什地区黑热病暴发流行的危险因素。方法采用病例对照研究,自制调查问卷,以基于利什曼原虫kDNA保守区PCR扩增的分子方法检测呈阳性感染的为病例组,按1∶3匹配选择年龄、性别、营养状况、职业、家庭收入与消费、受教育程度等方面差别无统计学意义(P>0.05),且利什曼原虫感染检测呈阴性的健康人为对照组,对性别、环境和行为等10个潜在危险因素进行单因素和多因素logistic回归分析。结果75份易感人血样感染利什曼原虫阳性率为82.67%(62/75)。单因素分析显示:户外被叮咬、户外露宿习惯、邻居有黑热病患者、蚊帐及趋避剂杀虫剂的使用与当地易感人群感染利什曼原虫关系密切,危险比(RH)值和95%可信区间(95%CI)依次为7.296,(3.102,1.16)、15.429(5.876,8.995)、75.6(26.6,214.9)、0.311(0.132,0.733)、0.491(0.292,0.672);多因素分析显示:户外被叮咬、邻居有黑热病患者是感染利什曼原虫的危险因素,使用蚊帐是保护性因素,RH值和95%CI为12.56(3.476,45.38)、140.987(37.59,528.8)、0.185(0.05,0.68)。结论在该地区易感人群感染利什曼原虫率较高的情况下,对当地居民普及黑热病的危害及防御措施,及时确诊并彻底诊治黑热病患者,尽量避免户外被叮咬,养成使用蚊帐习惯是预防控制当地人源型黑热病感染暴发的有效措施。

山东省1例人粒细胞无形体病的确认与调查

目的对1例可疑人粒细胞无形体病病例进行病原学实验诊断与流行病学个案调查。方法按照卫生部下发的《人粒细胞无形体病流行病学调查方案(试行)》进行个案调查。采用套式-聚合酶链反应(nested-PCR)技术检测病例血液中人粒细胞无形体16SrRNA基因。结果人粒细胞无形体DNA检测为阳性,测序分析显示与浙江、吉林野鼠检出的无形体相应序列同源性99%以上。结论该病例为山东省2008年疫情网络直报首起人粒细胞无形体病突发公共卫生事件报告病例,并经实验室检测确诊,符合卫生部下发的《人粒细胞无形体病预防控制技术指南(试行)》中的病例诊断标准。证明山东省存在人粒细胞无形体感染病例,进一步开展自然疫源地调查工作十分必要。

一株芽孢杆菌16SrRNA的基因序列测定和系统进化分析

从河南黄河稻区土壤中分离出一株具有较强稻瘟病菌拮抗活性的芽孢杆菌菌株BS501,经过形态观察、生理生化特性检测和电镜技术,确定其为芽孢杆菌属细菌。为进一步确定其分类学地位,扩增了BS501基因组的16S rDNA,并将测序结果提交GenBank数据库(登录号:FJ755787)。利用BLAST软件将该序列与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等芽孢菌属细菌及大肠杆菌16S rDNA序列进行同源性比对。系统进化树表明,BS501与芽孢菌属细菌在进化关系上组成一个大的分支,与枯草芽孢杆菌最为接近,与大肠杆菌较远。同源性分析表明该序列与枯草芽孢杆菌PRE23同源性达99%,证实该菌株的分类学地位为枯草芽孢杆菌。

华支睾吸虫成虫全长基因表达文库的构建和基因表达谱的建立

目的 获得尽可能多的华支睾吸虫UNIGENE及全长基因 ,建立成虫基因表达谱 ,为华支睾吸虫发育过程中基因表达的规律和功能基因组学研究奠定基础。方法 构建 pBluescriptⅡSK全长cDNA质粒文库 ,先对 5’端进行随机EST大量测序 ,生物信息分析后归并UNIGENE ,并对归并的结果进行了 3’端的序列测定 ,根据 3’端测序结果 ,再次进行UNI GENE归并 ,对能够拼接上的克隆进行了序列拼接。对预测为完整基因且未测通的序列 ,进行了引物设计 ,walking反应测序 ,将得到的UNIGENE用点样法制备基因芯片。结果 获得 5’端有效EST序列 4 0 6 6个 ,测序结果UNIGENE分析 ,归并获得1775个UNIGENE ,5’端预测的全长基因为 377个。共获得测通的cDNA序列 2 77个 ,其中全长基因 198个。目前制备的华支睾成虫基因表达谱芯片含有 1775个基因。结论 所构建的华支睾吸虫成虫全长cDNA文库质量较好 ,采用的技术路线获取全长基因建立基因表达谱的效率较高。

