泛素-蛋白酶体系统在寄生原虫生长发育中的调控作用及潜在药物靶点分析

蛋白质降解是细胞维持正常生命活动的重要途径之一,其中泛素-蛋白酶体系统发挥关键作用。泛素-蛋白酶体系统参与调控细胞分化、细胞凋亡、DNA复制、蛋白质质量控制等生命活动。研究表明,对该系统中的功能蛋白进行干预,可直接影响寄生原虫的生长发育。本文主要探讨近年关于泛素-蛋白酶体系统在寄生原虫生长分化过程中发挥的关键作用,揭示其作用靶点,为开发新型抗原虫药物提供思路。

中国地区家猫弓形虫流行病学特征及空间聚集性研究

目的了解我国家猫弓形虫感染状况和空间分布特征,以期为刚地弓形虫的预防和控制提供科学依据。方法本研究基于PubMed、中国知网CNKI、万方数据库及百度学术数据库选择性文献调查检索,检索截至2023年12月31日发表的关于中国地区家猫弓形虫血清流行率的调查研究。应用地理信息系统(Geographical information systems,GIS)对中国地区家猫弓形虫感染状况进行空间定位与表达。采用SPSS 26.0软件统计分析。结果本研究共纳入1984年至2023年间发表的86项符合条件的研究,涵盖28个省级行政区,涉及20722只猫。ArcGIS分级统计结果显示,我国家猫弓形虫血清抗体总阳性率为14.78%(3080/20836,95%CI:14.07%~15.03%)。西藏自治区、天津市、海南省、香港特别行政区、澳门特别行政区和台湾省至今尚未见猫弓形虫流行病学调查研究。猫弓形虫血清抗体阳性率最高的地区是山西省(60%,54/90,95%CI:49.82%~70.18%),其次是河北省(57.33%,43/75,95%CI:46.07%~68.59%)、河南省(45.53%,173/380,95%CI:40.52%~50.54%)和云南省(43.64%,24/55,95%CI:30.49%~56.79%),而弓形虫血清抗体阳性率最低的地区是江西省(2.47%,2/81,95%CI:-0.90%~5.90%)。我国北方地区的猫弓形虫血清抗体阳性率为14.12%(2044/14481,95%CI:12.34%~15.90%),而南方地区的阳性率为16.30%(1036/6355,95%CI:15.40%~17.20%),两者间有统计学差异(χ^(2)=16.60,P<0.05)。此外,时间分布结果显示,1984-2023年我国猫弓形虫血清抗体阳性率总体呈下降趋势。结论弓形虫在我国家猫中广泛传播,流行周期稳定且不同地区之间差异很大。由于宠物猫在我国日益流行,以及这些猫与人类之间的亲密关系可能会带来重大的暴露风险。因此,养猫与人类弓形虫感染之间的联系,以及如何减少人类通过猫接触弓形虫和猫弓形虫卵囊污染环境,需要进一步研究。

弓形虫感染与脑炎因果关系的双样本孟德尔随机化分析

目的利用孟德尔随机化(MR)分析探究弓形虫感染与脑炎的因果关系,并通过免疫组化观察脑组织中的弓形虫包囊分布和炎症情况。方法获取弓形虫感染和脑炎的全基因组关联分析数据,筛选出单核苷酸多态性(SNPs)位点,以逆方差加权法为主进行MR分析,以OR值及95%CI评价弓形虫感染与脑炎之间的因果关系。利用异质性检验、水平多效性检验、留一法进行质量控制。利用Wh6弓形虫包囊感染的小鼠脑组织切片进行免疫组化染色,使用Image J软件进行图片分析。结果筛选出29个弓形虫感染与脑炎存在相关性的SNP,IVW方法结果提示弓形虫感染使得脑炎的患病分险为原来的0.98倍(OR=0.98,95%CI为0.76~1.27),显示两者无因果关系。质量控制结果提示筛选出的SNPs具有稳定可靠性。弓形虫包囊在脑组织各部位分布不同。结论弓形虫感染与脑炎具有相关性,但未有充分证据证明二者之间存在因果关系。