双氢青蒿素对蓝氏贾第鞭毛虫滋养体蛋白质的损伤

目的探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对体外培养的蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)滋养体蛋白质的损伤作用。方法用改良TYI-S-33培养基培养蓝氏贾第鞭毛虫滋养体;设立实验组(DHA组)和正常对照组(C组)。实验组用含双氢青蒿素的培养基(含LC50=200μg/mL的DHA)培养;对照组培养基不含药物。提取各组虫体总蛋白,经Brad-ford法进行蛋白质定量,样本经2D-电泳和硝酸银染色后,扫描检测凝胶电泳图蛋白点的数量和种类,获取蛋白质点匹配信息,挑选匹配性高的蛋白点,进行质谱(MALDI-TOF MS)分析。结果经双氢青蒿素作用后虫体总蛋白质含量(0.6993μg/mL)明显低于对照组(4.8241μg/mL),二者差异有显著性(P<0.001)。蛋白质二维电泳凝胶图分析结果显示,正常对照组(C组)蛋白点密集,约1253个点,布满整块凝胶,蛋白表达量高(蛋白点颜色深且清晰、明亮);与此相反,实验组(DHA组)蛋白点显著减少,DHA作用6h后约617个点,作用12h后约326个点,蛋白表达量明显降低(蛋白点颜色浅,不清晰)。其次,正常对照组与双氢青蒿素组的12kDa^30kDa、等电点pI3.0~7.6范围内蛋白点表达量存在明显差异,即实验组该范围内大多数蛋白点完全消失,45kD^60kDa的蛋白点仅剩6个点。质谱分析鉴定结果显示,在正常对照组胶图所选的80个匹配良好的蛋白点中,鉴定出6种骨架蛋白(14个点),而实验组(DHA组)蛋白胶图中相对应的蛋白点消失。结论双氢青蒿素对蓝氏贾第鞭毛虫滋养体的蛋白质具有明显的损伤作用,其中包括细胞骨架蛋白。

用PCR扩增tim基因检测蓝氏贾第鞭毛虫

采用聚合酶链反应 (PCR)对蓝氏贾第鞭毛虫 (Giardialamblia)的磷酸丙糖异构酶 (triosephosphateisomerase ,缩写为tim)基因进行特异性扩增 ,结果扩增出 1条 6 83bp的DNA片段。此方法的特异性可高达10 0 % ,而其它DNA样本 ,如日本血吸虫 (Schistosomajaponicum)、刚地弓形虫 (Toxoplasmagondii)、微小隐孢子虫 (Cryptosporidiumparvum)、溶组织内阿米巴 (Entamoebahistolytica)、旋毛虫 (Trichinellaspiralis)和阴道毛滴虫 (Trichomonasvaginalis) ,以及人体血细胞等均未出现扩增反应。本法的敏感性也很高 ,可检测到0 4pg贾第虫包囊的DNA。 13株来自不同地理位置和 或宿主的贾第虫DNA样本在PCR中均各产生 1条长为 6 83bp的目的片段。

拉曼镊子结合多元统计方法分析两种人体滴虫的差异性

应用单细胞激光拉曼光谱分析技术,对不同来源的阴道毛滴虫和口腔毛滴虫的拉曼光谱数据进行减背景、平滑、基线校正、归一化等处理后做主成分分析(PCA)和辨别函数分析(DFA)等多元统计分析。平均光谱和PCA分析结果表明,阴道毛滴虫和口腔毛滴虫差异最为明显是1002 cm-1峰,其次,差异相关性最大的还有9个拉曼谱峰785,888,979,1127,1287,1317,1364,1446和1465 cm-1,其中4个峰来自核酸,6个峰归属于蛋白质信号峰,反映两种滴虫的蛋白质、核酸的相对含量差异较大,可以通过PCA方法鉴别两种毛滴虫的差异。由于口腔毛滴虫或阴道毛滴虫虫株间差异并不明显,应用PCA结合DFA多元统计学方法,在保留原有数据信息基础上,通过扩大组间差异,缩小组内差距,同种毛滴虫虫株间在一定程度得到区分。口腔毛滴虫4个虫株之间有12个峰是差异最大的谱峰,阴道毛滴虫4个虫株之间有14个峰是差异最大,反映了两种毛滴虫虫株之间核酸、蛋白质、脂类及糖类等生物大分子组成相对含量差异。此外,根据DFA中虫株间欧氏距离聚类,可以确知虫株之间的差异。