家猫感染东方次睾吸虫形态学特征及分子鉴定

目的了解家猫感染东方次睾吸虫的形态学及基因特征,为当地开展东方次睾吸虫病防控工作提供理论依据。方法采集浦城县感染有东方次睾吸虫囊蚴的麦穗鱼,剪碎囊蚴寄生处的鱼尾部肌肉,喂食2个月龄家猫。45 d后连续多天检测家猫粪便中的虫卵,直至发现虫卵后进一步深入检查。观察肝脏及胆囊变化和虫体寄生部位,捡出虫体置于生理盐水中,对虫体的形态学特征进行观察与鉴定描述。提取虫体基因组DNA,PCR扩增ITS基因序列,测序后在GenBank上进行BLAST比对,采用邻接法构建系统进化树。结果从胆囊和肝脏分离获得13条东方次睾吸虫。东方次睾吸虫为雌雄同体,虫体大小约为(1.95~2.86)mm×(0.61~0.93)mm;虫卵呈长椭圆形,似葵花籽状,虫卵大小约(28~32)μm×(16~18)μm。PCR结果显示,ITS基因序列扩增产物260 bp。BLAST比对结果显示,与国内已报道家鸭及黑天鹅感染的东方次睾吸虫(GenBank登入号分别为MT231323.1、MK482055.1、MK482052.1)的序列一致性均为99.62%。基于ITS基因的系统进化树显示,本研究分离获得的吸虫ITS序列属于次睾属,与东方次睾吸虫(GenBank登入号分别为HM347224、KX832894、MK482055、MT231323、KX857496、MK482052)属于同一个分支。结论从家猫分离的虫体经形态学及基因分析与文献报道的一致,鉴定为东方次睾吸虫。

RH株弓形虫颅内定位注射建立急性弓形虫脑炎小鼠模型的研究

目的观察RH株弓形虫定位感染小鼠海马引起的组织病变,以构建急性弓形虫脑炎小鼠模型。方法利用颅内定位注射技术,将定量(100、500、1000个)RH株弓形虫滋养体,定位注射入小鼠海马CA1区,观察小鼠的生存状况;Giemsa染色方法观察小鼠腹水和脑组织匀浆中弓形虫数量的变化;尼氏染色和HE染色观察小鼠海马神经组织的病理改变;用免疫组化ABC法观察弓形虫在脑组织的分布。结果RH株弓形虫感染各组小鼠在感染第4天表现出明显的弓背、竖毛、腹胀、头颅细微震颤、偏瘫等症状。定量100感染组小鼠生存时间较长,腹水中未发现弓形虫滋养体,脑组织匀浆在96 h后发现少量的假包囊,小鼠死亡后则有较多滋养体;尼氏染色和HE染色则在144 h发现较多的组织坏死灶,CA1区神经细胞缺失;随感染时间的延长而脑组织损伤加重。而定量500感染组和定量1000感染组小鼠腹水和脑匀浆中均发现弓形虫滋养体;尼氏染色发现海马区神经元丢失和大量坏死;HE染色发现组织坏死灶及炎性细胞浸润,脑组织损伤均较定量100感染组小鼠显著加重;免疫组化证实坏死灶中有弓形虫的分布。结论定位感染RH株弓形虫100个滋养体小鼠存活时间较长,脑组织病理变化逐渐加重,损伤局限于脑组织内,小鼠表现典型的弓形虫脑炎症状。因此定位感染100个弓形虫滋养体可以构建急性弓形虫脑炎小鼠模型,可为弓形虫对脑神经的损伤机制研究奠定基础。

去铁酮对弓形虫慢性感染小鼠肝损伤中铁代谢紊乱的治疗作用

目的观察弓形虫慢性感染小鼠服用去铁酮(DFP)后,肝脏中铁及其他金属元素和炎症因子γ干扰素(IFN-γ)的变化情况,探讨DFP治疗弓形虫慢性感染所致肝损伤的疗效。方法将6周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分为4组:control组、control+DFP组、TgCtWh6组、TgCtWh6+DFP组,每组6只,control组无菌灌胃PBS;TgCtWh6+DFP组每日灌胃50μg/kg DFP,TgCtWh6组灌胃20个弓形虫包囊,TgCtWh6+DFP组灌胃20个弓形虫包囊且每日灌胃50μg/kg DFP,饲养45 d后处死小鼠并取其肝脏组织。采用电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测小鼠肝脏组织中铁及其他金属元素含量;采用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)和Western blot分别检测小鼠肝脏组织中IFN-γ、铁蛋白重链(Fth)mRNA的表达水平和蛋白水平。结果慢性弓形虫感染的小鼠肝脏中铁、锰和锌的组织留存水平增高,在服用DFP后其肝脏中铁元素含量明显下调(P<0.01),与TgCtWh6组相比,TgCtWh6+DFP组在服用DFP后肝脏中Fth含量下调(P<0.01),铁代谢紊乱得到了有效改善,同时肝脏中IFN-γ含量明显下调(P<0.01),肝脏的炎症反应也有所减轻。结论DFP可以有效改善小鼠弓形虫感染后肝脏中的铁代谢紊乱及减轻肝脏的炎症性损伤。

慢性感染阶段弓形虫包囊在小鼠脑组织的动态病理变化

目的探究弓形虫慢性感染期间弓形虫包囊在感染小鼠脑部各区域的分布与病理变化对小鼠行为与神经精神的影响。方法使用弓形虫Prugniaud株灌胃小鼠,记录感染小鼠病情;分别在小鼠感染的第10、30、40、90、120、160天取感染小鼠脑组织,分离出海马下丘脑、前额叶、纹状体和小脑区域,HE染色观察并记录各感染区域的包囊数量和神经病理变化。结果弓形虫感染小鼠出现竖毛、弓背等症状,在第40天最为显著,随后逐渐恢复,遗留偏瘫和原地打转等症状;在各时间节点,弓形虫包囊的数量均以海马下丘脑最多,前额叶和纹状体次之,小脑最少;弓形虫包囊的直径随着时间推移均呈增大趋势。慢性感染期间,在脑组织各区域均可观察到弓形虫包囊噬神经现象等特异性病理表现,上述弓形虫脑炎的病理改变在第40天达到顶峰,后逐渐恢复,至第120天增至刺激峰,随后逐渐恢复。结论弓形虫慢性感染期间的行为和神经精神症状与弓形虫包囊在感染小鼠脑部的定位分布有一定的相关性,并呈现动态变化。

IL-33缺陷调节小鼠抗弓形虫感染的CD8^(+)T细胞应答

目的探讨IL-33缺陷(IL-33^(-/-))对弓形虫感染小鼠的炎症反应和CD8^(+)T细胞功能的影响。方法C57BL/6野生型(Wild-type,WT)和IL-33^(-/-)小鼠分别设感染组和对照组,建立弓形虫感染模型,记录小鼠死亡时间,绘制生存曲线;分别取感染后48 h、96 h各组小鼠外周血及肝、脾组织,HE染色观察组织病理变化;微量样本多指标流式蛋白定量技术(cytometric bead array,CBA)及ELISA检测血浆炎症因子(IL-12P70、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6及IL-4)水平;qPCR检测小鼠脾细胞中弓形虫速殖子表面抗原-1(SAG-1)的mRNA水平;流式细胞术分析脾脏CD8^(+)T细胞穿孔素、颗粒酶和IFN-γ水平。结果与WT感染组小鼠比较,96 h时IL-33^(-/-)感染组小鼠脾脏SAG-1 mRNA表达降低(F=13.96,P<0.05),肝、脾组织的炎症改变较轻,生存时间延长(χ^(2)=6.87,P<0.01);与WT感染组小鼠比较,感染96 h时IL-33^(-/-)感染组血浆IL-4浓度升高较高(F=328.32,P<0.01),而TNF-α、IFN-γ、MCP-1均明显较低(F TNF-α=32.66、F IFN-γ=59.32、F MCP-1=43.78,均P<0.01);感染96 h,IL-33^(-/-)感染组小鼠脾脏CD8^(+)T细胞穿孔素(F=574.20,P<0.01)、颗粒酶(F=14.68,P<0.05)和IFN-γ(F=15.22,P<0.05)表达均高于WT感染组。结论在小鼠急性弓形虫感染中,IL-33抑制脾脏CD8^(+)T细胞应答,促进全身炎症反应。