双氢青蒿素、甲硝唑及两药联合应用体外抗阴道毛滴虫效果的研究

目的观察双氢青蒿素(DHA)、甲硝唑及两药合用体外抗阴道毛滴虫的效果。方法用肝汤培养基37℃无菌培养阴道毛滴虫滋养体。每实验管含滴虫2.5×106个/ml。实验分4组:双氢青蒿素组,甲硝唑组,两药合用组,对照组。观察不同药物浓度,不同作用时间杀滴虫效果。用杀虫率评价两药合用的杀虫效果。结果两药联合应用有以下特点:(1)增效作用明显,两药配伍剂量合适时杀虫效果最佳;(2)杀虫时间缩短,双氢青蒿素1.0mg/ml+甲硝唑0.004mg/ml杀虫率为100%的时间比单用减少8h;(3)药物用量减少,同在8h,杀虫率近100%,双氢青蒿素单用最低药量为1mg/ml,甲硝唑单用最低药量为0.008mg/ml,两药合用最低药量为双氢青蒿素0.5mg/ml+甲硝唑0.004mg/ml。两药合用药量比单用各减少1倍。双氢青蒿素破坏虫膜,裂解死亡,甲硝唑主要作用于胞内结构,两药作用靶位不同是联合应用增效的基础。结论双氢青蒿素、甲硝唑杀虫机理各不相同,两药联合应用有明显增效作用。

弓形虫感染与慢性疾病的关系

刚地弓形虫（Toxoplasmagondii）是一种专性细胞内寄生的原虫，感染人及其他动物，引起人畜共患病。弓形虫病呈世界性分布，人类感染后多为隐性，但在免疫低下或免疫缺陷患者[如恶性肿瘤、免疫获得性缺陷综合征（AIDS）、器官移植、使用免疫抑制剂等]可引起严重的损害，孕期感染弓形虫可引起流产、早产、死胎或畸型，是导致免疫低下或缺陷者死亡的重要机会性致病病原体之一。糖尿病（DM）是一种由于胰岛素缺乏或相对不足及胰岛素抵抗引起的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱的综合征，分I型、Ⅱ型、妊娠型和其他特殊型DM，患病率呈全球性迅速增加，成为继心血管和肿瘤后的第三大严重威胁人类健康的非传染性疾病。我国是世界上DM患病人数仅次于印度的第二大国，代谢紊乱导致免疫功能失调、免疫力下降增加了对机会性病原体的易感性。

不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异研究

目的 研究中国大陆及台湾地区不同地域株湖北钉螺CO1基因的差异,为湖北钉螺种下分类提供依据。方法 收集13个地域株的湖北钉螺,高盐法抽提细胞内全部DNA ,PCR法扩增线粒体CO1基因,纯化并测序。将测序结果输入MEGA2程序,Kimura双参数法计算遗传距离,并分别用UPGMA法和最小进化法构建系统发生树。结果PCR扩增获得CO1基因大小约70 0bp(含两侧引物)。遗传距离显示:13个地域株明显被分为两组,其中四川株和云南株为一组,组内遗传距离为0 .0 35 ,其余为另一组,组内平均遗传距离为0 .0 14。而两组间的遗传距离为0 .12 9。两种方法构建的进化树拓扑结构基本一致。进化树分两大支,四川株和云南株位于一支,其它地域株位于另一支。结论13个自然隔离株湖北钉螺CO1基因总体差异不大,显示为一个种,其中四川、云南株与其它地域株差异显著,支持以往滇川亚种的结论,长江中下游各地域株CO1基因非常相近,支持指名(或湖北)亚种的分类方法。福建株、台湾株的分类地位有待进一步探讨。光壳和肋壳钉螺CO1基因无差异。

腹泻病人隐孢子虫及其他原虫感染粪样检测分析

目的检测分析腹泻病人粪便中隐孢子虫及其他原虫感染情况,为该病的诊断、防治提供科学依据。方法用直接涂片法、碘液染色、改良抗酸染色法和金胺酚染色法作为病原学检测的金标准,同时联用ELISA、免疫试条法和FTA巢式PCR法,对临床109例腹泻病人隐孢子虫及其他原虫感染情况进行粪样检测分析。结果 109例腹泻病人中男性为65人,女性为44人,年龄在6～65岁,原虫检出率达到45%(49/109),感染对男女年龄无显著性差别(P>0.05)。其中,用直接涂片法和碘液染色法检测阿米巴原虫感染的阳性率为2.8%(3/109),人芽囊原虫感染的阳性率为34.9%(38/109),没有查到蓝氏贾第鞭毛虫;改良抗酸染色法加金胺酚染色法,隐孢子虫感染的阳性率为8.3%(9/109),微孢子虫阳性率为1.8%(2/109);隐孢子虫ELISA试剂盒法检测隐孢子虫感染的阳性率为6.4%(7/109);隐孢子虫免疫试条法检测的隐孢子虫感染的阳性率为1.8%(2/109);巢式PCR法检测隐孢子虫感染的阳性率达到9.1%(10/109),经过测序后为微小隐孢子虫和猫隐孢子虫。结论联合多种检测手段能提高肠道原虫的检出率,腹泻病人感染的原虫主要为隐孢子虫和人芽囊原虫。

甲硝唑体外抗阴道毛滴虫的电镜观察

目的:观察甲硝唑对阴道毛滴虫超微结构的影响。方法:在2.5×106个.mL-1阴道毛滴虫培养液中加入甲硝唑(5mg/L),37℃培养3～5h,利用扫描和透射电镜观察甲硝唑对阴道毛滴虫超微结构的影响。结果:甲硝唑作用于阴道毛滴虫后,对其细胞膜及氢化酶体影响不明显;阴道毛滴虫细胞质出现大量空泡、裂隙,内质网消失、细胞核变形及自噬空泡,最终虫体变性坏死。结论:甲硝唑对阴道毛滴虫细胞内结构的破坏是导致虫体死亡的主要原因。

甘肃省2县犬感染利什曼原虫影响因素分析

目的了解甘肃省犬感染利什曼原虫影响因素,为探索犬源型黑热病防控新方法提供依据。方法在甘肃省迭部县和文县犬源型黑热病流行区,通过入户问卷调查及犬血PCR检测,调查当地家犬位置、居住场所环境、犬离房屋距离、犬来源、犬主黑热病知识知晓状况和犬感染利什曼原虫现状等信息。利用IBM SPSS23.0 Pearsonχ2检验和多元Logistic回归分析与犬感染利什曼原虫有关的影响因素。结果共调查当地居民445人,家犬537只。家犬血样利什曼原虫PCR检测阳性率为41.15%(221/537),其中文县PCR检测阳性率64.63%(95/147),迭部县PCR检测阳性率32.31%(126/390)。村中央和村边缘犬的阳性率分别为33.92%(96/283)和49.21%(125/254),两者之间有统计学差异(χ2=12.923,P=0.000)。居住场所附近房屋墙面为砖混/粉刷墙壁的犬和附近为土坯/石片墙壁的犬,阳性率分别为30.99%(110/355)、60.99%(111/182),两者之间有统计学差异(χ2=44.723,P=0.000)。家庭存在阳性犬的犬主是否知晓黑热病基础知识与犬感染无统计学差异。多因素分析犬的环境位置、犬居住场所附近房屋条件显示与犬感染具有显著相关性。结论甘肃省文县和迭部县分布在村边缘的犬、犬附近房屋墙壁土坯/石片结构是犬感染的影响因素。针对不同的影响因素应制定针对性的防治措施,减少黑热病和犬利什曼病的传播。

利什曼原虫—DNA重复序列在虫种鉴定上的价值分析

目的 通过分析和比较我国利什曼原虫分离株与相应的利什曼原虫世界卫生组织(WHO)参照株在一种DNA重复序列上的同源性以考察这一DNA重复序列应用于鉴别我国利什曼原虫的价值。方法 PCR扩增各利什曼原虫分离株的DNA重复序列片段并测序,用GENEDOC软件比较扩增的各分离株DNA重复序列的同源性。结果 该DNA重复序列在种内各利什曼原虫分离株间完全同源或高度同源(99%～10 0 % ) ,且碱基变异具有高度稳定性,而在种间则显示相当的差异(一般同源性小于90 % )。结论 该DNA重复序列在我国利什曼原虫的鉴定上有较好的实用价值。

不同种株利什曼原虫的比较蛋白质组学分析

目的观察不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质表达状况。方法制备杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白,以pH范围3-10的预制胶条进行双向电泳(2-D),考马斯亮蓝染色,PDQust软件分析凝胶,主要差异蛋白点用电喷雾质谱法进行鉴定。结果等量的杜氏利什曼原虫四川SC6株、杜氏利什曼原虫四川SC10株和硕大利什曼原虫5ASKH株前鞭毛体总蛋白均获近700个蛋白点,不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质2-D图谱中,14蛋白点呈恒定差异表达,从中鉴定出10个功能明确的蛋白质,分别具有下列生物功能:糖代谢与磷脂合成(烯醇酶、变旋酶、NADP依耐乙醇脱氢酶、乙醇胺磷酸胞苷酸转移酶),压力反应(细胞内过氧化物酶、锥虫还原蛋白过氧化物酶),细胞膜/细胞骨架(α-微管蛋白、β-微管蛋白),核酸代谢(琥珀酰辅酶A连接酶(GDP形成)、内源性RNA酶L-PSP(pb5)),细胞周期与增殖(延伸因子2)。结论不同种株利什曼原虫前鞭毛体蛋白质的表达存在不同,为理解不同种株利什曼原虫的毒力、免疫原性和代谢特征提供了新的视角。