弓形虫ROP16蛋白对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期和凋亡的影响

目的探讨弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白在人乳腺癌MCF-7细胞增殖、周期及凋亡方面的作用。方法以空载体(MCF-7-HBLV)和过表达ROP16蛋白的慢病毒(HBLV-RH ROP16)分别感染MCF-7细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达ROP16的细胞株,Real time PCR、Western blot法检测MCF-7细胞中ROP16 mRNA和蛋白表达水平。CCK-8和流式细胞术检测细胞增殖、周期和凋亡。Western blot法检测细胞周期及凋亡相关蛋白表达。结果相比MCF-7-HBLV(空载体组)和MCF-7细胞组(对照组),MCF-7-RH ROP16细胞组中ROP16 mRNA和蛋白表达升高;细胞增殖率降低(P<0.01);S期细胞比例、细胞凋亡率升高(P<0.01)。促凋亡因子Bax、P53、Caspase-9、Caspase-3及细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子P21表达增高(P<0.01);抗凋亡蛋白Bcl-2及细胞周期蛋白A1(CyclinA1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)的表达均下降(P<0.01)。结论弓形虫Ⅰ型(RH)ROP16蛋白可通过调节与凋亡、周期相关的细胞因子的表达,诱导MCF-7细胞凋亡,抑制其增殖并引起细胞周期阻滞。

桂林地区危重患者弓形虫感染情况调查与DNA鉴定分析

目的:了解广西桂林地区危重患者弓形虫感染情况。方法:选取2018年11月至2019年11月在桂林医学院附属医院住院的危重患者260例,采集患者空腹静脉血,分离血清,采用ELISA法检测血清弓形虫IgG抗体;分析弓形虫感染与性别、年龄和患病类型间的相关性;采用PCR技术对弓形虫感染阳性患者进行DNA鉴定。结果:260例危重患者,弓形虫感染IgG阳性男73例、女24例,弓形虫IgG阳性检出率为37.31%;男患者弓形虫IgG阳性率41.01%,高于女患者29.27%;弓形虫感染与危重患者性别、年龄和患病类型无相关性(P>0.05);弓形虫IgG阳性患者血液标本中没有检测到弓形虫特异性DNA序列。结论:桂林地区危重患者弓形虫感染率较高,年龄、患病类型不是影响弓形虫感染的危险因素。

基于GIS技术的中国地区牛源弓形虫流行病学及空间分布特征研究

目的了解我国牛源弓形虫的流行现状及空间分布特征,以期为牛源弓形虫疾病监测和预防策略提供科学依据。方法检索中国知网、百度学术和PubMed数据库,搜集我国区域近40年(1985—2022年)的牛源弓形虫相关文献,应用地理信息系统(Geographical information systems,GIS)对我国牛源弓形虫的流行情况进行空间定位与表达。结果我国牛源弓形虫血清抗体总阳性率为11.08%(8139/73480,95%CI:10.96%~11.20%)。南方地区比北方地区的牛源弓形虫病问题严重,南方地区牛源弓形虫感染率为14.74%(4332/29383,95%CI:13.46%~16.02%),而北方地区感染率为9.23%(4294/46501,95%CI:8.97%~9.49%),但两者间无统计学差异(χ^(2)=27.964,P>0.05)。牛源弓形虫血清抗体阳性率较高的省份有浙江(27.64%,76/275,95%CI:22.34%~32.94%)、重庆(27.25%,94/345,95%CI:22.57%~31.93%)、西藏(21.97%,76/346,95%CI:22.57%~26.35%)和湖南(20.26%,487/2404,95%CI:12.93%~36.13%)。江西、湖北、香港地区、澳门地区和台湾地区尚未见对牛弓形虫病的流行病学调查。我国牛源弓形虫流行病学调查主要集中在青海、河南、云南、新疆和甘肃等省份,尤其青海地区,涉及的地级县市高达20个。我国牦牛弓形虫血清抗体总阳性率为16.27%(1469/9029,95%CI:15.51%~17.03%)。牦牛弓形虫阳性率较高的省份有四川(33.73%,85/252,95%CI:30.75%~36.71%),西藏(26.96%,62/230,95%CI:21.23%~32.67%)和甘肃(22.53%,639/2836,95%CI:21.00%~24.06%)。与1985—2004年采集的牛源和牦牛源弓形虫感染率相比,2005—2022年我国牛源和牦牛源弓形虫总感染率明显降低(χ^(2)=1393.914,P<0.05)。结论应用GIS技术可视化展现了我国牛源弓形虫的空间分布特征;牛源弓形虫在我国广泛传播,流行周期稳定,且不同地区间的弓形虫阳性率差异很大,应加强对牛源弓形虫感染的监测和防控。

弓形虫SAG1、ROP18真核表达载体的构建及在诱导小鼠保护性免疫中的作用研究

目的观察弓形虫速殖子表面抗原1(SAG1)、棒状体蛋白18(ROP18)真核表达载体单独及联合使用诱导BALB/c小鼠的保护性免疫作用。方法制备重组真核表达质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-SAG1,p3×FLAG-Myc-CMV TM-24-ROP18及空质粒p3×FLAG-Myc-CMV TM-24(空载体),以磷酸盐缓冲液(PBS)稀释至1μg/μL。将102只BALB/c小鼠随机分成6组,每组17只,前4组分别注射PBS(PBS对照组)、空载体(空载体对照组)、SAG1载体(SAG1组)、ROP18载体(ROP18组)各100μL,其余两组均注射SAG1与ROP18对半混合载体,分别注射量为200μL(全量混合组)、100μL(半量混合组),每组间隔2周免疫1次,共免疫3次。末次免疫4周后,各组随机取7只小鼠,无菌条件下取脾,流式细胞术检测小鼠脾脏CD4^(+)、CD8^(+)T细胞亚群分布,荧光定量PCR分析各组小鼠脾细胞中细胞因子白细胞介素(IL)-4、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)的表达;每组其余10只小鼠腹腔接种1×103个弓形虫速殖子,观察各组小鼠的生存时间。结果各组小鼠脾脏CD4^(+)T细胞比例差异无统计学意义(P>0.05);与PBS对照组比较,SAG1组、ROP18组、全量混合组、半量混合组、空载体对照组CD8^(+)T细胞比例明显升高(P<0.01),半量混合组较其他组更高(P<0.05)。半量混合组、全量混合组CD4^(+)/CD8^(+)较两对照组(PBS对照组和空载体对照组)降低,差异有统计学意义(P<0.05)。全量混合组、半量混合组小鼠脾细胞中IL-12、IFN-γ相对表达水平与两对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且半量混合组IFN-γ相对表达水平与ROP18组比较,差异有统计学意义(P<0.05),但各组间IL-4相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。弓形虫速殖子攻击感染小鼠试验中两单基因疫苗组(SAG1组和ROP18组)、全量混合组、半量混合组均较两对照组生存时间延长(P<0.05),且半量混合组较全量混合组生存时间也显著延长(P<0.01),但全量混合组与两单基因疫苗组差异无统计学意义(P>0.05)。结论弓形虫DNA重组载体能诱导BALB/c小鼠产生特异性细胞免疫应答及部分抗虫免疫保护作用,且构建的两种真核载体在合适浓度联合免疫能诱导小鼠产生更强的免疫保护作用。

我国弓形虫Chinese 1优势基因型感染对小鼠组织中微量金属元素代谢的影响

目的观察弓形虫Chinese 1优势基因型(ToxoDB#9)弱毒株TgCtwh6感染小鼠后,其体内微量金属元素的留存情况,探讨TgCtwh6感染对小鼠各组织金属元素代谢的影响。方法建立TgCtwh6感染小鼠急性期模型(急性期组)和慢性期模型(慢性期组),同时设置对照组,实验小鼠6只/组。运用电感耦合等离子体质谱仪检测不同组别小鼠心脏、肝脏、脾脏和肾脏内的Fe^(2+)、Cu^(2+)、Mn^(2+)、Zn^(2+)、Mg^(2+)等金属元素水平,Western blot检测不同组别小鼠肝脏内金属元素转运体ZIP 8(Zrt-and Irt-like protein 8)的蛋白表达,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性检测试剂盒检测SOD活性,对不同组别的检测结果进行统计分析。结果相对于对照组,急性期组和慢性期组小鼠肝脏内Fe^(2+)、Mn^(2+)和Zn^(2+)含量均上调[(76.348±11.613)μg/g和(88.545±10.555)μg/g vs.(52.388±6.165)μg/g;(1.298±0.065)μg/g和(1.405±0.066)μg/g vs.(1.141±0.110)μg/g;(17.506±0.824)μg/g和(17.031±0.907)μg/g vs.(15.650±0.305)μg/g];脾脏内Fe^(2+)、心脏内Cu^(2+)和Zn^(2+)含量均下调[(128.519±13.531)μg/g和(120.309±10.023)μg/g vs.(147.720±15.303)μg/g;(5.189±0.255)μg/g和(5.631±0.485)μg/g vs.(6.440±0.740)μg/g;(17.034±0.974)μg/g和(16.858±0.953)μg/g vs.(19.258±0.965)μg/g]。急性期组小鼠心脏内Mn^(2+)和Mg^(2+)含量均低于对照组[(0.605±0.052)μg/g vs.(0.686±0.051)μg/g;(153.346±3.221)μg/g vs.(163.012±8.204)μg/g]。与对照组相比,急性期组和慢性期组小鼠肝脏ZIP 8蛋白表达均上调,且慢性期组高于急性期组(F=35.240,P<0.05)。对照组、急性期组和慢性期组小鼠肝脏SOD活性分别为(14.041±0.734)U/mL、(16.463±0.616)U/mL和(15.859±0.780)U/mL,组间差异有统计学意义(F=9.370,P<0.05)。结论TgCtwh6急性和慢性感染状态下小鼠不同组织中部分微量金属元素含量会发生上调或者下调,同时出现ZIP 8表达上调激活SOD活性,从而发挥肝脏保护作用。

中国4个弓形虫虫株GRA6基因的比较分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的致密颗粒抗原(GRA6)基因进行PCR-RFLP分析,首次对中国弓形虫虫株进行了基因分型研究,旨在了解中国弓形虫基因型的分布情况,从而为进一步的分子遗传学研究以及弓形虫病的防制提供资料。PCR-RFLP分析显示两种带型:RH、SH、CN3株弓形虫为一种带型,QH和ZS2株弓形虫为另一种电泳带型。GRA6序列分析结果显示:RH、SH、CN3株弓形虫的GRA6基因序列上的MseΙ酶切位点与国外报道的RH株一致,同属于基因型Ι,为强毒株;QH和ZS2株弓形虫的MseΙ酶切位点与国外报道的弱毒株BEVERLEY株和ME49株一致,同属于基因型Ⅱ,与PCR-RFLP分析结果一致。除MseΙ酶切位点外,中国的几个虫株GRA6序列与GenBankTM注册的RH株及BEVERLEY和ME49两个弱毒株有个别碱基的差异。结果证明中国人源弓形虫包含了Ι、Ⅱ两种基因型,而动物源性弓形虫则因宿主和来源地不同亦有Ι、Ⅱ两个基因型。

不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠诱导的抗弓形虫感染作用

目的观察不同剂量可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)滴鼻免疫小鼠诱导抗弓形虫感染作用,确定STAg滴鼻免疫最佳剂量。方法BALB/c小鼠50只随机分为5组,实验组分别用5μg、10μg、20μg、30μg STAg/只滴鼻免疫小鼠2次,间隔2周,对照组用PBS滴鼻。末次免疫后第14d,用4×104个速殖子/只灌胃攻击全部小鼠,观察小鼠健康和死亡情况,记录体重。攻击后第30d检测粪便IgA和血清IgG,计数脾、脑组织内弓形虫速殖子,分离并计数小肠上皮内淋巴细胞(intraepithelial lymphocyte,IEL)。结果20μg和30μg组小鼠存活率高于5μg、10μg及对照组。攻虫后对照组小鼠体重逐渐降低,而5μg组,10μg组(P<0.05),20μg组(P<0.05)和30μg组(P<0.05)小鼠体重仍呈增高趋势。20μg和30μg组脾、脑组织内虫荷(速殖子数)显著低于5μg、10μg组和对照组(P<0.05),实验组粪便IgA,血清IgG及IEL数量高于对照组。结论不同剂量STAg滴鼻免疫小鼠均可诱导抗弓形虫感染。

弓形虫ITS及5.8S序列的PCR扩增、克隆及分析

通过对国内来源于不同宿主的ZS人株、SH人株、CN猪株、QH绵羊株4个弓形虫虫株,以及国际标准强毒株RH株的核糖体DNA内转录间隔区(ITS)及5 8SDNA序列进行PCR扩增、克隆、测序和序列分析,旨在对国内不同宿主间弓形虫虫株的遗传变异情况进行分析和验证,为分子遗传学和分子诊断学研究提供资料。结果显示:QH绵羊株、ZS人株、SH人株、CN猪株的ITS及5 8S序列完全一致,且与GenBank上注册RH株的ITS及5 8S序列也一致;仅实验室传代保存的RH株的ITS2序列与其它4株的ITS2有2个碱基的差异。结果表明ITS可作为分子标记用于弓形虫与其它原虫的种间鉴定,但不适合用于弓形虫种内遗传变异的研究。

弓形虫可溶性抗原联合γ干扰素鼻内免疫小鼠的抗弓形虫感染作用

目的探讨弓形虫可溶性抗原(STAg)和γ干扰素(IFN-γ)联合鼻内免疫对小鼠的保护作用及IFN-γ作为佐剂鼻内免疫抗弓形虫感染的最佳剂量.方法将5～6周龄BALB/c小鼠70只随机分为5组,每组14只,分别用20μg STAg、20μg STAg+250 U IFN-γ、20 μg STAg+500 UIFN-γ、20μg STAg+1 000 U IFN-γ和20μg STAg+2 000 U IFN-γ鼻内免疫小鼠2次,间隔14 d,末次免疫后第10天,用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,逐日观察小鼠健康存活情况.攻击后第29天处死全部小鼠,分离计数脑、肝组织速殖子;计数肠系膜淋巴结(MLN)和脾T淋巴细胞.结果随着佐剂IFN-γ剂量的增加,小鼠存活率有升高趋势,1 000 U IFN-γ剂量组小鼠存活率最高达93%;肝、脑速殖子数呈下降的趋势,其中STAg+1 000 U IFN-γ、STAg+2 000 UIFN-γ组显著低于STAg组;MLN和脾T淋巴细胞发生了增殖性应答,其中STAg+1 000 UIFN-γ、STAg+2 000 U IFN-γ组MLN细胞显著高于STAg组.结论STAg+1 000 U IFN-γ、STAg+2 000 U IFN-γ鼻内免疫明显优于其它小剂量佐剂及单独抗原免疫,能有效诱导黏膜免疫应答.

TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠诱导的弓形虫IgA抗体特异性免疫应答

目的研究速殖子超声裂解物(TSo)和IFN-γ鼻内免疫小鼠经口感染弓形虫速殖子后,血清、小肠液和粪便IgA抗体分泌的动态变化。方法将6～7周龄BALB/c小鼠100只随机分为4组,每组25只,分别用10μl缓冲液PBS、20μgTSo、500UIFN-γ和20μgTSo+500UIFN-γ鼻内免疫小鼠。用RH株弓形虫速殖子4×104个/只灌胃攻击,分别于攻击后第7、10、13、16、19天处死小鼠,收集血清、小肠液及粪便,ELISA法测定IgA含量。结果各组血清IgA抗体水平在攻击后第10天达到峰值,TSo+IFN-γ组血清IgA抗体含量高于其他各组。小肠液和粪便IgA抗体含量在攻击后第13天达到峰值,在实验期各时点TSo+IFN-γ组小肠液和粪便IgA抗体含量高于其他组。小肠液与粪便IgA抗体水平呈正相关。结论TSo或IFN-γ或TSo联合IFN-γ鼻内免疫小鼠可诱导黏膜免疫,产生高水平的弓形虫特异性IgA抗体。TSo联合IFN-γ鼻内免疫优于单独免疫,免疫小鼠肠道产生大量SIgA,发挥抗虫作用。鼻黏膜免疫是一种安全有效的免疫接种途径。

弓形虫ROP2核酸疫苗免疫保护作用的研究

目的研究ROP2核酸疫苗对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法42只BALB/c小鼠随机分为3组:实验组、空质粒组和PBS对照组,各组小鼠分别肌注pc-DNA3-ROP2重组质粒50μg、pc-DNA3空质粒50μg和PBS50μl,共免疫3次,每次间隔3周,末次接种量均加倍。末次免疫后2周,各组分别取4只小鼠的血清、脾和淋巴组织,检测CD4+、CD8+及各细胞因子。其余各组每鼠腹腔攻击感染RH株弓形虫速殖子500个,观察其存活时间等。结果ROP2核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体滴度高并能识别由基因重组体外诱导表达的ROP2蛋白抗原;实验组小鼠的CD4+T细胞增殖明显(69.5±3.4)%、CD4+/CD8+比值显著升高(4.69±1.32)%(P<0.01);其脾、淋巴结细胞培养液及血清中白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)均有不同程度的升高,尤其是血清中升高最为显著。弓形虫攻击感染180h后,实验组小鼠免疫保护率为88.9%,与对照组相比,小鼠存活时间明显延长、初始死亡时间明显推迟(P<0.01)。结论ROP2核酸疫苗具有较强的免疫原性,能产生良好的免疫保护作用。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒免疫小鼠后的免疫应答

目的： 用构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒， 直接免疫小鼠， 观察其所诱导的细胞及体液免疫反应。方法： 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒， 经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ 小鼠， 每鼠注射１００ μｇ，２ ｗ ｋ 后同量加强免疫１ 次， 以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后３０ ｄ、５０ ｄ、７０ ｄ 共３ 次用ＭＴＴ 法测定小鼠脾脏Ｔ 淋巴细胞增殖活性及ＮＫ 细胞活性； 用间接免疫荧光抗体法测定Ｔ淋巴细胞亚群数目；ＥＬＩＳＡ 法测定ＩｇＧ 抗体滴度。结果： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒免疫小鼠３０ ｄ 后， 脾脏明显增大； 免疫组脾淋巴细胞增殖活性明显高于生理盐水及空质粒对照组。ＮＫ 细胞杀伤活性３ 次的测定结果免疫组均高于对照组。Ｔ 细胞亚群， ＣＤ４＋ 细胞数与对照组相比较无明显变化， 而ＣＤ８＋ 细胞数显著增高。血清抗体ＩｇＧ７０ ｄ 内检测结果， 与对照组相比较， 无明显增高； 而免疫后９０ ｄ 检测明显增高， 抗体滴度１∶１００。结论： 用ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 重组质粒ＤＮＡ免疫小鼠， 可诱导产生细胞及体液免疫应答。